徐倩倩，張沛譽，陳 妮

據(jù)最新的全球癌癥統(tǒng)計報告，肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，僅2020年就有新增肺癌病例220萬例(占總病例的11.6%)，死亡180萬例，占人類所有癌癥死亡人數(shù)的近五分之一，肺癌的低治愈率是當(dāng)前面臨的重大難題[1]。據(jù)研究腫瘤細(xì)胞對博萊霉素(bleomycin，BLM)耐藥性的產(chǎn)生是導(dǎo)致治療失敗的重要原因[2-4]，腫瘤細(xì)胞對BLM的耐藥主要表現(xiàn)在DNA損傷修復(fù)能力的增加。BLM被發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞株G2/M期阻滯[5]，而這可能與細(xì)胞在G2/M檢查點對DNA損傷的應(yīng)答有關(guān)。另有研究表明，在BLM作用下腫瘤細(xì)胞內(nèi)的抗氧化水平升高[6]，這也可能是細(xì)胞產(chǎn)生抗性的另一大因素。

核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid related factor 2,Nrf2)是抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在許多腫瘤中發(fā)現(xiàn)Nrf2通路的過度活化與腫瘤治療過程中的放化療抵抗有關(guān)[7]。目前Nrf2在放化療抵抗中的相關(guān)研究主要聚焦在氧化應(yīng)激方面，而在參與DNA損傷應(yīng)答方面的研究仍較少。該研究中，以人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299為對象，探究抗氧化轉(zhuǎn)錄因子Nrf2對BLM誘導(dǎo)的DNA損傷水平及DNA損傷修復(fù)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料BLM、白藜蘆醇(resveratrol，Res)、N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine，NAC)均購自美國Sigma-Aldrich公司；NRF2慢病毒顆粒、聚凝胺溶液(polybrene)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基均購自上海吉瑪基因公司；細(xì)胞松弛素B(cytochalasins B，CB)、吖啶橙粉末、嘌呤霉素(puromycin)購自廣州索萊寶生物科技有限公司；其他實驗室常規(guī)試劑均購自國藥集團。γ-H2AX兔單克隆抗體、Nrf2兔單克隆抗體購自美國CST公司；Rad51單克隆抗體購自英國Abcam公司；β-actin兔單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；LaminB單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。四季青胎牛血清購自湖州市天杭生物科技股份有限公司；細(xì)胞胰酶消化液、青鏈霉素溶液均來自上海碧云天生物科技有限公司。免疫共沉淀試劑盒購自美國Thermo公司；DCFH-DA試劑盒、細(xì)胞核蛋白提取試劑盒、細(xì)胞胰酶消化液、青霉素-鏈霉素雙抗均來自上海碧云天生物科技有限公司；全自動凝膠成像系統(tǒng)GenoSens S2 system購自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)人肺癌細(xì)胞株A549和H1299購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，由實驗室傳代保種；利用質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建Nrf2敲低的細(xì)胞株(si-Nrf2)及其對照細(xì)胞株(si-NC)；利用慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建Nrf2敲低的細(xì)胞株(sh-Nrf2)及其對照細(xì)胞株(sh-NC)。用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。在細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞量較少時(小于30%)，隔天換液。細(xì)胞轉(zhuǎn)染時采用不含血清和雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 活性氧(reactive oxygen species，ROS) 檢測將處于對數(shù)期的細(xì)胞用胰酶消化計數(shù)，種25萬細(xì)胞到每個皿中，分為對照組、 BLM 組、NAC組及NAC+BLM 組。待細(xì)胞貼壁后，首先用1 mmol/L NAC處理NAC組及NAC+BLM 組30 min，然后再用5 μg/ml BLM處理BLM 組和NAC+BLM 組1 h。細(xì)胞完成培養(yǎng)后棄培養(yǎng)基，待反應(yīng)完成后，用滅菌PBS輕柔洗滌3次后用錫箔紙包裹完全避光，放置倒置熒光顯微鏡下調(diào)整合適視野并觀察熒光強度。使用ZEN.2011數(shù)字成像軟件拍攝，各組隨機選取5個視野進(jìn)行熒光統(tǒng)計。使用軟件Image J 進(jìn)行分析處理，IBM SPSS Statistics 20統(tǒng)計分析熒光強度，使用GraphPad Prism 8繪制熒光強度分析統(tǒng)計圖。

1.4 免疫印跡進(jìn)行蛋白表達(dá)的檢測將生長至對數(shù)期的對照組、BLM組、NAC+BLM組、Res+BLM組的A549和H1299正常細(xì)胞，質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染A549和H1299細(xì)胞組：對照組、si-NC+BLM組、si-Nrf2+BLM組，慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞組：sh-NC組、sh-NC+BLM組、sh-Nrf2組、sh-Nrf2+BLM組進(jìn)行提取蛋白操作；細(xì)胞長滿后用蛋白裂解液進(jìn)行裂解，并收集全細(xì)胞蛋白用BCA蛋白測定試劑盒進(jìn)行蛋白定量，上樣后于SDS-PAGE上進(jìn)行蛋白條帶的分離，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加入β-actin、Nrf2、γ-H2AX、Rad51(1 ∶1 000)抗體，4 ℃孵育過夜。經(jīng)過3次洗膜，再加入相應(yīng)的二抗(1 ∶2 000)，洗膜3次后最后用凝膠成像儀獲取蛋白條帶。蛋白條帶灰度值采用Image J軟件分析，以β-actin為內(nèi)參，目的蛋白條帶的灰度值進(jìn)行歸一化處理。

1.5 微核形成實驗將正常A549和H1299細(xì)胞分為對照組、BLM組及Res+BLM 組，質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染的A549和H1299細(xì)胞分為對照組和BLM組，細(xì)胞最佳狀態(tài)進(jìn)行實驗，吸去含有BLM、Res的細(xì)胞培養(yǎng)基，加入新鮮完全培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中1 h待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后，計數(shù)后取含10 000～20 000個細(xì)胞的細(xì)胞懸液加入6孔板中(每組設(shè)3個復(fù)孔)，待細(xì)胞貼壁后加入終濃度2.5 μg/ml的CB，繼續(xù)培養(yǎng)2個細(xì)胞周期(32～36 h)后固定、染色，使用Partical Count3-2軟件計數(shù)每1 000個雙核細(xì)胞數(shù)中的微核細(xì)胞數(shù)。使用IBM SPSS Statistics 20統(tǒng)計分析，使用GraphPad Prism 8繪制微核數(shù)統(tǒng)計圖。

1.6細(xì)胞轉(zhuǎn)染① siRNA瞬時轉(zhuǎn)染siRNA步驟按照轉(zhuǎn)染要求進(jìn)行，按照質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑1 ∶5的比例，對生長對數(shù)期細(xì)胞處于50%左右匯合度時進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作，通過熒光可初步鑒定轉(zhuǎn)染效率。②shRNA構(gòu)建Nrf2低表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株，根據(jù)預(yù)實驗獲知轉(zhuǎn)染的病毒原液與培養(yǎng)基比例為1 ∶50，對生長對數(shù)期細(xì)胞處于50%左右匯合度時進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染操作，按照試劑說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染 24～48 h后鏡下觀察狀態(tài)，吸去病毒感染液，加入培養(yǎng)基(未加雙抗)繼續(xù)培養(yǎng)；待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后，開始向培養(yǎng)基(加雙抗和血清)中加入終濃度為1.5 μg/ml的嘌呤霉素篩選獲得Nrf2低表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。

1.7 免疫共沉淀取生長狀態(tài)好的A549慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞, 進(jìn)行BLM處理后，按照免疫共沉淀試劑盒操作，先行弱裂解液裂解，離心取上清液，新制備的裂解液在4 ℃下與蛋白A/G瓊脂糖珠孵育30～60 min進(jìn)行預(yù)清洗。含有蛋白質(zhì)復(fù)合物的上清液被分離與抗Nrf2單抗或抗Rad51單抗一起孵育4 ℃過夜，然后加入Protein A/G瓊脂糖凝珠，4 ℃置于搖床溫和搖動4 h后，離心并用PBS洗滌分離的瓊脂糖凝珠，通過Western blot進(jìn)行蛋白條帶的分離，并使用抗Nrf2或Rad51抗體進(jìn)行蛋白分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS 24.0軟件進(jìn)行分析，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗。各組實驗重復(fù)3次以上，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞內(nèi)Nrf2在BLM作用下的活化DCFH-DA檢測顯示，BLM組與對照組相比細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS的熒光強度明顯上升(P<0.01)；NAC組與對照組相比細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS熒光強度略有下降(P<0.05)；NAC+BLM組與BLM組相比細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS熒光強度下降顯著(P<0.01)，見圖1A。本研究首先觀察了在NAC和BLM作用下Nrf2在A549和H1299細(xì)胞核內(nèi)的蛋白表達(dá)變化，Western blot結(jié)果表明，BLM刺激后核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，NAC的加入能有效抑制(P<0.01)Nrf2的核內(nèi)累積，見圖1B。以上結(jié)果表明，BLM引起的氧化應(yīng)激能夠使細(xì)胞內(nèi)的Nrf2產(chǎn)生功能活化。

圖1 細(xì)胞內(nèi)Nrf2在BLM作用下的活化A：5 μg/ml BLM作用后A549和H1299肺癌細(xì)胞內(nèi)ROS的熒光活性 ×200；B：抗氧化轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在A549和H1299肺癌細(xì)胞核內(nèi)的蛋白表達(dá)；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與BLM組比較:##P<0.01；與NAC組比較：&&P<0.01

2.2 刺激Nrf2的表達(dá)降低BLM誘導(dǎo)的細(xì)胞DNA損傷程度Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，BLM組細(xì)胞Nrf2蛋白的表達(dá)上調(diào)(P<0.01)；與BLM組相比，Res+BLM組細(xì)胞Nrf2的蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.01)。γ-H2AX蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，與對照組相比，BLM組細(xì)胞γ-H2AX蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.01)，然而Res+BLM組的γ-H2AX蛋白表達(dá)水平比BLM組下調(diào)(P<0.01)，見圖2A。微核結(jié)果顯示， 與對照組相比，BLM組細(xì)胞微核率升高(P<0.01)；與BLM組相比，Res+BLM組微核率下降(P<0.01)，其中A549細(xì)胞微核發(fā)生率下降10%，而H1299細(xì)胞微核發(fā)生率下降了40%左右。見圖2 B。兩種實驗結(jié)果均顯示，Nrf2的表達(dá)上調(diào)可以降低BLM誘導(dǎo)的細(xì)胞DNA損傷。

圖2 刺激Nrf2的表達(dá)降低BLM引起的細(xì)胞DNA損傷A：10 μmol/L Res作用24 h 后經(jīng)5 μg/ml BLM處理，抗氧化轉(zhuǎn)錄因子Nrf2和DNA損傷標(biāo)志蛋白γ-H2AX在 A549和H1299肺癌細(xì)胞內(nèi)的蛋白表達(dá)；B：10 μmol/L Res作用24 h后經(jīng)5 μg/ml BLM處理，A549和H1299肺癌細(xì)胞的微核形成率 ×200；與對照組比較：**P<0.01；與BLM組比較:#P<0.05，##P<0.01

2.3 抑制Nrf2的表達(dá)增強BLM對腫瘤細(xì)胞DNA的損傷siRNA對Nrf2的表達(dá)進(jìn)行干擾實驗顯示，與對照組相比，BLM能夠引起si-NC組細(xì)胞的Nrf2表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，但BLM不能引起si-Nrf2細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)上調(diào)。與si-NC+BLM組相比，si-Nrf2+BLM組細(xì)胞的γ-H2AX蛋白水平的表達(dá)有了進(jìn)一步的增強(P<0.01)，見圖3A。微核試驗結(jié)果顯示，在si-NC細(xì)胞中，BLM處理組細(xì)胞微核率高于對照組(P<0.01)；si-Nrf2細(xì)胞的BLM組相較于si-NC細(xì)胞BLM組的細(xì)胞微核率有了更為顯著的上升(P<0.05)，見圖3B。

圖3 干擾Nrf2的表達(dá)增強BLM引起的細(xì)胞DNA損傷A：5 μg/ml BLM作用后A549和H1299肺癌細(xì)胞內(nèi)Nrf2和γ-H2AX的蛋白表達(dá)；B：10 μmol/L Res作用24 h 后經(jīng)5 μg/ml BLM處理，A549和H1299肺癌的細(xì)胞微核形成情況 ×200；a：si-NC細(xì)胞；b：si-Nrf2細(xì)胞；與對照組比較：**P<0.01；與si-NC+BLM組比較：##P<0.01；與si-NC細(xì)胞的BLM 組比較：&P<0.05

2.4 Nrf2與Rad51相互作用對BLM引起的細(xì)胞DNA損傷的影響實驗中構(gòu)建了Nrf2低表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。Western blot 結(jié)果顯示，與sh-NC 組比較，sh-NC+Res組的細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.01)；與sh-Nrf2 組比較，sh-Nrf2+Res組的細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.01)，見圖4A。 Western blot實驗顯示，在sh-Nrf2細(xì)胞中，Rad51表達(dá)隨著Nrf2表達(dá)的抑制而同步下調(diào)(P<0.01)，見圖4B。免疫共沉淀實驗的Western blot結(jié)果顯示，Nrf2與Rad51存在相互作用：A549細(xì)胞經(jīng)過BLM處理后，用IP抗體為Nrf2蛋白時，Western blot結(jié)果可以檢測到Rad51蛋白的表達(dá)；同樣在IP抗體為Rad51蛋白時，在最終Western blot實驗中可以檢測到Nrf2蛋白的表達(dá)。在BLM作用下，細(xì)胞內(nèi)蛋白Nrf2通過與蛋白Rad51相互作用調(diào)控Rad51的表達(dá)，見圖4C。

圖4 Nrf2與Rad51相互作用降低BLM引起的細(xì)胞DNA損傷A：10 μmol/L Res 作用后A549肺癌細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白的表達(dá)；B：A549肺癌細(xì)胞內(nèi)Nrf2和Rad51蛋白的表達(dá)；C：免疫共沉淀；a：sh-NC 組；b：sh-NC+Res 組；c：sh-Nrf2 組；d：sh-Nrf2+Res 組；與sh-NC組比較：**P<0.01；與sh-Nrf2組比較：##P<0.01

3 討論

BLM是一種具有糖肽結(jié)構(gòu)的抗癌藥物，因不產(chǎn)生骨髓抑制，在臨床上廣泛應(yīng)用于生殖細(xì)胞癌、淋巴癌、肺癌的治療。BLM主要通過誘導(dǎo)DSBs促使腫瘤細(xì)胞凋亡而達(dá)到治療療效。γ-H2AX對DSBs快速敏感的反應(yīng)使其被認(rèn)為是DSBs早期檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。在DSB發(fā)生后，組蛋白H2AX第139位絲氨酸被磷酸化而富集到DNA斷裂處，傳導(dǎo)損傷修復(fù)信號，招募DNA損傷修復(fù)蛋白如BRCA1、Rad51、Rad50等對損傷處進(jìn)行修復(fù)。故對腫瘤細(xì)胞在BLM作用后細(xì)胞內(nèi)DNA的損傷及其修復(fù)機制進(jìn)行探究有助于揭示腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生機制。

BLM對細(xì)胞損傷方式與輻射類似，BLM可作用于腫瘤細(xì)胞后可通過直接與DNA鏈的結(jié)合引起不依賴ROS的鏈的斷裂，但同時，BLM主要通過提高細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞DNA的氧化損傷。早期研究[8]認(rèn)為，BLM的抗性產(chǎn)生是細(xì)胞內(nèi)BLM水解酶上調(diào)造成的，該酶能夠水解BLM上的一個肽結(jié)構(gòu)而降低BLM的活性。然而，研究[9]表明，這一機制并不是普遍存在于所有BLM抗性的細(xì)胞中。近年來，更多的關(guān)于BLM耐藥的機制被提出，其中抗氧化應(yīng)激機制就是其中的一種。Nrf2是對抗細(xì)胞氧化應(yīng)激的一種重要轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于各種細(xì)胞及機體中。Nrf2的缺陷或調(diào)節(jié)異?？芍苯咏档图?xì)胞應(yīng)對氧化應(yīng)激的敏感性[10]。該研究顯示，細(xì)胞在BLM作用后，細(xì)胞內(nèi)的ROS 在短期內(nèi)迅速累積，通過蛋白表達(dá)檢測顯示，兩種細(xì)胞在5 μg/ml BLM作用下，細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著增加，暗示細(xì)胞內(nèi)Nrf2轉(zhuǎn)錄功能的活化。用Nrf2表達(dá)刺激劑人為刺激細(xì)胞Nrf2蛋白的表達(dá)水平，顯著緩解了細(xì)胞在BLM作用后的DNA損傷程度。用Nrf2的siRNA干擾Nrf2的基因表達(dá)后，細(xì)胞DNA的損傷顯著增加，結(jié)果提示，Nrf2功能的活化直接降低了腫瘤細(xì)胞DNA的損傷程度，這可能就是BLM抗藥性產(chǎn)生的一大原因。

根據(jù)先前的報告，細(xì)胞在BLM作用后，細(xì)胞處于G2/M期[11]，這提示腫瘤細(xì)胞在BLM作用后DNA損傷修復(fù)機制的活化。且在輻射作用下，腫瘤細(xì)胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白53BP1以Nrf2依賴的方式活化，通過敲低方法抑制Nrf2時，在A549細(xì)胞中觀察到輻射誘導(dǎo)的53BP1 foci形成顯著減少[12]。這些結(jié)果表明，同源重組修復(fù)核心蛋白Rad51確實可能與Nrf2的表達(dá)相關(guān)。該研究結(jié)果顯示，當(dāng)Nrf2表達(dá)被抑制時，Rad51蛋白的表達(dá)水平也出現(xiàn)了相應(yīng)的下降，表明，在BLM誘導(dǎo)的細(xì)胞DNA損傷修復(fù)中，Rad51的表達(dá)受Nrf2的影響。且蛋白相互作用結(jié)果顯示，兩者存在直接相互作用。因此猜測Nrf2不僅僅通過抗氧化途徑保護(hù)細(xì)胞DNA損傷，同時還可以直接通過調(diào)控Rad51 來啟動DNA損傷修復(fù)，從而降低了腫瘤細(xì)胞在BLM作用下的DNA損傷程度。當(dāng)然，Nrf2與Rad51具體作用方式還有待進(jìn)一步的實驗研究。

綜上所述，該實驗提示Nrf2在腫瘤細(xì)胞對BLM抗性中存在著重要的作用，不僅僅是因為其強大的抗氧化功能，細(xì)胞內(nèi)的Nrf2還可通過與Rad51相互作用調(diào)控Rad51蛋白表達(dá)水平，最終影響DNA的損傷修復(fù)。該研究為揭示Nrf2在BLM耐藥中的潛在機制提供了新的思路。