翟慶齡，謝丹娜，王凱新，王雪貞，陳金波，董曉夢

偏頭痛是世界上最常見的神經系統(tǒng)疾病之一，許多信號傳導通路參與偏頭痛發(fā)病機制，如絲裂原活化蛋白激酶通路(mitogen actived protein kinase, MAPK)通路、一氧化氮(nitric oxide, NO)/可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(soluble guanylate cyclase，sGC)/環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosinemonophosphate, cGMP)通路等。垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽(pituitary adenylate-cyclase-activating polypeptide，PACAP)已經被證明是腦循環(huán)中作用強大的舒張因子，是偏頭痛關鍵生物學標志物[1]。吡侖帕奈是一種高度選擇性、非競爭性的α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑-丙酸(amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionatereceptor,AMPA)受體拮抗劑，最開始被用作治療癲癇[2],基于癲癇與偏頭痛共同的病理生理特征，可能具有治療偏頭痛的作用。該研究應用腹腔注射硝酸甘油建立大鼠偏頭痛模型，研究吡侖帕奈對偏頭痛大鼠的影響，同時檢測三叉神經節(jié)(trigeminal ganglion，TG)中PACAP及MAPK信號通路相關蛋白的表達，以探討吡侖帕奈的抗偏頭痛作用及其機制，為抗偏頭痛藥物的研發(fā)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組清潔級6周齡成年雄性SD大鼠40只，體質量180～220 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，許可證號：SCXK(魯)2019-0003。飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在21～22 ℃，保持12 h/12 h明暗間隔的人工晝夜節(jié)律，自由攝食和飲水。對實驗動物進行的所有研究行為均嚴格遵照國際疼痛學會(International Association for the Study of Pain，IASP)的相關動物保護及使用規(guī)定。大鼠采用隨機數字表法分為：空白組、硝酸甘油(nitroglycerin, NTG)組、吡侖帕奈50 μg/kg+NTG預防組、吡侖帕奈100 μg/kg+NTG預防組，每組10只。

1.2 方法

1.2.1偏頭痛大鼠模型建立 采用Pradhan改良的方法進行造模，即每隔1 d給予NTG組、吡侖帕奈50 μg/kg+NTG預防組、吡侖帕奈100 μg/kg+NTG預防組腹腔注射稀釋后的硝酸甘油注射液(NTG 10 mg/kg)，空白組腹腔注射等量生理鹽水；共注射5次，即在第1、3、5、7、9天時完成各組注射。

1.2.2預防組給藥 造模前30 min吡侖帕奈50 μg/kg+NTG預防組、吡侖帕奈100 μg/kg+NTG預防組分別給予腹腔注射吡侖帕奈50、100 μg/kg，吡侖帕奈濃度設置參考Hara et al[3]的研究。實驗流程設計示意圖見圖1。

圖1 研究的實驗設計

1.2.3眶周痛覺閾值測定 實驗在藥物注射后1 h進行。研究人員用手約束每只老鼠，防止它們逃離。用von Frey纖維絲懸于大鼠一側眶周皮膚上，相互垂直，從最小強度0.08 g開始刺激眶周皮膚，逐步增加至最大強度300 g。以纖維絲彎曲90°為標準，并在刺激部位停留2 s，刺激5次為1循環(huán)，每次刺激之前間隔3 s。若在5次刺激中有3次及以上出現大鼠用前爪撥開纖維絲、發(fā)動攻擊或縮頭縮爪等行為表現，則判定該大鼠出現痛覺超敏，并記錄此時刺激強度(g)為疼痛閾值。若刺激強度達到300 g，但仍未出現上述痛覺超敏表現，則將300 g記為其痛閾值。實驗表明，出現痛覺超敏的大鼠，其疼痛閾值多在20 g以下。

1.2.4爬籠及梳理面部行為測試 頭部梳理行為為大鼠用前爪或后爪清潔雙側頭部或面部。爬籠次數與梳頭時間的增加被認為是自發(fā)性面部疼痛的一個指標。用攝像機記錄并計算各組大鼠梳理面部的時間及爬籠子的次數。在腹腔注射NTG后30 min，將動物置于樹脂玻璃箱中，首先適應15 min，然后在箱前30 cm處放置攝像機，記錄20 min。

1.2.5畏光行為測試 偏頭痛的另一個特征是畏光，并且暴露在光線下會增加偏頭痛的嚴重程度。實驗第9天給藥后1 h進行畏光行為測試。明暗箱是一個80 cm×40 cm×35 cm的樹脂玻璃箱，被隔間分隔成兩個區(qū)域。在明暗箱里，隔間用白紙包裹，沒有蓋子，使用800流明LED燈照明。而另一個隔間用黑紙包裹，并蓋上蓋子。箱子中間有一個12 cm×12 cm的通道，大鼠可以自由穿梭。通過攝像裝置觀察并記錄10 min內首次進入明室的潛伏時間、在明箱的活動時間及穿梭次數。實驗過程中保持外界環(huán)境安靜，每次放入大鼠前要清理糞便并噴灑酒精去除異味，以便進行下一組測試，確保每次檢測結果的準確性。

1.2.6凈體質量增長量和凈食物消耗量測量 在每次注射藥物之前稱量大鼠的體質量和食物，計算出體質量和凈食物消耗量。

1.2.7免疫熒光染色 在第9天完成行為測定后用10%的水合氯醛深麻醉大鼠，用0.1 mol/L PBS溶液心臟灌流，再用4%多聚甲醛固定，取空白組及NTG組大鼠TG，經30%蔗糖水脫水后行冰凍切片，切片厚度為40 μm。經封閉液室溫封閉1 h后，一抗PACAP(美國Santa公司提供,貨號：sc-166180)、二抗Alexa fluor488驢抗鼠(1 ∶400)室溫孵育4 h，封片劑封片并用共聚焦顯微鏡觀察TG染色效果并拍照。

1.2.8Western blot實驗 同1.2.7項深麻醉大鼠，置于冰上取各組TG放入滅菌EP管中加入裂解液及相應的磷酸酶抑制劑，使用勻漿器將組織磨成勻漿狀態(tài)，4 ℃、1 500 r/min離心10 min。采用BCA法檢測上清液中的蛋白濃度。加入上樣緩沖液和裂解液將蛋白樣品的濃度配平，100 ℃加熱5 min使蛋白變性，分裝后保存于-80 ℃冰箱備用。配置SDS-PAGE膠，加入蛋白質樣本電泳后轉移到PVDF膜。將膜浸泡在封閉緩沖液置于搖床溫柔搖晃2 h；在4 ℃條件下，分別用一抗如下：PACAP抗體(購自英國Abcam公司，批號：ab181205)；phospho-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) 抗體 (批號：#4370)、ERK1/2抗體(批號：#9102)、phospho-JNK抗體(批號：#9251)、JNK抗體(批號：#9252)、phospho-p38MAPK抗體(批號：#9215)、p38MAPK抗體(批號：#8690)和內參GAPDH抗體(批號：#51332)均購自美國Cell Signaling Technology公司。將一抗置于搖床孵育過夜；TBST清洗3次，每次10 min；二抗孵育，按說明書稀釋相應二抗，室溫孵育置于搖床溫柔搖晃2 h；TBST清洗3次，每次15 min；Western blot條帶經Photoshopcs6.0軟件進行灰度掃描分析。

1.2.9RT-PCR實驗 用RNA提取試劑盒將組織裂解稀釋提取總RNA，反轉錄為cDNA，于-20 ℃保存。設計PACAP引物，用GAPDH作為內參。PACAP上游引物：5′-ACTCACCTTTGGTCAATCCC-3′，下游引物：5′-TGATCCCAGGGAAGCTGAGT-3′；GAPDH上游引物：5′-CATGTGTAGCGGAGCAAGGTT-3′，下游引物：5′-TGATCCCAGGGAAGCTGAGT-3′。PCR擴增，反應體系20 μl，2× AceQ qPCR Green Master Mix (High ROX Premixed)10 μl、Primer 10.4 μl、Primer 20.4 μl、TemplatecDNA 1 μl、ddH2O 8.2 μl。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)40次。采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

1.2.10ELISA實驗 同1.2.7項麻醉大鼠，各組大鼠經頸靜脈取血1.5 ml，血液靜置后放入離心機中4 ℃、4 000 r/min離心5 min后取血清，使用ELISA試劑盒檢測PACAP濃度，嚴格按照說明書進行。

2 結果

2.1 吡侖帕奈對NTG誘導的畏光、偏頭痛樣疼痛、眶周痛覺閾值減低的影響與空白組相比，NTG組在明室中的時間縮短且重新進入明室的潛伏期更長，在明暗箱間穿梭次數也更少(P<0.000 1)；吡侖帕奈預處理組不僅增加了大鼠在明室停留時間(圖2A)(F=62.62,P<0.000 1)，而且還縮短了重新進入明室的潛伏期(圖2B)(F=147.10,P<0.000 1)，增加了穿梭次數(圖2C)(F=15.03,P<0.000 1)。在觀察大鼠頭部梳理和爬籠行為時，如圖2D所示，第1次和第2次給藥后，NTG組的頭部梳理時間長于空白組(P<0.05)，而吡侖帕奈100 μg/kg+NTG預防組的大鼠頭部梳理時間比NTG組短(P<0.05)；隨著注射次數增多，與NTG組相比，吡侖帕奈100 μg/kg+NTG預防組頭部梳理時間有差異(給藥因素,F=36.51,P<0.000 1；時間因素，F=0.09,P=0.96； 雙因素,F=0.36,P=0.97)。如圖2E所示， NTG增加了爬籠時間，吡侖帕奈50 μg/kg +NTG預防組和吡侖帕奈100 μg/kg+NTG預防組減弱了NTG誘導的爬籠次數增加(給藥因素,F=29.37,P<0.000 1；時間因素，F=1.40,P=0.24；雙因素,F=0.67,P=0.78)。第1天四組之間的眶周疼痛閾值沒有顯著差異(圖2F)。從第2次給藥開始，NTG組與空白組之間存在差異，NTG組閾值降低(P<0.05)。NTG組的閾值從第3次到第4次給藥呈現出進一步降低的趨勢(P<0.01)。第2次給藥后，吡侖帕奈50 μg/kg+NTG預防組和100 μg/kg+NTG預防組的眶周疼痛閾值高于NTG組(P<0.05)。給藥3次后，NTG組的閾值低于50 μg/kg和100 μg/kg吡侖帕奈+NTG組(圖2F)(給藥因素F=23.28,P<0.000 1; 時間因素,F=4.40,P<0.001；雙因素,F=0.96,P=0.49)。注射5次給藥后，各組大鼠代謝情況并沒有顯著差異，大鼠體質量差異、食物消耗差異無統(tǒng)計學意義。體質量測量(圖2G)：(給藥因素,F=3.20,P=0.04；時間因素，F=34.27,P<0.000 1；雙因素,F=0.64,P=0.81)；凈食物消耗量(圖2H)：(給藥因素,F=4.79,P=0.01；時間因素，F=6.31，P<0.001；雙因素,F=1.40,P=0.17)。各組行為學數據見表1、2。

表1 各組不同時間行為學測定

表2 各組明暗箱實驗測定

圖2 吡侖帕奈對NTG誘導的畏光、偏頭痛樣疼痛、眶周痛覺閾值減低的影響低A：明室停留時間；B：重新進入明室的潛伏時間；C：穿梭次數；D：梳理頭部行為；E：爬籠行為；F：眶周痛覺閾值；G：體質量；H：凈食物消耗量；a:空白組(n=8)；b：NTG組(n=10)；c：吡侖帕奈50 μg/kg+NTG預防組(n=7)；d：吡侖帕奈100 μg/kg+NTG預防組(n=10)；與空白組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1；與NTG組比較：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，####P<0.000 1

2.2 吡侖帕奈對NTG誘導的PACAP水平升高的影響免疫熒光實驗顯示，與空白組相比，NTG組大鼠TG中PACAP水平表達升高(圖3A、B)；Western blot結果顯示，與空白組相比，NTG組中的PACAP蛋白表達升高，吡侖帕奈50 μg/kg+NTG預防組、吡侖帕奈100 μg/kg+NTG預防組PACAP蛋白的表達降低(F=25.06,P<0.000 1)。RT-qPCR分析顯示，與空白組相比，NTG組中PACAP mRNA的表達升高(F=25.06,P<0.000 1)。吡侖帕奈50 μg/kg+NTG 預防組和吡侖帕奈100 μg/kg+NTG預防組降低PACAP的表達。ELISA結果與Western bolt和RT-qPCR的結果相似，與NTG組相比，吡侖帕奈100 μg/kg+NTG下調PACAP的水平但結果無統(tǒng)計學差異(W=4.218，P=0.88)。 見圖3D。

圖3 吡侖帕奈對NTG誘導的PACAP水平升高的影響a:空白組TG PACAP免疫熒光圖 ×40；B: NTG組TG PACAP免疫熒光圖 ×40；C：PACAP蛋白檢測Western blot圖；D：PACAP表達水平統(tǒng)計圖；a:空白組(n=4)；b：NTG組(n=6)；c：吡侖帕奈50 μg/kg+NTG預防組(n=6)；d：吡侖帕奈100 μg/kg+NTG預防組(n=6)；與空白組比較：**P<0.01，****P<0.000 1；與NTG組比較：#P<0.05,##P<0.01，###P<0.001，####P<0.000 1

2.3 吡侖帕奈調控MAPK信號通路對偏頭痛大鼠的影響Western blot實驗結果如圖4所示，與空白組相比，NTG組p-JNK、p-ERK和p-p38MAPK蛋白表達升高；而吡侖帕奈100 μg/kg+NTG預防組p-JNK(F=22.76，P<0.000 1)、p-ERK(F=11.06，P<0.001)和p-p38MAPK(F=10.49，P<0.001)蛋白表達降低(圖4B),差異有統(tǒng)計學意義；而注射NTG后各組JNK、ERK和p38MAPK蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(圖4C)。這些結果表明，NTG可以促進MAPK通路信號傳導以促進偏頭痛的病理生理過程，但吡侖帕奈100 μg/kg可以抑制MAPK通路緩解偏頭痛。

圖4 吡侖帕奈調控MAPK信號通路對偏頭痛大鼠的影響a: MAPK、p-MAPK蛋白檢測的Western blot圖；B：p-MAPK蛋白水平統(tǒng)計圖；C: MAPK蛋白水平統(tǒng)計圖；a:空白組(n=4)；b：NTG組(n=6)；c：吡侖帕奈50 μg/kg+NTG預防組(n=6)；d：吡侖帕奈100 μg/kg+NTG預防組(n=6);與空白組比較：**P<0.01；與NTG組相比較：##P<0.01，###P<0.001，####P<0.000 1

3 討論

偏頭痛為一種常見疾病，偏頭痛動物模型提示該疾病共同之處是存在關鍵信號通路的失調。本研究使用NTG誘導的偏頭痛大鼠模型進一步驗證偏頭痛發(fā)病機制中的MAPK信號傳導通路，探討吡侖帕奈調控MAPK信號通路對偏頭痛大鼠的影響，并且首次提出吡侖帕奈可能通過調控此通路發(fā)揮緩解偏頭痛作用。

吡侖帕奈是高度選擇性的突觸后膜神經元離子AMPA受體拮抗劑，通過與AMPA受體非競爭性結合，阻止Na+、K+單價陽離子進出細胞，無法引起突觸后膜去極化，因此興奮性突觸后電位無法誘發(fā)，從而抑制興奮性突觸傳遞。有研究[4]證明NTG誘導AMPA受體亞基GluAlSer831位點磷酸化是偏頭痛模型小鼠痛覺敏化的關鍵機制；通過上調鈣通透型AMPA受體進一步促進痛覺敏化發(fā)生。因此，AMPA受體很可能在偏頭痛發(fā)生機制——痛覺敏化中起重要作用。偏頭痛與癲癇同為發(fā)作性疾病，其病理生理、治療方法有相似之處。因此，推斷作為抗癲癇藥物上市的AMPA受體抑制劑吡侖帕奈可能具有抗偏頭痛的作用。

NTG是一種NO供體，可以在一定條件下激活鳥苷酸環(huán)化酶模擬細胞內NO的效應[5]。NO是調節(jié)腦血流量及動脈直徑的重要調節(jié)因子，參與偏頭痛的急性發(fā)作；NO還可以促進皮層擴散性抑制(cortical spreading depression,CSD)的發(fā)生，而CSD目前被廣泛認為是偏頭痛先兆發(fā)作的潛在機制[6]。全身注射NTG還會引發(fā)健康人的即刻頭痛和偏頭痛易感患者的偏頭痛發(fā)作[7]。本研究通過建立NTG偏頭痛大鼠模型，觀察大鼠撓頭、爬籠行為、測定眶周痛覺閾值、計算畏光行為時間，模擬偏頭痛發(fā)作的臨床表現和特征。從行為學角度表明吡侖帕奈具有緩解偏頭痛癥狀的作用。原發(fā)性頭痛、特別是偏頭痛，與飲食障礙有雙向關系，有研究表明，88%的女性偏頭痛患者有節(jié)食經歷，59%會暴食、26%會催吐[8]；飲食失調患者中74%患有偏頭痛[9]。因此本實驗初步探索了偏頭痛大鼠的飲食障礙與體質量增減情況，然而本實驗中，5次注射NTG后NTG組大鼠與空白組、吡侖帕奈預防組大鼠的食欲減退程度才有顯著差異，其原因可能是大鼠的飲食失調需要更長的時間來觀察。

PACAP在偏頭痛中的標志性作用已被越來越多的者證實。偏頭痛學早在2009年，Schytz et al[1]首次證明靜脈輸入PACAP38會引發(fā)偏頭痛樣發(fā)作，所有的健康受試者和超過90%的偏頭痛患者在輸注PACAP后誘發(fā)偏頭痛發(fā)作。K?rtési et al[10]發(fā)現口面注射弗氏完全佐劑可激活大鼠三叉神經血管系統(tǒng)，導致三叉神經脊束尾核大量降鈣素基因相關肽和PACAP38釋放。Syed et al[11]的一項離體研究使用PAC1拮抗劑逆轉了PACAP38誘導的大鼠腦膜中動脈管舒張。在本實驗，與空白組相比，NTG誘導的偏頭痛大鼠TG組織和血液中的PACAP表達上調，而吡侖帕奈預處理可降低NTG誘導的大鼠TG組織和血液中的PACAP表達。這些結果表明吡侖帕奈治療偏頭痛作用可能是通過減少偏頭痛標志性物質PACAP表達實現的。

MAPK信號在偏頭痛發(fā)病機制中的作用已經在NTG誘導的動物模型中得到印證[12]。Lai et al[13]認為鉤藤堿的抗偏頭痛作用是通過抑制由NTG激活MAPK/核因子-kB(NF-kB)完成。這些研究均表明，MAPK通路在偏頭痛的發(fā)生和維持中有著密切的關系。本實驗中NTG誘導的偏頭痛模型大鼠TG組織中p-JNK、p-ERK和p-p38MAPK蛋白表達升高，進一步驗證了MAPK信號通路在偏頭痛發(fā)病機制中的重要作用；吡侖帕奈預處理組大鼠TG組織中p-JNK、p-ERK和p-p38MAPK蛋白表達降低，提示吡侖帕奈可能通過調控MAPK信號通路達到緩解偏頭痛的效果。

綜上所述，抗癲癇藥物吡侖帕奈有緩解偏頭痛的潛力?；贜TG誘導的偏頭痛大鼠模型，本實驗預給藥吡侖帕奈可以緩解偏頭痛癥狀，并且進一步驗證MAPK通路參與了偏頭痛的發(fā)病機制過程，吡侖帕奈可能通過調控MAPK通路緩解偏頭痛，并為偏頭痛治療藥物的研發(fā)提供驗依據。