嚴(yán) 娜， 張 旭， 于嘉霖， 安 琪， 吳曉玲， 鄧光存

（西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

結(jié)核?。╰uberculosis）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染引起的一種人畜共患傳染病，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和公共衛(wèi)生安全［1］。巨噬細(xì)胞是Mtb的主要宿主細(xì)胞。被Mtb感染后，巨噬細(xì)胞響應(yīng)病原體感染會(huì)發(fā)生凋亡和自噬為主的清除過(guò)程或巨噬細(xì)胞壞死的病原逃逸過(guò)程；其中，自噬作為細(xì)胞的一種“清潔”進(jìn)程，不僅可以維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，還能清除入侵的 Mtb 病原體［2］。自噬在 Mtb 感染中的作用機(jī)制復(fù)雜，至今還未完全明晰。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞代謝在免疫反應(yīng)的啟動(dòng)和調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用，機(jī)體一旦被感染，免疫細(xì)胞會(huì)重新連接細(xì)胞代謝以適應(yīng)感染，并產(chǎn)生足夠的能量來(lái)執(zhí)行宿主防御功能。谷氨酰胺作為巨噬細(xì)胞的主要代謝底物，能夠?yàn)榫奘杉?xì)胞的免疫應(yīng)答提供能量支持，在宿主防御結(jié)核分枝桿菌感染中發(fā)揮重要作用［3-4］。此外，谷氨酰胺代謝還可以參與細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)［5］。谷氨酰胺酶1（glutaminase 1，GLS1）將谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸，在谷氨酰胺代謝中起關(guān)鍵作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，被腺病毒感染的人支氣管上皮細(xì)胞中谷氨酰胺利用和GLS1 活性增加，而降低GLS1 的活性能夠抑制病毒的復(fù)制［6］。另外，人肺肌成纖維細(xì)胞經(jīng)歷谷氨酰胺分解重編程是由GLS1 表達(dá)增加所介導(dǎo)的，GLS1抑制劑CB-839在治療小鼠肺纖維化方面非常有效，GLS1 可能是肺纖維化治療的潛在靶點(diǎn)［7］。然而，GLS1 在 Mtb 感染后巨噬細(xì)胞中的作用仍有待闡明。

因此，本研究通過(guò)卡介苗（Bacille Calmette-Guérin，BCG）感染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，誘導(dǎo)其發(fā)生自噬，通過(guò)小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）敲減GLS1的表達(dá)，并利用 Western blot 和免疫熒光等技術(shù)，檢測(cè)自噬相關(guān)因子表達(dá)情況，從而初步探討GLS1 對(duì)BCG 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW264.7 自噬的調(diào)控作用。上述研究將為結(jié)核病的發(fā)病及防治機(jī)制提供新的思路和見(jiàn)解。

材料和方法

1 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7 細(xì)胞購(gòu)自中科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。培養(yǎng)步驟：當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%，吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，沿壁加入2 mL 的磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）清洗三遍，胰酶消化2 min，900 r/min離心5 min。棄去上清，重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量，將細(xì)胞懸液分配到培養(yǎng)皿中，放入37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。

2 BCG培養(yǎng)與感染

BCG 購(gòu)自上海生物制品研究所。培養(yǎng)步驟：按照配方配制Middlebroook 7H9 肉湯培養(yǎng)基，并加600 μL Tween-80，高壓滅菌，加入增菌劑混勻，挑取菌落，接種于培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng)箱中孵育，待BCG 培養(yǎng)至合適濃度（A600=1.5）后進(jìn)行傳代。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要從BCG 培養(yǎng)瓶中吸取適量BCG，離心棄上清，用培養(yǎng)液重懸沉淀，計(jì)數(shù)。按細(xì)胞與BCG 個(gè)數(shù)1∶10 的比例感染，即感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）=10。

3 主要試劑與儀器

無(wú)谷氨酰胺DMEM 培養(yǎng)液和高糖DMEM 培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco；小牛血清、胎牛血清和PBS 均購(gòu)自Biological Industries；Middlebrook 7H9 肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自BD；OADC 增菌劑購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；胰酶購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；全蛋白酶提取試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展公司；蛋白定量（BCA 法）試劑盒和蛋白marker 購(gòu)自Thermo Fisher；兔抗鼠LC3B 和GLS1 抗體購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司；其他Ⅰ抗和Ⅱ抗均購(gòu)自Proteintech；熒光Ⅱ抗購(gòu)自Invitrogen；含DAPI防淬滅熒光封片劑購(gòu)自中杉金橋公司。凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad；Odyssey Sa 雙色紅外激光成像系統(tǒng)購(gòu)自L(fǎng)I-COR；Enspire熒光酶標(biāo)儀購(gòu)自PerkinElmer；熒光光學(xué)顯微鏡購(gòu)自麥克奧迪（Motic）實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司。

4 主要方法

4.1 siRNA 的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 根據(jù)GLS1 序列設(shè)計(jì)siRNA-GLS1 和siRNA-NC，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，具體序列見(jiàn)表1。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 細(xì)胞接種到 6 孔板中，每孔接入 1×106個(gè)細(xì)胞；貼壁后將轉(zhuǎn)染試劑（ZETA LIFE）與siRNA按1∶1 混合（6 μL 轉(zhuǎn)染試劑和6 μL siRNA），室溫放置10～15 min后，入細(xì)胞培養(yǎng)板中，24 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 siRNA序列Table 1. siRNA sequences

4.2 免疫熒光檢測(cè) 爬片：提前將20 mm 細(xì)胞蓋玻片置于12 孔板中，每孔接種5×104個(gè)細(xì)胞，貼壁后按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)處理細(xì)胞。制片步驟：棄去培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定20 min，1×的PBS 洗三次。0.5% Triton X-100 通透30 min，3%牛血清白蛋白室溫封閉1 h。37 ℃孵育Ⅰ抗（用3%牛血清白蛋白按照1∶200比例稀釋LC3B 抗體）3 h，1×PBS 洗3 次，37 ℃避光孵育熒光Ⅱ抗（用PBS 按照1∶500 稀釋?zhuān)? h，最后用含DAPI 的封片劑封片4 ℃保存，使用激光共聚焦顯微鏡觀察LC3的熒光表達(dá)并拍照。

4.3 細(xì)胞內(nèi)自噬流檢測(cè) 爬片與免疫熒光操作一致。轉(zhuǎn)染 siRNA 24 h 后，按 mRFP-GFP-LC3 串聯(lián)熒光蛋白腺病毒與細(xì)胞比例為20∶1加入病毒，2 h后更換培養(yǎng)液，待熒光強(qiáng)度達(dá)到最好時(shí)，進(jìn)行BCG 感染，固定，封片。通過(guò)熒光顯微鏡成像軟件觀察細(xì)胞紅色熒光、綠色熒光及兩者重合后的熒光圖，拍照計(jì)數(shù)并分析自噬流水平（黃色斑點(diǎn)代表自噬體，紅色斑點(diǎn)代表自噬溶酶體）。

4.4 Western blot 檢測(cè) 將RAW264.7 細(xì)胞以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板中，貼壁后處理細(xì)胞。使用全蛋白提取試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)操作，提取蛋白并用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。根據(jù)需要測(cè)定的蛋白大小配制分離膠，將各組蛋白按25 μg 定量上樣并進(jìn)行SDS-PAGE，然后用濕轉(zhuǎn)法將蛋白樣品從膠轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（300 mA，2 h）。5%脫脂牛奶37 ℃封閉1 h，4 ℃過(guò)夜孵育蛋白Ⅰ抗（1∶1 000 比例稀釋?duì)耡ctin、GLS1、LC3B、ATG5、ATG7 和 ATG12 抗體），TBST 洗滌 6 min×5 次，孵育Ⅱ抗 1 h（1∶5 000 稀釋Ⅱ抗），TBST 洗滌。使用化學(xué)發(fā)光液（ECL 發(fā)光）檢測(cè)蛋白條帶并通過(guò)GE 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀進(jìn)行曝光，結(jié)果用ImageJ軟件分析。

4.5 谷氨酰胺/谷氨酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 測(cè)定谷氨酸/谷氨酰胺含量實(shí)驗(yàn)用ELISA 試劑盒。將處理好的細(xì)胞用PBS 洗 2 遍，加入 RIPA 裂解，10 000 r/min 離心 15 min，取上清按照劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。為了消除細(xì)胞數(shù)量不同帶來(lái)的結(jié)果誤差，取裂解好的上清用BCA 定量其蛋白濃度，然后用谷氨酰胺/谷氨酸濃度除以蛋白濃度，得出最終數(shù)據(jù)。

4.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)自噬率 RAW264.7 細(xì)胞接種于6 孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染siRNA，24 h 后按照 MOI=10 的加入 BCG 感染 12 h。棄去完全培養(yǎng)液，PBS 洗 2 次。500 μL 胰酶消化 2 min，加 500 μL 完全培養(yǎng)液終止消化，800 r/min 離心5 min，棄上清。加入500 μL 帶有染料的Assay buffer，輕輕重懸，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育30 min，800 r/min，離心5 min，棄上清。用1 mL PBS 重懸，上機(jī)檢測(cè)，采用FlowJo 7.6.1軟件分析細(xì)胞自噬數(shù)據(jù)。詳細(xì)操作見(jiàn)CytoID檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均以3 個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。使用 GraphPad Prism 9.0 軟件中的One Way ANOVA 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并經(jīng)過(guò)Bonferroni校正。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 BCG 感染促進(jìn)了巨噬細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白LC3B的表達(dá)

為探究BCG 感染對(duì)RAW264.7 細(xì)胞自噬的影響，確定BCG誘導(dǎo)自噬發(fā)生的最佳感染條件，我們?cè)O(shè)置BCG 以不同MOI、不同感染時(shí)間感染RAW264.7細(xì)胞，利用Western blot 檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)志蛋白LC3B表達(dá)情況。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，BCG 感染可促進(jìn) LC3B 表達(dá)，在 MOI=10、感染時(shí)間為12 h時(shí)LC3B 的表達(dá)量最高，且顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），見(jiàn)圖 1。因此，我們確定 BCG 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞發(fā)生自噬的最佳感染條件為MOI=10且感染時(shí)間為12 h。

2 BCG感染促進(jìn)了巨噬細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺分解代謝

為了探究BCG 感染對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺分解代謝的影響，我們利用Western blot 檢測(cè)了BCG 不同MOI、不同感染時(shí)間感染RAW264.7 細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺分解代謝的關(guān)鍵酶GLS1 蛋白表達(dá)情況。Western blot 結(jié)果顯示，BCG 感染可顯著增加GLS1蛋白表達(dá)量（P＜0.01），隨著MOI和感染時(shí)間的增加，GLS1 的表達(dá)出現(xiàn)了先上升后下降的趨勢(shì)，在MOI=10、感染時(shí)間為12 h 時(shí)GLS1 的蛋白表達(dá)量最高，見(jiàn)圖2A、B。

我們還通過(guò)ELISA 檢測(cè)了巨噬細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺和谷氨酸的水平，發(fā)現(xiàn)BCG 感染后細(xì)胞內(nèi)谷氨氨酰胺含量顯著降低（P＜0.01），而谷氨酸含量顯著增加（P＜0.01），在感染時(shí)間為12 h、MOI=10 時(shí)變化最大，見(jiàn)圖2C～F。以上研究結(jié)果表明，BCG 感染促進(jìn)了巨噬細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺分解代謝。

3 敲減GLS1增加了巨噬細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺水平

如圖 3A 所示，與 NC 組相比，BCG 感染可上調(diào)RAW264.7 細(xì) 胞 GLS1 的 表 達(dá) ；與 BCG 組 相 比 ，siRNA-GLS1+BCG 組中 GLS1 的表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。如圖3B 所示，敲減GLS1后胞內(nèi)谷氨酰胺含量顯著增加（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，敲減GLS1下調(diào)了BCG 感染后GLS1 的表達(dá)，可用于研究GLS1 在BCG誘導(dǎo)細(xì)胞自噬中的作用。

4 敲減GLS1抑制了BCG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬

為探究敲減GLS1對(duì)BCG 感染的RAW264.7 細(xì)胞自噬的影響，我們利用Western blot 和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)了自噬相關(guān)蛋白表達(dá)和自噬率。Western blot 結(jié)果表明，與 BCG 組相比，siRNA-GLS1+BCG 組LC3B（P＜0.01）、beclin-1（P＜0.01）和 ATG12（P＜0.05）蛋白的表達(dá)量顯著降低，見(jiàn)圖4A。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，BCG 感染后巨噬細(xì)胞自噬率顯著上升（P＜0.01），而敲減GLS1使BCG感染后巨噬細(xì)胞自噬率顯著下降（P＜0.05），見(jiàn)圖4B。以上研究結(jié)果表明，敲減GLS1對(duì)BCG 感染誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞自噬具有抑制作用。

Figure 1. Effect of BCG infection on the expression of autophagy marker protein LC3B in macrophages. A：the LC3B protein expression in RAW264.7 cells with different multiplicities of infection（MOI）of BCG was detected by Western blot；B：the LC3B protein expression in RAW264.7 cells with BCG infection for different time was detected by Western blot. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control（Con）group.圖1 BCG感染對(duì)巨噬細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白LC3B表達(dá)的影響

5 剝奪谷氨酰胺對(duì)siRNA-GLS1 抑制的巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)因子的影響

上述研究結(jié)果顯示，敲減GLS1顯著增加巨噬細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺的含量，并伴隨自噬的減弱，提示敲減GLS1調(diào)控的細(xì)胞自噬與細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺含量增加相關(guān)，為進(jìn)一步驗(yàn)證，將培養(yǎng)液中的谷氨酰胺剝奪再處理細(xì)胞，利用Western blot 和免疫熒光檢測(cè)了自噬標(biāo)志蛋白LC3B 的表達(dá)。Western blot 和免疫熒光結(jié)果均顯示，在正常培養(yǎng)的RAW264.7 細(xì)胞中干擾GLS1顯著抑制了BCG 誘導(dǎo)的LC3B 表達(dá)（P＜0.05）；剝奪谷氨酰胺處理RAW264.7 細(xì)胞后，與BCG 組相比，siRNA-GLS1+BCG 組LC3B 的表達(dá)量無(wú)著變化，見(jiàn)圖5A、B。

利用 Western blot 檢測(cè) ATG5 和 ATG12 蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，ATG5和ATG12蛋白表達(dá)與LC3B表達(dá)結(jié)果一致，見(jiàn)圖5C。因此，敲減GLS1可能是通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺的含量來(lái)調(diào)控細(xì)胞自噬。

6 剝奪谷氨酰胺對(duì)siRNA-GLS1 抑制的巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬流的影響

我們用mRFP-GFP-LC3 串聯(lián)熒光蛋白腺病毒感染巨噬細(xì)胞，隨后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行處理，熒光顯微鏡觀察結(jié)果如圖6所示，在正常培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)，干擾GLS1后黃色和紅色LC3 陽(yáng)性熒光斑點(diǎn)的數(shù)量顯著減少（P＜0.05）；剝奪谷氨酰胺處理RAW264.7 細(xì)胞后，敲減GLS1并沒(méi)有影響黃色和紅色的LC3 陽(yáng)性熒光斑點(diǎn)數(shù)量。結(jié)合前面的結(jié)果，本研究認(rèn)為，在BCG 感染巨噬細(xì)胞RAW264.7過(guò)程中，敲減GLS1后可通過(guò)增加巨噬細(xì)胞內(nèi)的谷氨酰胺含量抑制BCG誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。

討 論

由于Mtb 感染持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，抗生素治療存在不良影響，以及耐多藥Mtb 的出現(xiàn)，目前可用于治療結(jié)核病的方法療效逐漸變差；同時(shí)由于新冠肺炎大流行的發(fā)生，醫(yī)療資源轉(zhuǎn)移，結(jié)核病的預(yù)防診斷和治療服務(wù)難度大幅增加［8-9］。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)新的靶點(diǎn)和開(kāi)發(fā)新的策略和藥物來(lái)治療結(jié)核病。

巨噬細(xì)胞是宿主免疫防御的前哨，Mtb作為一種胞內(nèi)寄生菌，感染巨噬細(xì)胞后會(huì)觸發(fā)一系列信號(hào)事件，為了自身利益而劫持宿主的先天免疫途徑，影響細(xì)胞凋亡、自噬和壞死等過(guò)程，其中自噬不僅可以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)還可以清除入侵的病原菌［10-11］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)BCG 可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生自噬，且存在時(shí)間依賴(lài)性。巨噬細(xì)胞免疫功能的執(zhí)行并不是一個(gè)獨(dú)立的進(jìn)程，其發(fā)生會(huì)受到代謝通路的影響。有研究表明，谷氨酰胺代謝在抵抗病原體的免疫應(yīng)答中起著至關(guān)重要的作用，并且最新的報(bào)道顯示細(xì)胞谷氨酰胺代謝與針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的有效宿主反應(yīng)有關(guān)［4，10］。GLS1 是谷氨酰胺代謝的關(guān)鍵酶和限速酶。目前研究發(fā)現(xiàn)，Mtb 感染的骨髓巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived macrophage，BMDM）和人巨噬細(xì)胞中GLS1 表達(dá)上調(diào)；另外，BCG 體外刺激人單核細(xì)胞后，參與谷氨酰胺代謝的氨酰胺酶和谷氨酸脫氫酶在單核細(xì)胞中也上調(diào)［12-13］。本研究發(fā)現(xiàn)，BCG感染巨噬細(xì)胞 RAW264.7 后，GLS1 表達(dá)也顯著上調(diào)，在 BCG 的MOI=10、感染時(shí)間為12 h 時(shí)表達(dá)量最高，與已報(bào)道的研究結(jié)果一致。我們還發(fā)現(xiàn)BCG 感染巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺含量顯著減少。有研究報(bào)道在Mtb感染BMDM 的早期（感染12 h），谷氨酰胺被迅速而廣泛地消耗［14］，與本研究結(jié)果一致。

Figure 2. The effect of BCG infection on glutamine catabolism in macrophages. A：the protein expression of GLS1 in RAW264.7 cells with different multiplicities of infection（MOI）of BCG was detected by Western blot；B：the protein expression of GLS1 in RAW264.7 cells with BCG infection for different time was detected by Western blot；C and D：the effect of BCG at different MOI for different time on intracellular glutamine content in RAW264.7 cells was detected by ELISA；E and F：the effect of BCG at different MOI for different time on intracellular glutamate content in RAW264.7 cells was detected by ELISA. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control（Con）group.圖2 BCG感染對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺分解代謝的影響

Figure 3. Effect of GLS1 knockdown on glutamine content in BCG-infected macrophages. A：establishment of GLS1 knockdown model；B：ELISA detection of glutamine content. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs NC group；#P＜0.05 vs BCG group.圖3 敲減GLS1對(duì)BCG感染的巨噬細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺含量的影響

Figure 4. Effect of GLS1 knockdown on BCG-induced macrophage autophagy. A：Western blot detection of LC3B，beclin-1 and ATG12 protein expression；B：flow cytometry detection of RAW264.7 cell autophagy rate. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NC group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs BCG group.圖4 敲減GLS1對(duì)BCG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬的影響

Figure 5. Effects of glutamine deprivation on expression of autophagy-related proteins in macrophages transfected with siRNA-GLS1.A：Western blot was used to detect the LC3B protein expression in RAW264.7 cells；B：rabbit anti-mouse LC3B antibody was used for immunofluorescence staining，and the nucleus was stained with DAPI（blue）for counterstaining（×400）；C：Western blot was used to detect the ATG5 and ATG12 protein expression. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NC group；#P＜0.05 vs BCG group.圖5 剝奪谷氨酰胺對(duì)siRNA-GLS1轉(zhuǎn)染的巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Figure 6. Immunofluorescence observation of the effect of glutamine deprivation on autophagic flux in macrophages inhibited by siRNA-GLS1（×800）. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs BCG group.圖6 免疫熒光觀測(cè)剝奪谷氨酰胺對(duì)siRNA-GLS1抑制的巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬流的影響

谷氨酰胺是最豐富的游離氨基酸之一，被認(rèn)為是炎癥和許多其他應(yīng)激條件下的必需氨基酸，口糧中添加L-谷氨酰胺可激活小鼠腸道固有免疫，增強(qiáng)疫苗免疫小鼠的免疫應(yīng)答，減輕氧化應(yīng)激［15-16］。Mortimore 等［17］的研究表明，氨基酸可以調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬；Zhu等［18］的研究表明，谷氨酰胺代謝參與調(diào)控細(xì)胞自噬。GLS1 作為谷氨酰胺代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，增加其表達(dá)可實(shí)現(xiàn)谷氨酰胺的高分解率。因此，細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺含量會(huì)受到GLS1 表達(dá)量和活性的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，敲減巨噬細(xì)胞內(nèi)GLS1的表達(dá)顯著增加了細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺的含量，并伴隨自噬的減弱，因此我們推測(cè)GLS1 調(diào)控的細(xì)胞自噬與細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺含量增加相關(guān)。進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果表明，在BCG 感染巨噬細(xì)胞RAW264.7 過(guò)程中，敲減GLS1的表達(dá)可通過(guò)增加巨噬細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺含量而抑制細(xì)胞自噬。目前有研究發(fā)現(xiàn)，敲減GLS1后，細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺分解代謝的確會(huì)受到影響，谷氨酰胺代謝物能夠產(chǎn)生谷胱甘肽和NADPH 來(lái)拮抗ROS，而ROS 又可以直接激活自噬，進(jìn)而抑制細(xì)胞自噬［19］。另外，谷氨酰胺缺乏后，mTOR 的激活會(huì)減少，可通過(guò)抑制mTOR 來(lái)增強(qiáng)自噬［20］。

綜上所述，我們的研究初步探究了GLS1 在BCG感染的巨噬細(xì)胞自噬中的調(diào)控作用，但該過(guò)程的潛在分子機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。本研究為Mtb 致病機(jī)制的解讀提供新的視角與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。