楊彩梅，束 軍，鄭江霞，沈繼龍

2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)顯示，新發(fā)的肺癌病例數(shù)約220萬，死亡病例數(shù)約179萬[1]，較2018年的數(shù)據(jù)有增無減[2]。鐵冬青酸(Rotundic acid，RA)存在于鐵冬青、毛冬青等植物的種子、樹皮和樹葉中，是一種天然的五環(huán)三萜化合物。研究表明，RA具有抗炎[3]、降低低密度脂蛋白和膽固醇[4]、改善腸道菌群[5-6]等作用。Wang et al[7]研究表明RA可以誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的凋亡；Roy et al[8]研究表明RA可以抑制肝癌HepG2細(xì)胞的遷移、侵襲并誘導(dǎo)其凋亡；Feng et al[9]研究表明RA可以抑制結(jié)直腸癌Caco2細(xì)胞的增殖，但是RA對人肺腺癌細(xì)胞的作用研究尚罕見報(bào)道。該研究主要觀察RA對人肺腺癌A549和PC9細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響,初步探討RA作為抗癌新藥的潛能和可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料人肺腺癌A549、PC9細(xì)胞購于廣州賽業(yè)生物科技有限公司；RA (DST201201-037) 購于樂美天醫(yī)藥科技有限公司，20 mg/支，純度≥99%；DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購于賽默飛生物化學(xué)制品有限公司；胰酶細(xì)胞消化液購于新賽美生物科技有限公司；CCK-8試劑盒、RIPA裂解液購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；酪氨酸蛋白激酶2 (janus kinase 2，JAK2) 酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)試劑盒、轉(zhuǎn)錄激活蛋白3 (signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)ELISA試劑盒購于上海源桔生物科技中心；Transwell小室購于美國康寧公司；移液器購于北京博儀恒業(yè)科技發(fā)展有限公司；酶標(biāo)儀購于瑞士帝肯公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將人肺腺癌A549、PC9細(xì)胞分別置于37 ℃、含有5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。用含有10%胎牛血清、1%抗生素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細(xì)胞；用含有10%胎牛血清、1%抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)PC9細(xì)胞。肺腺癌細(xì)胞呈貼壁方式生長，視細(xì)胞生長狀態(tài)進(jìn)行換液、傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2藥物配制及實(shí)驗(yàn)分組 使用DMSO作為溶劑，將RA溶于其中并配制成100 μmol/L的母液，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)分為細(xì)胞對照組(無RA、無DMSO)、空白對照組(僅含培養(yǎng)基)和實(shí)驗(yàn)組(分別含20、40、60、80 μmol/L RA)，CCK-8實(shí)驗(yàn)增加溶劑組(含0.1%DMSO)。

1.2.3CCK-8法檢測不同濃度RA對于A549和PC9細(xì)胞增殖能力的影響 取對數(shù)生長期的人肺腺癌A549和PC9細(xì)胞，制備成合適密度的細(xì)胞懸液，取細(xì)胞懸液進(jìn)行96孔板鋪板，分為細(xì)胞對照組、溶劑對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。向每組復(fù)孔中加入100 μl細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，向細(xì)胞對照組中加入100 μl培養(yǎng)基，溶劑組加入含0.1% DMSO的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組每孔各加入100 μl不同濃度(20、40、60、80 μmol/L) 的RA 溶液。培養(yǎng)24 h后向每孔加入10 μl CCK-8試劑，放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1～4 h，調(diào)節(jié)酶標(biāo)儀波長為450 nm進(jìn)行吸光度(A)值檢測。根據(jù)A值計(jì)算各組細(xì)胞活力，細(xì)胞活力= (實(shí)驗(yàn)組A值-空白對照組A值)/(細(xì)胞對照組A值-空白對照組A值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度RA對于A549和PC9細(xì)胞水平遷移能力的影響 在6孔板背面用馬克筆均勻劃6條互相平行的直線，確保每個(gè)孔中有3根直線通過。取對數(shù)生長期的人肺腺癌A549和PC9細(xì)胞，制備成合適密度的細(xì)胞懸液，向每孔中加入2 ml細(xì)胞懸液。將6孔板放入培養(yǎng)箱中，在細(xì)胞匯合度達(dá)到95%時(shí)，用200 μl槍頭垂于橫線劃痕，用PBS清洗后在顯微鏡下拍照即為0 h劃痕寬度。實(shí)驗(yàn)組分別加入2 ml不同濃度RA的無血清培養(yǎng)基，對照組加入2 ml無血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后用PBS清洗6孔板并在同一位置拍照，即為24 h劃痕寬度。用ImageJ軟件分析細(xì)胞遷移面積，細(xì)胞遷移率=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/ 0 h劃痕面積×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5Transwell遷移實(shí)驗(yàn)觀察RA對A549和PC9細(xì)胞縱向遷移能力的影響 取對數(shù)生長期的人肺腺癌A549和PC9細(xì)胞，用含不同濃度RA的無血清培養(yǎng)基調(diào)整為合適的細(xì)胞密度，每個(gè)濃度組取200 μl加入到Transwell上室中，下室中加入750 μl血清濃度為20%的培養(yǎng)基。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞及基質(zhì)膠，下室用甲醛固定30 min，再用結(jié)晶紫染色20 min。在200倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察RA對A549和PC9細(xì)胞侵襲能力的影響 按1 ∶8的比例稀釋Matrigel基質(zhì)膠,每個(gè)小室用60 μl基質(zhì)膠包被，放進(jìn)培養(yǎng)箱過夜。其余步驟同1.2.5項(xiàng)。

1.2.7ELISA實(shí)驗(yàn)觀察RA對A549和PC9細(xì)胞上清液中JAK2和STAT3蛋白表達(dá)量的影響 用不同濃度RA培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h，吸取上清液，根據(jù)JAK2和STAT3測定試劑盒說明書進(jìn)行處理，調(diào)節(jié)酶標(biāo)儀波長至450 nm檢測A值，計(jì)算JAK2、STAT3蛋白表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8RT-PCR實(shí)驗(yàn)觀察RA對A549和PC9細(xì)胞中JAK2和STAT3 mRNA表達(dá)水平的影響 取對數(shù)生長期的人肺腺癌A549和PC9細(xì)胞，調(diào)整為合適的細(xì)胞密度，進(jìn)行6孔板鋪板。用含不同濃度RA的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。用TRIzol提取細(xì)胞中的RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄定量PCR儀及SYBR Green試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。內(nèi)參GAPDH的上游引物 : 5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′,下游引物 :5′- GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′；JAK2的上游引物:5′-GCGTTGAGAAGACGGTGTG-3′,下游引物:5′-CTGTTGCCTGCTTCTGAAACC-3′；STAT3的上游引物5′- 3′:CAGTATAGCCGCTTCCTGCAA,下游引物:5′-CACAATCCGGGCAATCTCC-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理拍攝照片后用Image J 1.52軟件對細(xì)胞的遷移面積進(jìn)行計(jì)算，對穿過聚碳酸酯膜細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)；用SPSS 17.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，以判斷各組間的差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；用Graph pad Prism 8.0軟件整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并作圖。計(jì)量資料用表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RA對A549和PC9細(xì)胞增殖能力的影響CCK-8法檢測結(jié)果顯示，與細(xì)胞對照組相比，RA濃度越高，A549細(xì)胞和PC9細(xì)胞的細(xì)胞活力越低；表明RA抑制了各組A549和PC9細(xì)胞的增殖，而且RA的濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，溶劑對照組與細(xì)胞對照組之間的細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以排除溶劑對細(xì)胞增殖的抑制作用。細(xì)胞對照組與20 μmol/L實(shí)驗(yàn)組之間，20 μmol/L與40 μmol/L實(shí)驗(yàn)組之間細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，細(xì)胞對照組與其它實(shí)驗(yàn)組之間的細(xì)胞活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=103.1,P<0.05)。在PC9細(xì)胞中，溶劑對照組與細(xì)胞對照組之間的細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，細(xì)胞對照組與20、40 μmol/L實(shí)驗(yàn)組之間的細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其它實(shí)驗(yàn)組與細(xì)胞對照組之間的細(xì)胞活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=121.8,P<0.05)。見圖1。

圖1 RA對A549和PC9細(xì)胞增殖能力的影響與0 μmol/L RA組比較:*P<0.05, **P<0.01

2.2 RA對A549和PC9細(xì)胞水平遷移能力的影響劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著RA作用的時(shí)間增加，人肺腺癌A549細(xì)胞和PC9細(xì)胞的遷移面積也隨之增加。其中細(xì)胞對照組向劃痕的空白處遷移的面積最大，A549細(xì)胞對照組水平遷移率約為60%，PC9細(xì)胞對照組水平遷移率約為57%，各組RA作用濃度越高，A549和PC9細(xì)胞遷移的面積越小，濃度為80 μmol/L的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞基本未發(fā)生遷移，A549細(xì)胞 80 μmol/L的水平遷移率僅約4%，PC9細(xì)胞80 μmol/L的水平遷移率約12%。綜上提示，RA對A549和PC9細(xì)胞的水平遷移有一定的抑制作用。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，各實(shí)驗(yàn)組與細(xì)胞對照組之間的劃痕愈合率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(A549:F=145.5,P<0.05；PC9:F=157.2,P<0.05) 。見圖2～4。

圖2 不同濃度RA對于A549細(xì)胞水平遷移能力的影響 ×200

圖3 不同濃度RA對于PC9細(xì)胞水平遷移能力的影響 ×200

圖4 不同濃度RA對于A549和PC9細(xì)胞水平遷移率的影響與0 μmol/L RA組比較:*P<0.05, **P<0.01

2.3 RA對于A549和PC9細(xì)胞縱向遷移能力的影響通過對各組Transwell遷移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果拍攝照片，并用Image軟件對各組細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示，細(xì)胞對照組視野充滿了細(xì)胞，而實(shí)驗(yàn)組RA濃度越高，穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)量越少。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)量在實(shí)驗(yàn)組與對照組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(A549:F=610.9,P<0.05；PC9:F=317.1,P<0.05)，表明RA對A549和PC9細(xì)胞的縱向遷移有一定的抑制作用。見圖5、6。

圖5 不同濃度RA對A549和PC9細(xì)胞縱向遷移能力的影響 結(jié)晶紫染色 ×200

圖6 不同濃度RA對A549和PC9細(xì)胞縱向遷移抑制率的影響與0 μmol/L RA組比較:*P<0.05, **P<0.01

2.4 RA對于A549和PC9細(xì)胞侵襲能力的影響結(jié)果顯示，RA濃度越高，穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量越少，表現(xiàn)為一定的濃度依賴性。通過對穿過基質(zhì)膠的A549和PC9細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)與分析表明，經(jīng)過RA處理之后，上述兩種細(xì)胞的侵襲能力均被抑制，RA濃度越高，其對A549和PC9細(xì)胞侵襲能力的抑制作用越強(qiáng)。在A549細(xì)胞中，細(xì)胞對照組與20 μmol/L和40 μmol/L實(shí)驗(yàn)組之間的穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，細(xì)胞對照組與60 μmol/L和80 μmol/L實(shí)驗(yàn)組之間的穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=320.3，P<0.05)。在PC9細(xì)胞中，細(xì)胞對照組與20 μmol/L實(shí)驗(yàn)組之間的穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，細(xì)胞對照組與其它實(shí)驗(yàn)組之間的穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F= 246.1,P<0.05)。見圖7、8。

圖7 RA對于A549和PC9細(xì)胞侵襲能力的影響 結(jié)晶紫染色 ×200

圖8 RA對于A549和PC9細(xì)胞侵襲能力的影響與0 μmol/L RA組比較:*P<0.05, **P<0.01

2.5 RA對A549和PC9細(xì)胞中JAK2和STAT3蛋白表達(dá)的影響研究結(jié)果顯示，RA濃度越高，細(xì)胞上清液中JAK2和STAT3蛋白表達(dá)量越低，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。在A549細(xì)胞的上清液中，細(xì)胞對照組與20 μmol/L實(shí)驗(yàn)組之間的JAK2和STAT3蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，細(xì)胞對照組與其它實(shí)驗(yàn)組之間的JAK2、STAT3蛋白表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (JAK2：F=21.29，P<0.05；STAT3：F=22.16，P<0.05) ；各RA濃度相鄰的實(shí)驗(yàn)組之間JAK2和STAT3蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在PC9細(xì)胞的上清液中，細(xì)胞對照組與20 μmol/L的實(shí)驗(yàn)組之間JAK2蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，細(xì)胞對照組與其它實(shí)驗(yàn)組之間的JAK2蛋白表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(JAK2：F=22.73，P<0.05)；細(xì)胞對照組上清液中的STAT3蛋白表達(dá)量與實(shí)驗(yàn)組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(STAT3：F=21.08，P<0.05)。見表1和圖9、10。

圖9 不同濃度RA對于A549細(xì)胞上清液中JAK2和STAT3含量的影響與0 μmol/L RA組比較:*P<0.05

圖10 不同濃度RA對于PC9細(xì)胞上清液中JAK2和STAT3含量的影響與0 μmol/L RA組比較:*P<0.05

表1 不同濃度RA對人肺腺癌A549和PC9細(xì)胞上清液中JAK2和STAT3蛋白表達(dá)量的影響

2.6 RA對A549和PC9細(xì)胞中JAK2和STAT3 mRNA表達(dá)水平的影響RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，作用于A549細(xì)胞的RA濃度越高，表達(dá)的JAK2和STAT3 mRNA水平越低，細(xì)胞對照組與20 μmol/L實(shí)驗(yàn)組、20 μmol/L實(shí)驗(yàn)組與40 μmol/L實(shí)驗(yàn)組之間JAK2的mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，細(xì)胞對照組與20 μmol/L實(shí)驗(yàn)組、60 μmol/L實(shí)驗(yàn)組與80 μmol/L實(shí)驗(yàn)組之間STAT3 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其它各組之間JAK2和STAT3 mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (JAK2:F=40.44,P<0.05; STAT3:F=32.04,P<0.05)。在PC9細(xì)胞中，細(xì)胞對照組與20 μmol/L實(shí)驗(yàn)組之間JAK2 的mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，細(xì)胞對照組與20 μmol/L實(shí)驗(yàn)組、60 μmol/L實(shí)驗(yàn)組與80 μmol/L實(shí)驗(yàn)組之間STAT3的mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，除此之外各組之間的JAK2和STAT3 mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (JAK2:F=117.9,P<0.05; STAT3:F=129.0,P<0.05)。見圖11、12。

圖11 RA對于A549細(xì)胞JAK2和STAT3 mRNA表達(dá)水平的影響與0 μmol/L RA組比較:*P<0.05, **P<0.01

圖12 RA對于PC9細(xì)胞JAK2和STAT3 mRNA表達(dá)水平的影響與0 μmol/L RA組比較:*P<0.05, **P<0.01

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)[10]報(bào)道，RA可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)p53過表達(dá)、阻滯細(xì)胞周期、抑制DNA的合成及干擾相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等多種機(jī)制來抑制腫瘤細(xì)胞的生長并促進(jìn)其凋亡。但是RA對人肺腺癌細(xì)胞作用的報(bào)道罕見。該研究結(jié)果表明RA對人肺腺癌A549細(xì)胞和PC9細(xì)胞的增殖、水平遷移、縱向遷移和侵襲的能力具有一定的抑制作用，而且隨著RA作用濃度的增加，RA對A549細(xì)胞和PC9細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的抑制作用也越強(qiáng)，即具有一定的濃度依賴性。這一特點(diǎn)與RA對結(jié)直腸腺癌、乳腺癌、肝癌等腫瘤細(xì)胞的抑制作用相吻合。

免疫治療給患者帶來的生存益處很多，但是對免疫藥物敏感而能夠從中受益的人群有限，且肺癌細(xì)胞易對免疫藥物產(chǎn)生耐藥性，開發(fā)新的有效的抗腫瘤藥物十分必要，中藥提取物在腫瘤治療方面的研究逐漸增多。研究[11]顯示苦參的活性成分槐果堿，具有抑制腫瘤增殖、遷移和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等功能。

生物體內(nèi)包含了很多從細(xì)胞膜到細(xì)胞核的有效信號傳導(dǎo)途徑。但是其中的JAK/STAT通路是結(jié)構(gòu)上最簡單的范例之一，通過該通路可以實(shí)現(xiàn)跨膜受體到細(xì)胞核的直接通信。JAK在上游細(xì)胞因子等的作用之下可以激活自身的磷酸化，也可以活化下游的STATs，STATs繼而直接結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的DNA并參與基因表達(dá)的調(diào)控。JAK2/STAT3信號通路在各種癌癥發(fā)生和發(fā)展階段中起著至關(guān)重要的作用，并且活性JAK2和STAT3通常與更差的預(yù)后相關(guān)[12]。本研究中未用Western blot對JAK2和STAT3進(jìn)行檢測，進(jìn)一步研究可考慮選用以檢測JAK2和STAT3的磷酸化活性水平。

綜上，RA在體外實(shí)驗(yàn)中對于人肺腺癌A549和PC9細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均具有抑制作用，且呈一定的濃度依賴性。其作用機(jī)制可能與細(xì)胞JAK2/STAT3通路的負(fù)向調(diào)控有關(guān)。