潘曉杰， 范嘉銓， 夏光琴△

（1貴州醫(yī)科大學(xué)附屬金陽(yáng)醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，貴州 貴陽(yáng) 550023；2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州 510260）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種臨床常見的慢性炎性呼吸系統(tǒng)疾病，主要表現(xiàn)為胸悶、氣短、咳嗽等癥狀［1-2］。近年來(lái)全球范圍內(nèi)COPD 的發(fā)病率與死亡率均呈上升趨勢(shì)［3］，嚴(yán)重影響患者健康，增加家庭與社會(huì)負(fù)擔(dān)。目前臨床上用于治療COPD 的藥物效果不佳，易產(chǎn)生不良反應(yīng)，因此探索新的藥物是COPD 治療與預(yù)后的關(guān)鍵。

葛根素是中草藥葛根的主要生物活性成分，是一類異黃酮類化合物，具有退熱、鎮(zhèn)痛、消炎及抗腫瘤的作用，已被證實(shí)在肺癌等癌癥中能有效發(fā)揮抗腫瘤特性［4-5］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，葛根素對(duì)于脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）引起的肺組織炎癥損傷具有顯著的抑制作用［6］。葛根素能夠通過(guò)抑制含F(xiàn)UN14 結(jié)構(gòu)域蛋白 1（FUN14 domain containing 1，F(xiàn)UNDC1）介導(dǎo)的線粒體自噬，參與COPD 進(jìn)展，減少肺泡上皮細(xì)胞凋亡，減輕COPD［7］；也能夠通過(guò)介導(dǎo)PTEN 誘導(dǎo)假定激酶 1（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1）-parkin 誘導(dǎo)的線粒體自噬，改善大腦皮層神經(jīng)元免受鎘誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性［8］；但其是否能通過(guò)PINK1-parkin 信號(hào)通路介導(dǎo)的線粒體自噬抑制COPD 肺泡上皮細(xì)胞凋亡尚不清楚。PINK1-parkin信號(hào)通路介導(dǎo)的線粒體自噬是特異性清除受損線粒體的經(jīng)典信號(hào)通路［9］。本研究通過(guò)建立大鼠COPD模型，探討葛根素是否能夠通過(guò)調(diào)控PINK1-parkin信號(hào)通路介導(dǎo)的線粒體自噬，發(fā)揮肺保護(hù)作用，為臨床治療COPD提供新的用藥參考。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性 SD 大鼠，6～8 周齡，體質(zhì)量 200～220 g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（冀）2019-001。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)于濕度40%～55%，溫度20～25℃，光照循環(huán)12 h/12 h的動(dòng)物房中，期間自由飲水采食。實(shí)驗(yàn)遵守動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，符合“3R”原則。

2 主要試劑與儀器

LPS（A2313）購(gòu)自北京康瑞納生物科技有限公司；葛根素（YG10447）購(gòu)自上海韻泰信息科技有限公司；自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA；T1879）購(gòu)自TargetMol；TNF-α 檢測(cè)試劑盒（EKR38696）、IL-1β 檢測(cè)試劑盒（EK-R36877）和 IL-6 檢測(cè)試劑盒（EK-R36902）購(gòu)自北京博沃爾斯生物科技有限公司；HE染色試劑盒（YT8681）購(gòu)自北京伊塔生物科技有限公司；TUNEL染色試劑盒（A112-01）購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；DAB 染色試劑盒（SW1020）和ECL 顯色液（PE0010）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；BECN1 抗體（ab210498）、LC3B 抗體（ab48394）、Bcl-2 抗 體（ab196495）、Bax 抗 體（ab216985）、PINK1 抗體（ab186303）、parkin 抗體（ab15494）及辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo) 記 的 羊 抗 兔/鼠 Ⅱ 抗（ab6721 和ab6789）購(gòu)自Abcam。

小動(dòng)物肺功能分析儀購(gòu)自EMMS；E100 光學(xué)顯微鏡購(gòu)自Nikon；Revolve 熒光顯微鏡購(gòu)自Echo Laboratories；Azure 200 凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自普邁精醫(yī)科技（北京）有限公司。

3 分組、模型制備及給藥

參照文獻(xiàn)［10］，采用氣管滴注LPS+煙熏法建立COPD 大鼠模型：于實(shí)驗(yàn)第1 天向SD 大鼠氣管內(nèi)滴注1 mg/kg 的LPS，之后將大鼠置于規(guī)格為60 cm×40 cm×40 cm 的自制玻璃煙薰箱，點(diǎn)燃香煙持續(xù)熏30 min，2周后即第14天時(shí)再進(jìn)行一次LPS滴注，之后再次進(jìn)行煙熏，2 周后進(jìn)行肺功能檢測(cè)，以肺功能下降提示大鼠造模成功。將造模成功后的大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、低劑量葛根素組、中劑量葛根素組、高劑量葛根素組和3-MA 組，每組15 只。另取15 只大鼠不做處理作為對(duì)照組。參照文獻(xiàn)［11］，按照成人與大鼠體表面積比，低、中、高劑量葛根素組大鼠分別灌胃 50、100 和 200 mg/kg 葛根素，3-MA 組大鼠腹腔注射10 mg/kg 3-MA［12］。模型組與對(duì)照組均灌胃并腹腔注射等體積生理鹽水。各組大鼠每日給藥1次，連續(xù)給藥8周。

4 指標(biāo)檢測(cè)

4.1 大鼠肺功能檢測(cè) 末次給藥結(jié)束后24 h，麻醉大鼠，采用小動(dòng)物肺功能分析儀檢測(cè)大鼠用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）、0.1 s 用力呼氣容積（forced expiratory volume in 0.1 s，F(xiàn)EV0.1）和呼氣流量峰值（peak expiratory flow，PEF）。

4.2 大鼠肺泡灌洗液中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平的檢測(cè) 肺功能測(cè)定結(jié)束后，各組隨機(jī)取5 只大鼠，處死后開胸，分離氣管和肺，結(jié)扎右肺門，用注射器吸取3 mL 生理鹽水注入左肺，反復(fù)灌洗3次，收集肺泡灌洗液，1500 r/min 離心15 min，取上清液，采用ELISA 法，按照試劑盒檢測(cè)說(shuō)明書進(jìn)行操作，檢測(cè)肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平。

4.3 HE染色觀察大鼠肺組織病理學(xué)變化 取血后，選取剩余的10只大鼠，處死后迅速取出肺組織，分為兩部分，一部分制備10%的組織勻漿，另一部分心肌組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片。切片用二甲苯和乙醇濃度梯度脫蠟、水化后，浸入蘇木精3～4 min，并用伊紅染色1～2 min。之后，切片分別在80%、90%和100%乙醇中脫水3～5 min，然后用中性樹膠密封。參照文獻(xiàn)［13］中肺組織病理?yè)p傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)肺泡腔充血、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡間隔增寬等損傷程度進(jìn)行評(píng)估，按照無(wú)損傷（0分）、輕度損傷（1分）、中度損傷（2 分）和重度損傷（3 分）進(jìn)行評(píng)分。每組選取5 張不同視野照片進(jìn)行評(píng)分，取平均值作為最終評(píng)分。

4.4 TUNEL 染色檢測(cè)肺泡上皮細(xì)胞凋亡 取石蠟包埋的肺組織，切成5 μm 厚的切片，隨后，進(jìn)行脫蠟和水化，封閉液室溫封閉1 h，加入3% H2O2消化后，進(jìn)行TUNEL 染色和蘇木素染色，置于顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照，記錄肺泡上皮細(xì)胞凋亡情況。出現(xiàn)棕色顆粒的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，所有細(xì)胞的細(xì)胞核呈藍(lán)色。每組隨機(jī)選取5 張不同視野對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

4.5 免疫組化法檢測(cè)肺組織中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集各組大鼠肺組織切片，胰蛋白酶修復(fù)抗原，加入 3% H2O2室溫孵育 30 min 后，再加入 5% BSA 室溫封閉1 h，加入Ⅰ抗（BECN1 和LC3B 抗體，稀釋倍數(shù)1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜，再加入HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗（稀釋倍數(shù)1∶2 000），采用DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，ImageJ 7.0軟件分析積分吸光度，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

4.6 Western blot 檢測(cè)肺組織中PINK1-parkin 通路及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 取-80 ℃冰箱中保存的適量肺組織，提取總蛋白，在含有蛋白酶抑制劑（PMSF）的RIPA 裂解液中勻漿，12 000×g離心10 min取上清液，使用CelLytic?NuCLEAR?提取試劑盒提取總蛋白。使用BCA 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后，將等量的蛋白質(zhì)樣品加到8%～12%SDS-PAGE凝膠上，并在冰上電泳90 min。然后將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶封閉，然后將膜與Ⅰ抗（PINK1、parkin、Bcl-2 和 Bax 抗體，稀釋倍數(shù) 1∶500）在4 ℃下孵育過(guò)夜。然后用HRP 標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗（1∶2 000）在室溫下孵育1 h。ECL 試劑顯色，使用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析條帶的灰度值，并以βactin作為內(nèi)參照，分析膜上目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間有差異進(jìn)一步采用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠肺功能比較

與對(duì)照組比較，模型組大鼠FVC、FEV0.1和PEF水平均顯著下降（P＜0.05）；與模型組比較，各劑量葛根素組與 3-MA 組大鼠 FVC、FEV0.1和 PEF 水平均顯著升高（P＜0.05），且具有劑量依賴性（P＜0.05）；與高劑量葛根素組比較，3-MA 組大鼠 FVC、FEV0.1和PEF水平無(wú)顯著差異（P＞0.05），見圖1。

Figure 1. Changes of pulmonary function indexes in rats. A：forced vital capacity（FVC）；B：forced expiratory volume in 0.1 s（FEV0.1）；C：peak expiratory flow（PEF）. Mean±SD. n=15.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs low-dose puerarin group；▲P＜0.05 vs medium-dose puerarin group.圖1 大鼠肺功能指標(biāo)變化

2 各組大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平比較

與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，低、中、高劑量葛根素組和3-MA 組大鼠肺泡灌洗液中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平均顯著降低（P＜0.05），且隨著葛根素劑量的升高而逐漸降低（P＜0.05）；與高劑量葛根素組比較，3-MA 組大鼠肺泡灌洗液中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平無(wú)顯著變化（P＞0.05），見圖2。

Figure 2. Levels of inflammatory factors in alveolar lavage fluid of rats. A：TNF-α；B：IL-1β；C：IL-6. Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs low-dose puerarin group；▲P＜0.05 vs medium-dose puerarin group.圖2 大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平比較

3 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化比較

HE 染色結(jié)果（圖3）顯示，對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，未見病變，肺泡腔未見充血與滲出，病理學(xué)評(píng)分為1.32±0.22；與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織病變明顯，肺泡腔嚴(yán)重充血，炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn)，肺泡間隔與肺泡壁增厚，病理評(píng)分（7.94±0.85）顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，低、中、高劑量葛根素組和3-MA 組大鼠肺組織病變逐漸減輕，肺泡腔充血程度逐漸降低，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸減少，病理評(píng)分分別 為 6.14±0.58、4.87±0.52、3.26±0.33 和 3.31±0.34，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與高劑量葛根素組比較，3-MA 組肺組織病理評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

4 各組大鼠肺組織肺泡上皮細(xì)胞凋亡情況比較

TUNEL 染色結(jié)果（圖4）顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織中肺泡上皮細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各劑量葛根素組和3-MA組大鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），且葛根素各劑量組間具有劑量依賴性（P＜0.05）；與高劑量葛根素組比較，3-MA 組大鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著變化（P＞0.05）。

Figure 3. HE staining of rat lung tissues（×200）.圖3 大鼠肺組織HE染色

Figure 4. TUNEL staining of rat lung tissues（×200）and the apoptosis rates of alveolar epithelial cells. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs low-dose puerarin group；▲P＜0.05 vs medium-dose puerarin group.圖4 大鼠肺組織TUNEL染色和肺泡上皮細(xì)胞凋亡率比較

5 各組大鼠肺組織中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較

與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織BECN1 和LC3B 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各劑量葛根素組和3-MA 組大鼠肺組織BECN1 和LC3B表達(dá)顯著降低（P＜0.05），且具有劑量依賴性（P＜0.05）；與高劑量葛根素組比較，3-MA 組大鼠肺組織BECN1和LC3B表達(dá)無(wú)顯著差異（P＞0.05），見圖5。

6 各組PINK1-parkin通路及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織PINK1、parkin和Bax蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各劑量葛根素組和 3-MA 組大鼠肺組織 PINK1、parkin 和 Bax 蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05），Bcl-2 表達(dá)顯著升高（P＜0.05），且各劑量葛根素組間均有顯著差異（P＜0.05）；與高劑量葛根素組比較，3-MA 組大鼠肺組織PINK1、parkin、Bax 和 Bcl-2 蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖6。

討 論

COPD 是一種以進(jìn)行性氣流受限為特征的炎性呼吸道疾病，主要病理表現(xiàn)為肺泡結(jié)構(gòu)受損，肺泡腔擴(kuò)大，最終導(dǎo)致肺功能下降［10］。吸煙是引起COPD發(fā)生的主要因素［11］。因此，本研究采用長(zhǎng)期煙熏配合LPS氣管滴注建立COPD 模型，結(jié)果顯示大鼠肺組織病變明顯，肺泡充血，肺泡腔擴(kuò)大，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺功能指標(biāo)FVC、FEV0.1和PEF 水平降低，炎癥因子 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平升高，提示 COPD 大鼠肺組織受損，肺功能降低，炎癥反應(yīng)發(fā)生，與以往研究中COPD模型［12］特征類似，提示造模成功。

Figure 5. Expression of autophagy-related proteins in lung tissues of rats in each group（immunohistochemical staining，×200）.Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs low-dose puerarin group；▲P＜0.05 vs medium-dose puerarin group.圖5 各組大鼠肺組織中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

Figure 6. Western blot detection of PINK1，parkin，Bax and Bcl-2 expression in rat lung tissues. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs low-dose puerarin group；▲P＜0.05 vs medium-dose puerarin group.圖6 大鼠肺組織中PINK1、parkin、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)

越來(lái)越多的研究證實(shí)，自噬在COPD的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用［13-14］。研究發(fā)現(xiàn)，PINK1-parkin 通路誘導(dǎo)的線粒體自噬在肺損傷的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，一方面自噬能夠清除受損線粒體，引起機(jī)體抗應(yīng)激能力降低，加速機(jī)體受損［15-16］；另一方面自噬反應(yīng)的過(guò)度激活引起細(xì)胞凋亡，最終加重組織或器官損傷［17］。本研究結(jié)果顯示，COPD 模型大鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡率升高，Bcl-2 蛋白表達(dá)降低，Bax 蛋白表達(dá)升高，自噬標(biāo)志物BECN1 和LC3B 表達(dá)升高，且PINK1和parkin 蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)，提示COPD 大鼠肺組織中PINK1-parkin 通路激活，引起線粒體不斷受損，導(dǎo)致自噬過(guò)度，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，造成COPD發(fā)展。

由于中藥多靶點(diǎn)、療效好以及不良反應(yīng)小等優(yōu)勢(shì)，在臨床治療疾病中具有重要作用。葛根素具有顯著抗炎、抗腫瘤特性，目前已被廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病、癌癥等多種疾病的治療［18-20］。研究發(fā)現(xiàn)，葛根素在內(nèi)毒性急性肺損傷中可有效抑制過(guò)度炎癥反應(yīng)，減少炎癥細(xì)胞的激活，減輕肺水腫，臨床可用作肺損傷潛在抗炎藥物［21］。本研究中，低、中、高劑量葛根素干預(yù)COPD 大鼠后，大鼠肺組織病理?yè)p傷不同程度減輕，肺功能恢復(fù)，肺泡灌洗液中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平降低，提示葛根素可顯著減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)肺功能。此外，葛根素對(duì)肺組織中BECN1、LC3B、PINK1、parkin 及Bax 表達(dá)均具有顯著下調(diào)作用，且可上調(diào)Bcl-2 表達(dá)，降低肺泡上皮細(xì)胞凋亡率，同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，葛根素與自噬抑制劑3-MA 作用一致，表明葛根素可能通過(guò)抑制PINK1-parkin 通路誘導(dǎo)的線粒體自噬反應(yīng)的激活，減輕細(xì)胞凋亡，且具有一定劑量依賴性。

綜上所述，葛根素可能通過(guò)調(diào)節(jié)PINK1-parkin通路誘導(dǎo)的線粒體自噬，抑制肺泡上皮細(xì)胞凋亡，減輕炎癥反應(yīng)，為葛根素在COPD 輔助治療中應(yīng)用奠定理論依據(jù)，但由于自噬反應(yīng)的作用機(jī)制復(fù)雜，參與調(diào)控自噬的通路多樣，因此未來(lái)還需深入探索。