姜 敏， 李露露▲， 吳 桐， 李成沖， 王宇晨， 焦 宇， 劉藝涵，馬淑麗， 鄭曉宇， 趙容杰△， 趙正林△

（1齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院精神衛(wèi)生學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

抑郁癥（depression）主要表現(xiàn)為持續(xù)的悲傷情緒，并伴有一定的日常功能缺陷，是導(dǎo)致放棄生命的主要原因，現(xiàn)已成為世界范圍內(nèi)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題［1］。酒精作為一種非特異性藥物，也是最常被濫用的藥物之一［2］。酒精濫用會(huì)導(dǎo)致中毒和成癮，戒斷后可導(dǎo)致一系列情感障礙，誘發(fā)焦慮癥或抑郁癥等精神疾病。其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜尚無(wú)明確的理論說(shuō)明，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為去甲腎上腺素和多巴胺等單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的缺乏與抑郁癥的發(fā)病相關(guān)［3］，因此臨床上利用單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)治療抑郁癥。但由于該類(lèi)藥物的研發(fā)局限于發(fā)病機(jī)制，其適用范圍十分狹窄。酒精戒斷所致抑郁癥的病理變化發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激使大腦特定部位尤其是海馬中大量神經(jīng)細(xì)胞凋亡，抑制神經(jīng)細(xì)胞再生，誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)的退行性改變會(huì)導(dǎo)致抑郁癥［4-5］。但是目前還沒(méi)有治療效果良好的酒精戒斷所致抑郁癥藥物。三白草酮（sauchinone，Sau）是從傳統(tǒng)中草藥三白草中提取的單體類(lèi)化合物，具有清熱解毒、抗炎抗氧化功效，具有細(xì)胞保護(hù)作用，廣泛用于心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)疾病的治療。其中抗氧化作用對(duì)神經(jīng)組織的再生與營(yíng)養(yǎng)、保護(hù)作用備受學(xué)者的關(guān)注［6-8］。本實(shí)驗(yàn)首先建立動(dòng)物模型從行為學(xué)和氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化觀察了Sau 對(duì)酒精戒斷大鼠的抑郁樣行為的改善作用，同時(shí)利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)氧化應(yīng)激信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步探討Sau 的抗抑郁作用及其機(jī)制，為Sau 抗抑郁藥物的研發(fā)提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 動(dòng)物

雄性 SPF 級(jí) Sprague-Dawley 大鼠 32 只，8 周齡，體重（210±10）g，由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，使用許可證號(hào)：SYXK（黑）2021-013。所有大鼠均在專(zhuān)用IVC 鼠籠，在溫度20～25 ℃，濕度30%～35%自動(dòng)空氣清潔設(shè)備的條件下飼養(yǎng)，自由攝食。

2 HT22細(xì)胞

小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞系HT22 購(gòu)自BeNa Culture Collection，培養(yǎng)在含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的 Dulbecco's modified Eagle's medium（DMEM）高糖培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育生長(zhǎng)。

3 主要藥品與試劑

Sau 購(gòu)于湖州展舒生物科技有限公司，純度＞98%；MTT 試劑盒、總蛋白測(cè)定（BCA 法）試劑盒、Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、兔抗大鼠核因子E2 相 關(guān) 因 子 2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）抗體和兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗大鼠血紅素加氧酶 1（heme oxygenase-1，HO-1）抗體購(gòu)于 Santa Cruz；總超氧化物岐化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；Alexa FlourTM488 goat anti-rabbit IgG（H+L）購(gòu)自Life Technologies；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）試劑購(gòu)于索萊寶科技有限公司。

懸尾實(shí)驗(yàn)（tail suspension test，TST）分析系統(tǒng)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（forced swimming test，F(xiàn)ST）分析系統(tǒng)（上海軟隆科技發(fā)展有限公司）；Gen5 酶標(biāo)儀（BioTek）；倒置熒光顯微鏡（ZEISS）；FluorChem-E 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（ProteinSimple）；高電流電泳儀（Bio-Rad）：FACSCalibur流式細(xì)胞儀（BD）。

4 主要方法

4.1 動(dòng)物模型的建立、分組、給藥方法 取雄性健康SD 大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照（control）組、酒精戒斷模型（model）組、低劑量Sau 治療（low-sau）組和高劑量Sau 治療（high-Sau）組，每組8 只。除正常對(duì)照組外，其余各組每日1 次腹腔注射酒精3 g/kg，正常對(duì)照組給予等體積的生理鹽水代替酒精，連續(xù)28 d 后停止酒精注射，戒斷3 d 制作酒精戒斷大鼠模型［9］。在戒斷 3 d 期間，Sau 低劑量治療組（5 mg/kg）和高劑量治療組（25 mg/kg）分別每日灌胃1 次［10］，正常對(duì)照組和模型組灌胃生理鹽水。末次給藥30 min 后，利用蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)（sucrose preference test，SPT）、TST 和FST 進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)，觀察各組大鼠行為學(xué)變化。

4.2 SPT 主要用于評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物快感缺失的程度判斷其抑郁行為。實(shí)驗(yàn)時(shí)，各大鼠按照1籠1鼠單獨(dú)飼養(yǎng)。每只鼠籠放置2 瓶1%蔗糖溶液，使其自由攝取。24 h后用相同規(guī)格純凈水置換其中1瓶蔗糖，再次自由攝取24 h 后，所有動(dòng)物停止進(jìn)食進(jìn)水并持續(xù)24 h。隨后，每個(gè)籠子提供1瓶預(yù)量體積的純凈水和1 瓶預(yù)量體積的1%蔗糖溶液，大鼠自由攝取1 h 后，取走兩瓶并分別測(cè)定體積，計(jì)算每只大鼠的蔗糖偏好率［11］。蔗糖偏好率（%）=蔗糖飲用體積（mL）［/蔗糖飲用體積（mL）+純水飲用體積（mL）］×100%。

4.3 TST 主要以動(dòng)物在無(wú)可回避的壓迫環(huán)境中產(chǎn)生絕望的不動(dòng)狀態(tài)來(lái)評(píng)估動(dòng)物的抑郁樣行為。將各組大鼠先放入安靜且光線(xiàn)柔和穩(wěn)定的操作間內(nèi)適應(yīng)1 h。懸尾檢測(cè)裝置放置于相同環(huán)境操作間內(nèi)，安裝好攝像頭并連接電腦。將大鼠尾部距末端約2 cm處用膠帶固定，倒掛于裝置懸掛桿上，頭距箱底部約30 cm，兩側(cè)用擋板隔開(kāi)動(dòng)物視線(xiàn)，底部放置用于收集糞便和尿液的可拆卸托盤(pán)，開(kāi)始計(jì)時(shí)和錄像。分析5 min 內(nèi)各大鼠的不動(dòng)狀態(tài)的總時(shí)間。以大鼠放棄掙扎，呈不動(dòng)狀態(tài)記作不動(dòng)［12］。每只大鼠僅測(cè)試一次，且每測(cè)試完一次都要進(jìn)行排泄物和氣味的清除，以避免影響下次測(cè)試結(jié)果。

4.4 FST 以動(dòng)物在局限壓迫環(huán)境中放棄掙扎的不動(dòng)狀態(tài)來(lái)評(píng)價(jià)抑郁樣行為。于實(shí)驗(yàn)操作間內(nèi)安置好各儀器設(shè)備并連接電腦，大鼠適應(yīng)環(huán)境1 h后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。將大鼠放入一水深40 cm的透明圓柱缸內(nèi)（直徑30 cm，高60 cm），水溫（24±1）℃。該實(shí)驗(yàn)分為適應(yīng)階段（2 min）和測(cè)試階段（5 min）兩個(gè)部分，記錄測(cè)試階段大鼠不動(dòng)時(shí)間。以大鼠不掙扎，呈漂浮狀態(tài)，可僅頭部在水面運(yùn)動(dòng)，后肢輕微擺動(dòng)記作為不動(dòng)［13］。每只大鼠測(cè)試完畢后均要清洗玻璃圓桶并更換同樣溫度的水，避免干擾下次實(shí)驗(yàn)。每只大鼠僅測(cè)試一次，每次測(cè)試完畢后需將大鼠擦干保暖后再放回原籠中。

4.5 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè) 上述行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，將大鼠進(jìn)行安樂(lè)死，迅速剝離海馬組織并稱(chēng)重，按10%的配制比例于生理鹽水中充分勻漿，850×g離心10 min，將海馬組織勻漿上清液凍存于-80 ℃超低溫冰箱中備用。然后按試劑盒操作說(shuō)明分別檢測(cè)海馬組織中T-SOD、MDA、CAT和GSH水平。

4.6 Western blot 檢測(cè)蛋白 將收集的海馬組織勻漿上清用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量，經(jīng)SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉1.5 h，分別加入特異性Ⅰ抗4 ℃反應(yīng)24 h，再加入Ⅱ抗孵育2 h 后，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色。用AlphaView SA 3.4進(jìn)行灰度值分析，用GAPDH作為內(nèi)參照。

4.7 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力 HT22 細(xì)胞傳代培養(yǎng)穩(wěn)定后，在96 孔板每孔接種100 μL（2×103個(gè)）細(xì)胞，加入不同濃度（50、100、200、400、700 和1 000 μmol/L）的 H2O2培養(yǎng) 24 h，加入不同濃度（3、10、30 和 60 μmol/L）的 Sau 培養(yǎng) 24 h，每組設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔。然后加入 MTT 孵育 4 h 以形成甲臜結(jié)晶，加入 100 μL 甲臜溶解液繼續(xù)孵育4 h 結(jié)晶完全溶解后，用酶標(biāo)儀于570 nm 處測(cè)定吸光度（A）值并計(jì)算各組的細(xì)胞存活率，確定最佳H2O2濃度和Sau干預(yù)濃度。

4.8 HT22 細(xì)胞分組、給藥以及氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè) 細(xì)胞分為正常對(duì)照組（control 組）、模型組（H2O2組）、低劑量Sau 治療組（low-Sau 組）和高劑量Sau 治療組（high-Sau 組）。低、高劑量Sau 治療組細(xì)胞分別予以 3 和 30 μmol/L Sau 預(yù)處理孵育 2 h，除了正常對(duì)照組外其他組以最佳濃度的H2O2處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后將細(xì)胞洗滌3次，加入100 μL生理鹽水勻漿，600×g離心10 min，取上清按試劑盒操作說(shuō)明用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。

4.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激模型后，按試劑盒說(shuō)明要求，離心收集細(xì)胞，用PBS 重懸計(jì)數(shù)5 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，先后加入Annexin V-FITC 和碘化丙啶（propidium iodide，PI），室溫避光孵育20 min，1 h 內(nèi)利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

4.10 免疫熒光實(shí)驗(yàn) 將HT22 細(xì)胞爬片到經(jīng)組織培養(yǎng)物處理的圓形玻片上，分為正常對(duì)照組（control組）、模型組（H2O2組）和高劑量Sau治療組（high-Sau+H2O2組）。H2O2誘導(dǎo)建模處理后經(jīng)10%中性甲醛固定，5%BSA 封閉爬片，加入Nrf2 Ⅰ抗4 ℃孵育過(guò)夜，Alexa FlourTM488 goat anti-rabbit IgG Ⅱ抗37 ℃孵育1 h，DAPI 核染色10 min，抗熒光淬滅劑封片后用倒置熒光顯微鏡觀察。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用GraphPad Prism 7.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差（one-way ANOVA）分析，組間兩兩比較采用Newman-Keuls 法進(jìn)行檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Sau對(duì)酒精戒斷大鼠抑郁樣行為的影響

如表1 可知，蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠蔗糖偏好率顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.01），與模型組比較，低劑量治療組和高劑量治療組蔗糖偏好率顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）；懸尾和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠不動(dòng)時(shí)間均顯著升高（P＜0.01），與模型組比較，低劑量治療組和高劑量治療組的不動(dòng)時(shí)間均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中高劑量治療組不動(dòng)時(shí)間顯著低于低劑量治療組（P＜0.01），且有劑量依賴(lài)性。

表1 Sau對(duì)酒精戒斷大鼠行為的影響Table 1. Effects of sauchinone（Sau）on the behaviors of alcohol withdrawal rats（Mean±SD. n=8）

2 Sau對(duì)酒精戒斷大鼠的大腦海馬組織中氧化應(yīng)激水平的影響

如表2 所示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠TSOD、CAT 和 GSH 水平均顯著降低（P＜0.01），而MDA 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，低劑量治療組和高劑量治療組T-SOD、CAT 和GSH 水平均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），MDA 水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；其中高劑量治療組CAT 水平顯著高于低劑量治療組（P＜0.05），且有劑量依賴(lài)性。

表2 Sau對(duì)酒精戒斷大鼠海馬氧化應(yīng)激水平的影響Table 2. Effects of sauchinone（Sau）on the level of oxidative stress in the hippocampus of alcohol withdrawal rats（Mean±SD. n=8）

3 Sau對(duì)酒精戒斷大鼠海馬組織中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響

如圖1所示，模型組大鼠海馬組織中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.01）；與模型組比較，低劑量Sau 治療組和高劑量Sau 治療組大鼠海馬組織中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。

Figure 1. Effects of sauchinone（Sau）on the protein expression of Nrf2 and HO-1 in the hippocampus of alcohol withdrawal rats.Mean±SD. n=8.##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.圖1 Sau對(duì)酒精戒斷大鼠海馬組織Nrf2和HO-1表達(dá)的影響

4 Sau對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞活力的影響

如圖2 所示，H2O2和Sau 單獨(dú)處理后觀察對(duì)細(xì)胞活力的影響，選擇H2O2最佳處理濃度為200 μmol/L，Sau 預(yù)處理濃度分別為低劑量組3 μmol/L 和高劑量組為30 μmol/L。后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，H2O2模型組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，低劑量Sau 組和高劑量Sau 組HT22 細(xì)胞的活力均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。

Figure 2. Effects of sauchinone（Sau）on the viability of H2O2-induced HT22 cells. Mean±SD. n=3.##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.圖2 Sau對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞活力的影響

5 Sau對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞凋亡水平的影響

如圖3 所示，與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，低劑量Sau組和高劑量Sau 組細(xì)胞凋亡率均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

Figure 3. Effects of sauchinone（Sau）on the apoptosis of H2O2-induced HT22 cells. Mean±SD. n=3.##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.圖3 Sau對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞凋亡水平的影響

6 Sau 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HT22 細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響

如表3 所示，與正常對(duì)照組比較，模型組T-SOD水平顯著降低（P＜0.01），MDA 水平顯著升高（P＜0.01），與模型組比較，Sau低劑量組和高劑量組細(xì)胞內(nèi)T-SOD 水平顯著升高（P＜0.05，P＜0. 01），MDA 水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表3 Sau對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響Table 3. Effects of sauchinone（Sau）on the level of oxidative stress in H2O2-induced HT22 cells（Mean±SD. n=8）

7 Sau 對(duì) H2O2 誘 導(dǎo) 的 HT22 細(xì) 胞 中 Nrf2 表 達(dá) 的影響

如圖4 所示，正常對(duì)照組中，Nrf2 主要存在于胞質(zhì)內(nèi)，胞核中表達(dá)極少，而模型組細(xì)胞的胞核中Nrf2的表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01），與模型組比較，Sau高劑量組細(xì)胞核中的Nrf2的表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。

討 論

Figure 4. Effects of sauchinone（Sau）on the expression of Nrf2 in H2O2-induced HT22 cells. Red arrow：Nrf2 expressed in nuclei.Scale bar=100 μm. Mean±SD. n=3.##P＜0.01 vs control group；**P＜0.01 vs model group.圖4 Sau對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞中Nrf2表達(dá)的影響

長(zhǎng)期大量的飲酒會(huì)引起酒精依賴(lài)同時(shí)戒斷會(huì)導(dǎo)致睡眠困難、焦慮和抑郁等精神癥狀，其發(fā)病率逐年增加，給社會(huì)和個(gè)人的生活帶來(lái)嚴(yán)重的危害［14］。嚙齒類(lèi)動(dòng)物天生對(duì)甜食有強(qiáng)烈的欲望，通過(guò)對(duì)蔗糖偏好測(cè)試能衡量動(dòng)物的享樂(lè)狀態(tài)或者感受快樂(lè)的能力，這是判斷抑郁的基本特征之一。同時(shí)，懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)是通過(guò)動(dòng)物的求生欲望與行為的絕望程度評(píng)價(jià)抑郁樣行為的研究方法［15-16］。本實(shí)驗(yàn)行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組大鼠的蔗糖偏好率顯著低于正常對(duì)照組，這表明酒精戒斷后大鼠對(duì)蔗糖快感顯著降低，TST 和FST 中不動(dòng)時(shí)間顯著增加，證明成功誘導(dǎo)典型的酒精戒斷抑郁大鼠模型。同時(shí)研究觀察到低、高劑量Sau治療均有效減少酒精戒斷大鼠的抑郁樣行為。應(yīng)激反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致情感的變化，有研究表明，海馬具有處理、記錄和儲(chǔ)存分析記憶的功能，是壓力反應(yīng)和情緒的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，海馬的氧化應(yīng)激水平對(duì)焦慮和抑郁有重要的調(diào)節(jié)作用［17-18］?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）水平的增加會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一系列氧化應(yīng)激損傷。T-SOD 和CAT 等抗氧化酶在氧化應(yīng)激中處于一線(xiàn)防御機(jī)制，T-SOD 能清除超氧陰離子而對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用，而MDA 升高是氧化應(yīng)激時(shí)細(xì)胞損傷的一個(gè)典型指標(biāo)［19-20］。CAT是機(jī)體內(nèi)的一種末端氧化酶，能清除細(xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生的H2O2，從而保護(hù)細(xì)胞免受傷害。而GSH 是一種抗氧化劑，它能防止由活性氧物質(zhì)導(dǎo)致的細(xì)胞組分損害。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，酒精戒斷能顯著降低海馬組織中 T-SOD、CAT 和 GSH 水平，增加 MDA 水平，這表明酒精戒斷破壞體內(nèi)氧化與抗氧化的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)誘導(dǎo)海馬氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，而Sau干預(yù)后上述氧化應(yīng)激指標(biāo)具有良好的改善作用。因此分析行為學(xué)和氧化應(yīng)激的結(jié)果顯示，酒精戒斷大鼠產(chǎn)生抑郁樣行為的主要原因是海馬組織的氧化應(yīng)激所致，而在戒斷期間給與Sau不僅能糾正氧化應(yīng)激水平，也能改善大鼠的抑郁樣行為。同時(shí)在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中通過(guò)凋亡和氧化應(yīng)激水平的檢測(cè)也得到一致的結(jié)果。

多數(shù)學(xué)者關(guān)注抑郁癥的發(fā)病機(jī)制及其治療的研究，其中認(rèn)為氧化應(yīng)激對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和損傷作用是常見(jiàn)的機(jī)制之一。長(zhǎng)期的酒精依賴(lài)或戒斷導(dǎo)致持續(xù)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的ROS，最終使體內(nèi)氧化與抗氧化調(diào)節(jié)失衡，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡或損傷。在此過(guò)程中Nrf2 發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。Nrf2是一種新型的核轉(zhuǎn)錄因子，能維持體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)的平衡［21］。文獻(xiàn)表明，Nrf2 常定位于胞質(zhì)中，與伴侶蛋白 Kelch-like ECH 相關(guān)蛋白 1（Keap1）相連，當(dāng)使Nrf2 從Keap1 解離時(shí)，它便移位到細(xì)胞核，與靶基因上的抗氧化反應(yīng)元件（antioxident responseelement，ARE）結(jié)合激活抗氧化防御系統(tǒng)［22-23］。在氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，ROS 能促進(jìn)Nrf2 進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與ARE 結(jié)合，上調(diào)HO-1的表達(dá)發(fā)揮細(xì)胞的自我保護(hù)作用。很多研究表明小鼠Nrf2基因敲除后活性氧及氧化應(yīng)激水平顯著升高［24］。HO-1 是受 Nrf2 調(diào)節(jié)的主要酶，其啟動(dòng)子上含有較強(qiáng)的ARE，可以通過(guò)多種方式發(fā)揮很強(qiáng)的抗氧化作用。因此認(rèn)為調(diào)控Nrf2 和HO-1 可以作為酒精戒斷大鼠抑郁樣行為的新的靶點(diǎn)［25-28］。本研究顯示，酒精戒斷大鼠海馬組織中Nrf2和HO-1 的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，而Sau 的干預(yù)增加其表達(dá)最終減少大鼠的抑郁樣行為。同時(shí)利用體外實(shí)驗(yàn)也表明，氧化應(yīng)激時(shí)凋亡率顯著增高且細(xì)胞核內(nèi)Nrf2的高表達(dá)失去氧化與抗氧化的相對(duì)平衡導(dǎo)致細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制紊亂。以上結(jié)果證明Sau 能緩解體內(nèi)氧化應(yīng)激水平而改善大鼠的抑郁樣行為，其作用機(jī)制涉及Nrf2/HO-1信號(hào)通路。

近年來(lái)，中草藥及其提取物廣泛應(yīng)用于各種情緒障礙相關(guān)的精神疾病的治療，與常用的苯二氮卓類(lèi)藥物比較表現(xiàn)出副作用少療效好的獨(dú)特優(yōu)越性，在各種原因所致焦慮和抑郁癥的治療中顯得非常重要。Sau 是從傳統(tǒng)中草藥三白草中提取的單體類(lèi)化合物，具有清熱解毒、消腫利尿和抗炎之功效，通過(guò)抗炎和抗氧化等機(jī)制對(duì)腫瘤、肝炎、神經(jīng)退行性病變、急性肺損傷、氣道變應(yīng)性疾病及細(xì)菌感染等具有良好的治療作用，尤其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的抗氧化作用及其保護(hù)作用備受關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)物與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方式，探討Sau對(duì)酒精戒斷大鼠抑郁樣行為的改善作用及其機(jī)制。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示Sau 干預(yù)后，行為學(xué)和氧化應(yīng)激指標(biāo)顯著改善，顯著上調(diào)海馬組織中Nrf2 及其抗氧化基因產(chǎn)物HO-1 的水平。在體外的實(shí)驗(yàn)中也觀察到Sau 能夠顯著改善氧化應(yīng)激所致HT22 細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，Nrf2從Keap1 解離后于胞質(zhì)向胞核內(nèi)的顯著轉(zhuǎn)位參與了該機(jī)制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Sau對(duì)酒精戒斷大鼠抑郁樣行為具有顯著的改善作用，其主要機(jī)制可能通過(guò)Nrf2/HO-1 信號(hào)通路的調(diào)控，調(diào)節(jié)大腦海馬組織的氧化應(yīng)激水平介導(dǎo)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。同時(shí)為臨床上抗抑郁藥物的研發(fā)提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但由于針對(duì)Sau在該疾病作用機(jī)制研究報(bào)道的缺乏，且大腦各區(qū)域作用效應(yīng)交錯(cuò)復(fù)雜，系統(tǒng)給藥在藥物作用靶點(diǎn)定位上又具有一定的局限性，我們暫時(shí)還無(wú)法提供更為全面的數(shù)據(jù)，后續(xù)我們將在本研究基礎(chǔ)上，采用大腦定位埋管微量注射和藥物示蹤等方法，從大腦各區(qū)域及各通路做進(jìn)一步探索，為該類(lèi)藥物的研發(fā)提供更為深入而可靠的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。