寇樂樂， 張 萌， 李曉雙， 徐 彬， 李士澤

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

骨骼肌是一種橫紋肌組織，它是動物機體儲存營養(yǎng)的重要組織［1］，也是調(diào)節(jié)體內(nèi)系統(tǒng)能量穩(wěn)態(tài)最重要的生理組織，約占體質(zhì)量的40%［2］，其功能喪失可以導(dǎo)致肌肉老化、肌肉損傷以及各種肌源性疾病［3］。骨骼肌發(fā)育是由一系列肌生成調(diào)節(jié)因子介導(dǎo)的復(fù)雜且嚴格調(diào)控的生物學(xué)過程［4］，骨骼肌可以將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為收縮和新陳代謝的能量［5］。肌纖維由慢（I 型）和快（II 型）纖維組成，慢纖維可以激活線粒體生物發(fā)生，主要利用氧化代謝作為能量產(chǎn)物，以三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）來維持基本的穩(wěn)定和活性，而快纖維則對糖酵解代謝有一定的依賴性，還會使線粒體的含量和氧化代謝能量降低［6］。骨骼肌纖維中包含不同的肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MyHC）亞型［7］，由 Myh7（I 型）、Myh2（IIa 型）、Myh1（IIx 型）和Myh4（IIb 型）組成，這些表達每種MyHC 亞型的肌纖維的相對豐度決定了肌肉的收縮力和速度［8］。在肌肉再生過程中，伴隨有活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成增加［9］，線粒體裂變信號傳導(dǎo)的改變［10］等現(xiàn)象。骨骼肌依賴氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）來產(chǎn)生ATP［11］為其提供能量，因此骨骼肌內(nèi)存在的線粒體網(wǎng)絡(luò)對骨骼肌的新陳代謝過程有重要的意義。

O連接的N-乙酰葡萄糖胺（O-linkedN-acetylglucosamine，O-GlcNAc）修飾是一種動態(tài)的翻譯后修飾，是發(fā)生在蛋白質(zhì)絲氨酸和蘇氨酸羥基末端連接的乙酰氨基葡萄糖上的單糖基修飾［12］，O-GlcNAc 修飾 通 過O-GlcNAc 轉(zhuǎn) 移 酶（O-GlcNAc transferase，OGT）和O-GlcNAc 糖苷酶（O-GlcNAcase，OGA）兩種酶［13］之間的動態(tài)循環(huán)過程將單糖轉(zhuǎn)移到絲氨酸或蘇氨酸羥基中發(fā)揮作用。O-GlcNAc 修飾［14］主要發(fā)生在多種核蛋白和胞質(zhì)蛋白中，包括轉(zhuǎn)錄因子、細胞骨架蛋白、腫瘤基因和激酶等［15］，其參與的生物過程包括核苷酸代謝、糖代謝、胰島素抵抗、損傷反應(yīng)及細胞信號蛋白轉(zhuǎn)運等。研究表明，特異性O(shè)gt基因敲除小鼠在缺乏Ogt情況下全身能量消耗增加，線粒體功能損傷，肌肉收縮緩慢，對肌肉發(fā)育造成了一定的影響［16］，但O-GlcNAc 修飾對骨骼肌發(fā)育過程中的機制仍不明確。基于此，本研究旨在探討O-GlcNAc 修飾對小鼠骨骼肌纖維轉(zhuǎn)化的影響，為O-GlcNAc 修飾對小鼠骨骼肌發(fā)育過程中的機制提供科學(xué)依據(jù)。

材料和方法

1 材料

5 周齡SPF 級雄性O(shè)gt基因肌肉特異性敲除（Ogt-/-）C57BL/6 小鼠和同窩雄性野生型（wild-type，WT）小鼠，體重 15～20 g，購自 Jackson Laboratory；Myh2抗體、Myh4抗體、Myh7抗體和α-tubulin 抗體購自Proteintech；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自新賽美生物科技有限公司；RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒和SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 免疫熒光染色法檢測骨骼肌纖維組成 為探討Ogt敲除對骨骼肌纖維類型轉(zhuǎn)化的影響，我們采集腓腸肌并對肌肉切片使用MyHC 抗體進行免疫熒光染色來檢測Ogt敲除后小鼠骨骼肌纖維類型的變化。實驗方法參考已發(fā)表的文獻［17］。

2.2 Seahorse能量代謝分析儀檢測骨骼肌線粒體能量代謝 使用Seahorse XFe24 能量代謝分析儀檢測耗氧率（oxygen consumption rate，OCR）［18］，OCR 參數(shù)包括基礎(chǔ)有氧呼吸、有氧呼吸最大值和非線粒體呼吸等。在檢測過程中，通過預(yù)先設(shè)定的程序，在不同時間段向探針板中加入寡酶素（oligomycin）、解偶聯(lián)劑碳酰氰-4-三氟甲氧基苯腙（carbonylcyanide-4-trifluoromethoxyphenylhydrazone，F(xiàn)CCP）、魚藤酮&抗霉素A（rotenone & antimycin A）等藥物，從而分析線粒體氧化呼吸能力的大小，實驗方法參考已發(fā)表的文獻［19］。

2.3 Western blot 檢測骨骼肌纖維相關(guān)蛋白的表達 采集小鼠腓腸肌組織，剪碎制備成組織勻漿。使用RIPA 裂解液裂解組織提取總蛋白。測蛋白濃度后配制10%的SDS-PAGE 凝膠，取20 μg 蛋白質(zhì)加樣，電泳條件50 V，30 min；80 V，30 min；120 V，30 min；使用 PVDF 膜轉(zhuǎn)膜，條件為 400 mA，30 min。TBST 洗膜3 次，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h。加Ⅰ抗（Myh7、Myh2、Myh4 和 α-tubulin）稀釋液4 ℃孵育過夜，洗膜后加Ⅱ抗稀釋液室溫孵育1 h。使用蛋白成像系統(tǒng)進行曝光并定量分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 8.0 進行獨立樣本t檢驗，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Ogt敲除對小鼠骨骼肌纖維組成的影響

免疫熒光染色結(jié)果表明，與WT 組相比，Ogt-/-小鼠I 型肌纖維顯著增多，II 型肌纖維顯著減少，見圖1。

2 Ogt 敲除對小鼠骨骼肌線粒體氧化呼吸能力的影響

用Seahorse XFe24能量代謝分析儀檢測OCR，結(jié)果表明，與WT 小鼠相比，Ogt-/-小鼠中由oligomycin、FCCP 及rotenone & antimycin A 刺激引起的線粒體OCR 均降低，骨骼肌線粒體的基礎(chǔ)有氧呼吸、ATP 合成、有氧呼吸最大值及非線粒體呼吸對比WT組均顯著降低（P＜0.01），見圖2。

Figure 1. The fiber composition of skeletal muscle was detected by immunofluorescen. The scale bar=20 μm.圖1 免疫熒光檢測骨骼肌纖維組成

Figure 2. Seahorse assayed mitochondrial oxidative respiration in skeletal muscle. A：oxygen consumption rates（OCR）of skeletal muscle in mice；B：analysis of basal respiration，ATP production，maxmal respiration and spare respiratory capacity.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs WT group.圖2 Seahorse檢測骨骼肌線粒體氧化呼吸能力

3 Ogt敲除對小鼠骨骼肌纖維相關(guān)蛋白表達的影響

為了檢測Ogt敲除是否會影響肌肉纖維的轉(zhuǎn)化，我們檢測了小鼠骨骼肌纖維Myh2、Myh4 和Myh7 蛋白的表達，Western blot 結(jié)果顯示，Ogt敲除顯著上調(diào)了小鼠骨骼肌中 Myh7 的蛋白表達（P＜0.05），而Myh2 蛋白的表達顯著下調(diào)（P＜0.05），同時Myh4 蛋白有降低的趨勢，但與WT 組差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3。

討 論

O-GlcNAc 糖基化修飾是一種常見的糖基化形式，它可以調(diào)節(jié)細胞質(zhì)基質(zhì)、細胞核和線粒體內(nèi)的蛋白質(zhì)，而線粒體是細胞進行有氧呼吸的主要場所，線粒體動力學(xué)可以調(diào)節(jié)細胞能量、響應(yīng)細胞信號、維持細胞器的平衡。

有研究指出Ogt基因骨骼肌特異性敲除小鼠骨骼肌質(zhì)量顯著下降，同時線粒體數(shù)量增加［16］。因此，本實驗旨在研究O-GlcNAc 糖基化修飾對小鼠骨骼肌纖維的影響，探討肌纖維類型的變化。實驗結(jié)果表明，Ogt敲除小鼠骨骼肌線粒體的OCR 降低，從而影響了線粒體生物發(fā)生過程。Akinbiyi 等［20］觀察到Oga敲除增強細胞O-GlcNAc糖基化的同時會增加線粒體裂變，線粒體的形態(tài)變小、線粒體含量增加，雖然氧化磷酸化基本不受影響，但細胞呼吸和ATP 水平略有升高。另有研究證明［21］Oga敲低增加了骨骼肌分化過程中的基礎(chǔ)呼吸、最大呼吸和ATP 水平。而O-GlcNAc 糖基化修飾的整個過程只由OGT 和OGA 兩個酶之間的動態(tài)循環(huán)進行調(diào)控［22］。因此，我們推測Ogt敲除會降低線粒體生物發(fā)生，細胞呼吸和ATP 水平也會有所降低，本實驗也證明了這一推測，Seahorse 檢測結(jié)果顯示Ogt敲除的小鼠骨骼肌線粒體OCR 和ATP 生成均發(fā)生顯著性降低。我們認為O-GlcNAc 糖基化循環(huán)改變，使線粒體功能受損，具體來說，O-GlcNAc 糖基化減少使線粒體骨骼肌的呼吸能力受損，呼吸鏈受到損傷，可能導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生，并且累積對線粒體DNA 的損傷，長期暴露于這種情況下，可能會引起線粒體動力學(xué)失衡，從而導(dǎo)致腫瘤［23］、肥胖［24］和各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生。

Figure 3. Western blot was used to detect the protein expression of Myh2，Myh4 and Myh7 in skeletal muscle fibers. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs WT group.圖3 Western blot檢測骨骼肌纖維Myh2、Myh4和Myh7蛋白的表達

Ahn等［25］的研究表明PRDX3的肌肉特異性過表達減少了線粒體過氧化氫的釋放，并防止了Sod1 敲除肌肉中線粒體電子傳遞鏈活性和鈣保留能力的喪失，改善了收縮功能障礙和肌肉萎縮，且肌纖維數(shù)量和質(zhì)量減少的現(xiàn)象也得到緩解。Shi 等［16］對小鼠骨骼肌纖維相關(guān)蛋白進行檢測，結(jié)果表明在Ogt敲除的肌肉中，Myh7基因表達顯著上調(diào)，Myh1基因表達下調(diào)，與本試實驗蛋白表達結(jié)果一致，均呈現(xiàn)出II 型向I型轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，同時，本實驗還顯示Ogt敲除后影響了小鼠骨骼肌的線粒體生物發(fā)生，但是O-GlcNAc 是通過何種途徑以及何種機制影響了骨骼肌纖維以及線粒體的變化仍需進一步研究。

綜上所述，本實驗研究結(jié)果表明，O-GlcNAc 糖基化循環(huán)失衡會使小鼠骨骼肌線粒體功能受損，Ogt敲除能夠顯著降低骨骼肌線粒體的生物發(fā)生，使線粒體功能失調(diào)，從而使氧化磷酸化產(chǎn)生的ATP 減少，ROS 生成增加，導(dǎo)致骨骼肌纖維類型轉(zhuǎn)化，為后續(xù)深入研究O-GlcNAc 糖基化修飾在骨骼肌發(fā)育中的作用提供了參考資料。