王 璐， 徐婷貞， 周林水， 朱淵紅

［浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院（浙江省中醫(yī)院），浙江 杭州 310006］

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一類由多種病因引起的，以成纖維細胞增殖、細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積為特征，并伴有炎癥損傷、組織結(jié)構(gòu)破壞的肺實質(zhì)性病變。近些年來，由于環(huán)境因素的影響和治療手段的限制，人群中肺纖維化的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，為社會經(jīng)濟和醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展帶來了巨大的負擔［1］。

PF 發(fā)病機制復(fù)雜，至今尚未完全闡明。目前認為上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是引起PF 的重要因素［2］；與此同時，越來越多的證據(jù)提示巨噬細胞極化所產(chǎn)生的不同微環(huán)境可影響EMT 的發(fā)生［3-4］。研究顯示，巨噬細胞有M1和M2 兩個免疫功能明確的亞群，M1 型被稱為經(jīng)典活化巨噬細胞，通常由LPS、IFN-γ 誘導(dǎo)，具有極強的吞噬功能和促炎作用；M2 型即替代活化巨噬細胞，由IL-4、IL-13 誘導(dǎo)分化，主要發(fā)揮抗炎、促修復(fù)的作用［4-6］。目前研究顯示無論是體內(nèi)抑或是體外PF 模型中，均存在巨噬細胞亞群失衡的情況，M2 型巨噬細胞過多可直接影響EMT、纖維細胞激活、膠原沉積，以及病理性重塑等環(huán)節(jié)［3-4，7］，但具體機制尚未完全闡明。

C-C 基序趨化因子 22（C-C motif chemokine 22，CCL22）是一類C-C 趨化因子，又稱巨噬細胞衍生趨化因子（macrophage-derived chemokine，MDC），主要由M2 型巨噬細胞釋放；C-C 基序趨化因子受體4（CC motif chemokine receptor 4，CCR4）是 CCL22 的受體。此前，已有研究指出在肺纖維化疾病中，存在CCL22 和 CCR4 的差異表達［8-10］，但這些研究并未將CCL22和CCR4作為整個信號軸進行研究，并且對于效應(yīng)細胞和影響PF的具體分子機制均未有闡述。

本研究關(guān)注不同表型巨噬細胞，通過將無生物學(xué)特性的M0、促炎性質(zhì)的M1 和抑炎性質(zhì)的M2 型巨噬細胞分別與肺泡上皮細胞進行共培養(yǎng)，旨在明確M2型巨噬細胞可否通過CCL22-CCR4途徑引起肺泡上皮細胞EMT，為進一步闡述PF 機制提供參考資料。

材料和方法

1 主要材料

人外周血的單核細胞系THP-1 和肺泡上皮細胞A549 細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。1640 培養(yǎng)液、DMEM 培養(yǎng)液購自 HyClone；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、PBS、胰酶和青-鏈霉素雙抗購自Gibco；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和佛波酯（phorbol ester，PMA）購自Sigma；rhIFN-γ、rhIL-4和 rhIL-13 均 購 自 PeproTech；CCR4 受 體 抑 制 劑AZD2098 購自上海陶素生化科技有限公司；CCK-8試劑購盒購自北京碧云天科技有限公司；Annexin VFITC/PI 檢測試劑盒購自南京凱基生物有限公司；CCL22/MDC ELISA 試劑盒購自 Bio-Swamp；Trizol 試劑購自Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量PCR試劑購自ABI；引物由明琛志遠生物技術(shù)（北京）有限公司合成；所有抗體購自Affinity、Abcam、Sigma-Aldrich或CST。CO2培養(yǎng)箱（Thermo）；熒光顯微鏡（Olympus）；酶標儀（Thermo）；熒光定量PCR 儀（ABI）；蛋白電泳分離、轉(zhuǎn)膜和成像系統(tǒng)（Bio-Rad）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) THP-1 和A549 細胞分別使用含有10%FBS 的1640培養(yǎng)液（內(nèi)含1%青-鏈霉素雙抗）和含有10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液（內(nèi)含1%青-鏈霉素雙抗），放置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液，按1∶3的比例傳代。

2.2 巨噬細胞亞群誘導(dǎo) 取處于對數(shù)生長期，生長狀態(tài)良好的THP-1 細胞，以每孔5×105個接種于細胞培養(yǎng)6孔板中的Transwell小室，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；更換含PMA 的1640 培養(yǎng)液進行誘導(dǎo)。單核細胞組：THP-1 細胞不進行任何處理；M0 組：THP-1 細胞經(jīng) PMA（150 nmol/L）處理 72 h；M1 組：THP-1 細胞經(jīng)PMA（150 ng/L）處理72 h，再經(jīng)10 ng/L LPS 和 20 μg/L rhIFN-γ 處理 24 h；M2 組：THP-1 細胞經(jīng) PMA（150 nmol/L）處理 72 h，再經(jīng) 20 μg/L rhIL-4和20 μg/L rhIL-13處理72 h［11-12］。

2.3 實驗分組 待巨噬細胞分化成功后，實驗分為5 組：正常對照（A549）組：只進行A549 細胞培養(yǎng)；M0共培養(yǎng)（A549+M0）組：上室加入M0，下室加入A549細胞；M1 共培養(yǎng)（A549+M1）組：上室加入M1，下室加入A549 細胞；M2 共培養(yǎng)（A549+M2）組：上室加入M2，下室加入 A549 細胞；M2+CCR4 抑制劑共培養(yǎng)（A549+M2+AZD2098）組：上室加入 M2，下室加入A549 細胞及 10 μmol/L AZD2098［13-14］，根據(jù)不同實驗，培養(yǎng)0、24、36、48或72 h。

2.4 CCK-8 檢測 按照分組，取處于對數(shù)生長期，生長狀態(tài)良好的A549 細胞，以每孔5×104個接種于培養(yǎng)板（培養(yǎng)液體積500 μL），放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；將已貼有巨噬細胞（M0、M1、M2）的Transwell 小室挪至A549 培養(yǎng)板中。培養(yǎng)24、36、48 和72 h 后，取出小室。收集細胞培養(yǎng)液，每100 μL 培養(yǎng)液加入 10 μL CCK-8 反應(yīng)液，繼續(xù)于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h。收集細胞上清，用酶標儀檢測各孔在波長450 nm 處的吸光度（A）值。以時間為橫坐標，A450值為縱坐標，繪制細胞生長曲線。

2.5 劃痕實驗 使用記號筆在細胞培養(yǎng)板背后，均勻劃橫線；接種A549 細胞于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細胞密度達到60%左右，鋪滿6 孔板底部，用200 μL吸頭垂直于背后的橫線劃痕；PBS洗細胞3次，去除懸浮的細胞，加入無血清培養(yǎng)液，同時拍取0 h照片；按照分組，將貼有巨噬細胞（M0、M1、M2）的小室挪至A549細胞培養(yǎng)板中共培養(yǎng)，24和36 h后分別拍照。

2.6 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡 按照CCK-8 實驗步驟，完成A549 細胞接種、共培養(yǎng)。48 h后，取出上室，用不含EDTA的0.25%胰酶消化細胞，終止消化后收集A549細胞。按照說明書，離心，清洗細胞后，加入500 μL 結(jié)合緩沖液，重懸細胞；加入5 μL AnnexinV-FITC 和 5 μL 碘化丙啶（propidium iodide，PI），混勻；室溫避光反應(yīng)10 min；上流式細胞儀檢測。

2.7 ELISA檢測細胞上清CCL22水平 共培養(yǎng)48 h后，收集下室培養(yǎng)液，離心后小心吸取細胞上清，使用人CCL22/MDC ELISA 試劑盒檢測CCL22 表達水平。每個樣品重復(fù)3次，取平均值，實驗重復(fù)2次。

2.8 RT-qPCR 實驗 使用 Trizol 提取各組 A549 細胞的總RNA，測定RNA 濃度及純度后，采用反轉(zhuǎn)錄試劑，將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以此cDNA 為模板，進行 PCR 擴增：95 ℃ 45 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 1 min，共進行44 個循環(huán)。RT-qPCR 引物序列見表1。以18S為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計算各組目的基因的相對表達水平。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

2.9 Western blot 檢測蛋白表達 共培養(yǎng)48 h 后收集A549 細胞，使用RIPA（含磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑cocktail）置冰上將細胞充分裂解，并用BCA法檢測蛋白濃度；變性離心后取上清進行蛋白上樣。按照Western blot 實驗常規(guī)操作流程進行電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉-Ⅰ抗孵育-Ⅱ抗孵育-顯影曝光?？贵w信息如下：精氨酸酶1（arginase-1，Arg-1）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）及CCR4抗體（Affinity），E-cadherin 抗體（Abcam），Smad2/3 和p-Smad2/3 抗體（Cell Signaling Technology），1∶1 000；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體（Sigma-Aldrich），1∶3 000；GADPH 抗體（Proteintech），1∶5 000。ImageJ 軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白的相對表達量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 7 軟件進行分析。計量資料用均數(shù)±標準誤（mean±SEM）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 巨噬細胞表型鑒定

光鏡下觀察THP-1 及各組巨噬細胞形態(tài)變化。如圖1A 所示：未經(jīng)處理的THP-1 細胞為圓形的懸浮細胞，不貼壁；經(jīng)過PMA 處理72 h 后的M0 型巨噬細胞細胞貼壁，有小觸角；經(jīng)PMA 和LPS、IFN-γ處理的M1 型巨噬細胞細胞貼壁，觸角長；先后經(jīng)PMA 以及IL-4、IL-13處理的M2型巨噬細胞細胞貼壁，觸角短，與M0組形態(tài)相近。

隨后提取4 組細胞總RNA 及蛋白，進行RT-qPCR反應(yīng)和Western blot檢測。結(jié)果顯示，與正常組相比，M0 組細胞 iNOS、IL-12β、Arg-1 和 IL-10 mRNA 表達均無顯著變化；M1 組細胞 iNOS 和IL-12β mRNA表達增加（P＜0.05），而Arg-1 和IL-10 mRNA 表達無顯著變化；M2 組細胞則主要表現(xiàn)為Arg-1 和IL-10 mRNA 表達顯著增加（P＜0.01），見圖 1B。Western blot結(jié)果同樣顯示了M1、M2組分別以iNOS、Arg-1蛋白顯著升高為特點的改變（P＜0.05），見圖1C。因此，可認為M1、M2型巨噬細胞誘導(dǎo)分化成功。

Figure 1. Identification of macrophage phenotype. A：cell morphological changes（scale bar=50 μm）；B：iNOS，IL-12β，Arg-1，and IL-10 mRNA levels were measured by RT-qPCR；C：the protein levels of iNOS and Arg-1 were assessed by Western blot. Mean±SEM. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs THP-1 group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs M0 group.圖1 巨噬細胞表型的鑒定

2 巨噬細胞對肺泡上皮細胞增殖、遷移和凋亡的影響

分別將 M0、M1、M2 型巨噬細胞與 A549 進行共培養(yǎng)。CCK-8 結(jié)果顯示，與M0、M2 型巨噬細胞共培養(yǎng) 36、48 或 72 h 后，A549 細胞活力與正常對照 A549細胞無顯著差異，但與M1 型巨噬細胞共培養(yǎng)后，A549 細胞活力顯著降低（P＜0.01）；與M1 共培養(yǎng)組相比，M2 組的細胞活力顯著提高（P＜0.05），見圖2A。根據(jù)細胞生長速度，劃痕實驗選擇了與巨噬細胞共培養(yǎng)24和36 h時點，觀察各組A549細胞遷移能力，結(jié)果顯示：與正常對照組細胞相比，M1 共培養(yǎng)組的細胞遷移能力顯著減退（P＜0.01），而M2型巨噬細胞則可促進A549 細胞遷移（P＜0.05），見圖2B。凋亡實驗以共培養(yǎng)48 h 為終點，結(jié)果顯示，共培養(yǎng)48 h，M1 型巨噬細胞可顯著誘導(dǎo)A549 細胞凋亡（P＜0.01），而M2 型巨噬細胞則可抑制細胞凋亡（P＜0.01）；M0 型巨噬細胞對A549 細胞凋亡影響較小，與正常組相比無顯著差異，見圖2C。

3 巨噬細胞對肺泡上皮細胞形態(tài)學(xué)及EMT 表型的影響

結(jié)合CCK-8、劃痕和凋亡實驗結(jié)果，該實驗進一步觀察了共培養(yǎng)48 h 時A549 細胞形態(tài)學(xué)以及EMT表型的變化。如圖3A 所示，光鏡下，單獨培養(yǎng)的A549 細胞為上皮樣形態(tài)，細胞緊密性高；而經(jīng)過巨噬細胞共培養(yǎng)后，細胞發(fā)生形態(tài)變化，其中以M2 共培養(yǎng)組變化最為顯著，細胞呈細長梭形伴有間隙增大。Western blot 結(jié)果顯示，與正常A549 細胞相比，M1 組E-cadherin 蛋白表達未見差異，M2 組則顯著降低（P＜0.01）；同時，M1 組α-SMA 表達較對照組顯著降低（P＜0.01），而M2 組α-SMA 表達則無顯著變化，見圖 3B。RT-qPCR 結(jié)果顯示，當 A549 細胞與 M2 型巨噬細胞共培養(yǎng)時，其E-cadherin mRNA 表達較正常對照細胞顯著下調(diào)（P＜0.01），而fibronectin mRNA 表達上調(diào)（P＜0.05），見圖3C。

Figure 2. Effect of different phenotypes of macrophages on the viability，migration and apoptosis of A549 cells. A：CCK-8 assay was used to detect the viability of A549 cells；B：scratch wound healing assay was used to assess the migration capacity of A549 cells（scale bar=100 μm），and the relative rates of wound closure at 24 and 36 h were shown；C：Annexin V-FITC/PI assay was used to determine the cell apoptosis，and the apoptosis rates of A549 cells co-cultured with M0，M1 and M2 macrophages for 48 h were shown. Mean±SEM. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs A549 group.圖2 不同表型巨噬細胞對A549細胞活力、遷移和凋亡的影響

4 M2 型巨噬細胞對CCL22-CCR4-Smad2/3 通路的影響

ELISA結(jié)果顯示：與正常上皮細胞組相比，M2組A549 細胞上清中CCL22 的表達量有顯著升高（P＜0.01）。RT-qPCR 和 Western blot 結(jié)果顯示，與其余 3組相比，M2 組上皮細胞具有更高的CCR4 mRNA 水平（P＜0.05）。與此同時，M2 組的CCR4 蛋白表達也顯著增高，以及Smad2/3蛋白的磷酸化激活水平也上調(diào)（P＜0.01），見圖4。

5 抑制CCR4 后M2 型巨噬細胞對A549 EMT 的影響

Western blot 結(jié)果顯示，當M2 共培養(yǎng)組加入CCR4 抑制劑 AZD2098 時，其CCR4 表達顯著減少（P＜0.01），而 EMT 表型的變化較 M2 共培養(yǎng)組顯著逆轉(zhuǎn)，即E-cadherin 的蛋白表達升高，而α-SMA 的表達降低（P＜0.01），并伴有Smad2/3 磷酸化信號的顯著下調(diào)（P＜0.01），見圖5。

討 論

趨化因子是一類由細胞分泌的可以引起趨化反應(yīng)的小分子細胞因子或信號蛋白。近些年幾項轉(zhuǎn)錄組測序研究結(jié)果顯示，趨化因子在巨噬細胞介導(dǎo)的PF 中占據(jù)了重要作用，例如 CCL2、CCL3（MIP-1）、CCL5、CCL17、CCL18、CCL22等［15-17］。CCL22，又稱為STCP-1（刺激T 細胞趨化蛋白1），是一種新的人類CC趨化因子，表達于巨噬細胞、T細胞及NK細胞，因其主要由M2 型巨噬細胞釋放，又被視為M2 型巨噬細胞標志物［18］。

Figure 3. Effects of different phenotypes of macrophages on the morphological changes and EMT of A549 cells. A：morphological changes of the cells（scale bar=100 μm）；B：Western blot analysis for E-cadherin and α-SMA protein expression；C：RT-qPCR analysis for E-cadherin and fibronectin mRNA expression. Mean±SEM. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs A549 group.圖3 不同表型巨噬細胞對A549肺泡上皮細胞形態(tài)及EMT的影響

Figrure 4. The activation of CCL22-CCR4 axis and Smad2/3 signaling pathway in A549 cell co-cultured with different phenotypes of macrophages. A：ELISA analysis for the concentration of CCL22 in cell supernatants；B：RT-qPCR analysis for CCR4 mRNA expression；C：Western blot analysis for CCR4，Smad2/3 and p-Smad2/3 protein levels. Mean±SEM. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs A549 group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs A549+M0 group.圖4 不同表型巨噬細胞對A549細胞CCL22-CCR4-Smad2/3信號通路激活水平的影響

Figrure 5. The effect of CCR4 inhibitor AZD2098 on CCL22-CCR4 axis and Smad2/3 signaling pathway activation. A：Western blot analysis for CCR4，E-cadherin and α-SMA protein expression；B：Western blot analysis for Smad2/3 and p-Smad2/3 protein levels. Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs A549 group；##P＜0.01 vs A549+M2 group.圖5 CCR4抑制劑AZD2098對A549細胞CCL22-CCR4-Smad2/3信號通路活化水平的影響

關(guān)于CCL22 與肺纖維化的研究可追溯到20 世紀初期，當時就有專家指出CCL22 可能在PF 疾病中發(fā)揮作用，并在特發(fā)性肺纖維化、結(jié)節(jié)病、放射相關(guān)性肺纖維化的患者肺組織、肺泡灌洗液標本以及大鼠模型中得到了驗證［8-9］；另一方面，CCR4 作為CCL22 的受體，也被多次在肺纖維化臨床及基礎(chǔ)研究中觀察到有差異表達，例如在特發(fā)性肺纖維化、囊性纖維化患者以及博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠中，均顯示了 CCR4 水平的上調(diào)［9-10，19］。但這些研究只是簡單指出了CCL22 和CCR4 在肺纖維化疾病中存在差異，并未對其作用機制及具體的效應(yīng)細胞進行闡述，因此我們的研究是這部分內(nèi)容的擴展。

與此同時，越來越多的證據(jù)顯示，CCL22-CCR4軸在腫瘤類疾病和自身免疫相關(guān)性疾病［18，20］的EMT進程中發(fā)揮了作用，并且該過程受M2型巨噬細胞調(diào)控。例如，在多種鱗狀細胞癌和新月體腎小球腎炎的研究中，學(xué)者們觀察到M2 型巨噬細胞衍生的CCL22 可通過CCL22-CCR4 反應(yīng)軸，有選擇的趨化T淋巴細胞募集，參與疾病調(diào)控［21-22］。在肝癌的研究中，專家們也觀察到CCL22 作用于肝癌細胞受體CCR4 后，可進一步激活Smad 信號通路，進而促進腫瘤細胞發(fā)生EMT，這一途徑被視為M2型巨噬細胞影響肝癌轉(zhuǎn)移的新機制［18］。從這些研究受到啟發(fā)，我們從CCL22-CCR4 軸的角度探討了M2 型巨噬細胞促進EMT 的分子過程，并且關(guān)注于公認的肺纖維化經(jīng)典信號通路——Smad信號通路［23-24］。

我們的結(jié)果顯示，與無生物學(xué)特性的M0型巨噬細胞和促炎作用為主的M1型巨噬細胞相比，當肺泡上皮細胞與M2型巨噬細胞共培養(yǎng)后，其上皮細胞表型逐漸向間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)變，并且細胞生長、遷移能力顯著提高，而凋亡水平則下降，并且纖維化相關(guān)信號通路Smad2/3 有顯著激活；當我們使用CCR4 抑制劑后，可以看到伴隨著Smad 信號通路的下調(diào)，EMT 過程被抑制，該研究結(jié)果較好驗證了我們的設(shè)想，也是對先前研究的補充。值得指出的是，有研究表明，CCL22 雖主要由M2 型巨噬細胞分泌，但CCL22 反過來也會促進IL-13 的產(chǎn)生，進一步促進M2 型巨噬細胞合成［4］，盡管本研究中未涉及該部分內(nèi)容，但我們認為這條途徑也可能是M2 型巨噬細胞共培養(yǎng)模型引起EMT的另一途徑；同時，如果能使用博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型進行研究，可能對于潛在機制的闡述更有意義。

綜上所述，我們的體外研究提示M2型巨噬細胞可增強肺泡上皮細胞活力、遷移能力，并抑制其凋亡，最終促進EMT，其機制可能與CCL22-CCR4-Smad2/3信號通路的激活有關(guān)。