劉 薇， 趙佳琪， 唐 娜， 王臘梅， 何麗娟， 李佳怡， 鐘 華， 何 芳△

（1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院國(guó)家衛(wèi)健委中亞高發(fā)病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，新疆 石河子 832000；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，新疆 石河子 832000）

高血壓是一種臨床上常見(jiàn)的心血管疾病之一，也是導(dǎo)致腦卒中、心衰、腎衰等疾病的重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［1］。長(zhǎng)期的血壓控制不佳可引起全身多處靶器官的損傷，其中腎損傷是常見(jiàn)的高血壓并發(fā)癥之一，也是造成腎衰竭的主要病因［2］。

大量研究表明，慢性低度炎癥是高血壓發(fā)生和發(fā)展的基本過(guò)程［3］。鈣敏感受體（calcium-sensing receptor，CaSR）作為作為G 蛋白偶聯(lián)受體（G-proteincoupled receptor，GPCR）超家族中C 亞族成員之一，廣泛表達(dá)于全身多處組織中，參與多種心血管疾病的發(fā)病機(jī)制［4］。巨噬細(xì)胞是終末分化的炎癥細(xì)胞，在炎性疾病中有兩種不同的極化狀態(tài)，即促炎型的M1型巨噬細(xì)胞和抗炎型的M2型巨噬細(xì)胞［5］。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）是先天性免疫反應(yīng)的重要參與者和執(zhí)行者，可在感染性疾病或細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下引起慢性炎癥，有限的資料也表明巨噬細(xì)胞極化和NLRP3炎癥小體的激活參與高血壓的發(fā)生發(fā)展［6］。本團(tuán)隊(duì)前期研究證明，在自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）模型中，CaSR 參與高血壓誘發(fā)的心肌重塑［7］；此外，在巨細(xì)胞病毒誘發(fā)的高血壓小鼠模型中，NLRP3炎癥小體參與血管重構(gòu)［8］。然而，CaSR在SHR 中是否可以通過(guò)調(diào)控NLRP3，參與高血壓腎損傷進(jìn)展，目前尚不清楚。

本研究以SHR 為研究對(duì)象，從免疫反應(yīng)即巨噬細(xì)胞極化角度發(fā)現(xiàn)并部分闡明CaSR 在高血壓腎損傷中的作用及其機(jī)制，以期為高血壓腎損傷提供藥物作用新靶標(biāo)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

15 周齡雄性Wistar Kyoto（WKY）大鼠和SHR 購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，批準(zhǔn)號(hào)：SCXK（京）2016-0006，大鼠體重范圍在250～280 g 之間。給大鼠提供充足的食物和水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為WKY 組、SHR+生理鹽水（normal saline，NS）組和SHR+R568（CaSR 激動(dòng)劑）組，每組8只。R568 的劑量為 1.2 mg·kg-1·d-1，對(duì)照組給予體積的生理鹽水，采用腹腔注射的方式連續(xù)干預(yù)8 周（24 周齡），收集各組大鼠腎臟進(jìn)行檢測(cè)。本研究經(jīng)石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，嚴(yán)格按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用指南》對(duì)動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

2 主要試劑和儀器

2.1 試劑 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Masson染色試劑盒購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司；過(guò)碘酸-雪夫（periodic acid-Schiff，PAS）染色試劑盒購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司；CaSR 抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；PLC 抗體購(gòu)自Santa Cruz；CD68（巨噬細(xì)胞標(biāo)志物）抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；CD86（M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物）和CD206（M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物）抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NAGL）抗體購(gòu)自博士德生物工程有限公司；Western blotting 制膠液購(gòu)自購(gòu)自廣州賽國(guó)生物科技有限公司；Trizol 購(gòu)自Thermo Fisher；PCR引物購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自Qiagen；擬鈣劑R568購(gòu)自R&D Systems。

2.2 儀器 低溫超速離心機(jī)和凝膠成像分析儀器（Thermo）；PCR 核酸擴(kuò)增儀（TaKaRa）；TH4-200 顯微鏡光源和IX73 顯微鏡（OLYMPUS）；7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems）；電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（北京六一公司）；無(wú)創(chuàng)測(cè)壓裝置（成都泰盟公司）。

3 主要實(shí)驗(yàn)方法

3.1 無(wú)創(chuàng)血壓監(jiān)測(cè) 大鼠在室內(nèi)安靜5 min，連接測(cè)壓裝置，先檢測(cè)儀器氣密性，然后設(shè)置儀器溫度為24 ℃，即可測(cè)壓。測(cè)量各組大鼠收縮壓（systolic blood pressure，SBP）和舒張壓（diastolic blood pressure，DBP），計(jì)算平均動(dòng)脈壓（mean arterial pressure，MAP），每組小鼠隨機(jī)選取5只并記錄血壓。

3.2 RNA 提取與qRT-PCR 按照Trizol說(shuō)明書(shū)的操作步驟提取腎組織總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒中推薦的反應(yīng)比例制備20 μL 的反應(yīng)體系，合成cDNA，之后利用ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)各組大鼠腎臟中目的基因的表達(dá)，引物序列如表1所示。

3.3 HE 染色 腎臟組織置于4%中性組織固定液中，48 h后包埋切片（3 μm），用HE染液染色，在顯微鏡下隨機(jī)選取每個(gè)組織的5 個(gè)顯微鏡場(chǎng)（×400）觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)改變，觀察具體的腎臟病變情況。

3.4 Masson染色 腎臟組織置于4%的中性組織固定液中，48 h后進(jìn)行包埋切片（3 μm），用Masson三色染液進(jìn)行操作，在顯微鏡下觀察每個(gè)組織的藍(lán)色纖維化區(qū)域，隨機(jī)選擇5 個(gè)鏡下視野（×400）進(jìn)行拍照，觀察腎臟纖維化情況。

3.5 免疫組織化學(xué)染色 腎臟組織進(jìn)行固定，包埋切片（3 μm）。NAGL、CD68 和PLC 抗體（1∶100）過(guò)夜孵育，次日滴加相應(yīng)Ⅱ抗，0.5 h 后進(jìn)行DAB 顯色反應(yīng)。在顯微鏡下觀察每個(gè)組織的棕色區(qū)域，隨機(jī)選擇5 個(gè)鏡下視野（×400）進(jìn)行拍照，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測(cè)定積分吸光度，求其平均值。

3.6 PAS 染色 按照PAS 試劑盒說(shuō)明書(shū)染色，在顯微鏡下觀察每個(gè)組織的紫紅色區(qū)域，隨機(jī)選擇5 個(gè)鏡下視野（×400）進(jìn)行拍照，觀察腎臟的病理改變。

3.7 免疫熒光染色 腎臟組織固定在中性固定液中48 h，再浸泡在低濃度酒精中，后續(xù)操作如前。選用CaSR、CD86 和CD206 抗體進(jìn)行染色，Ⅰ抗稀釋比例均為1∶100。在顯微鏡下觀察每個(gè)組織中CD86（紅色）、CaSR（綠色）和CD206（粉色）的變化，隨機(jī)選擇5 個(gè)鏡下視野（×400）進(jìn)行拍照，使用Image-Pro Plus 6.0 對(duì)圖像進(jìn)行分析，分析CaSR 的表達(dá)及巨噬細(xì)胞極化類(lèi)型。

3.8 Western blotting 檢測(cè) 收集前期留取的腎臟組織，再加入適量的配好的蛋白提取劑提取腎臟組織蛋白，使用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。電泳條件為全程80 V，電泳結(jié)束后根據(jù)marker 的位置切膠，濕轉(zhuǎn)條件為200 mA、2 h。PVDF膜在含有5%牛血清白蛋白封閉液封閉2 h 后，將膜與相應(yīng)Ⅰ抗在4 ℃旋轉(zhuǎn)搖床上過(guò)夜孵育，次日用TBST洗滌5次后，將膜與相應(yīng)Ⅱ抗在室溫下孵育2 h。清洗，曝光，晾干膠片。用凝膠成像分析儀進(jìn)行采圖，用Image-Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行灰度測(cè)量，重復(fù)測(cè)量3次，取其平均值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。P＜0.05則表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 R568對(duì)大鼠血壓的影響

用擬鈣劑R568 干預(yù)SHR 8 周后（24 周齡），使用無(wú)創(chuàng)血壓儀器檢測(cè)各組大鼠的血壓水平，結(jié)果顯示，與WKY組相比，SHR+NS組大鼠SBP、DBP和MAP均顯著升高（P＜0.05）；與SHR+NS 組相比，SHR+R568組大鼠SBP、DBP和MAP均顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖1。這一結(jié)果表明，擬鈣劑R568 具有降低SHR 大鼠血壓的生物學(xué)效應(yīng)。

Figure 1. The blood pressure of the rats was measured non-invasively by the tail-cuff method. A：systolic blood pressure（SBP）；B：diastolic blood pressure（DBP）；C：mean arterial pressure（MAP）. Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs WKY group；#P＜0.05 vs SHR+NS group.圖1 尾袖法無(wú)創(chuàng)檢測(cè)各組大鼠血壓

2 R568對(duì)大鼠腎臟形態(tài)學(xué)的影響

為了探究擬鈣劑R568 對(duì)高血壓大鼠腎臟病變的影響，采用HE染色法觀察高血壓大鼠腎臟的形態(tài)學(xué)變化；用Masson 染色檢測(cè)腎臟纖維化程度；用PAS染色檢測(cè)腎小球結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果顯示，與WKY 組大鼠相比，SHR+NS 組大鼠出現(xiàn)明顯的腎損傷，主要表現(xiàn)為腎臟入球動(dòng)脈硬化、基質(zhì)增加和毛細(xì)血管管腔閉塞，同時(shí)可見(jiàn)輕度系膜增生，腎間質(zhì)出現(xiàn)明顯的纖維化；與SHR+NS 組相比，SHR+R568 組大鼠腎臟病變有所減輕，纖維化程度明顯減輕，見(jiàn)圖2。這一結(jié)果表明，擬鈣劑R568 可以明顯減輕纖維化，扭轉(zhuǎn)高血壓引起的腎損傷。

3 R568 對(duì)大鼠腎臟 CaSR、NAGL 及 Col3 表達(dá)的影響

Western blotting 和 qRT-PCR 結(jié)果顯示，與 WKY組相比，SHR+NS 組大鼠腎組織中CaSR 表達(dá)水平顯著降低，而腎損傷標(biāo)志物NAGL 和膠原標(biāo)志物III 型膠原蛋白（collagen type III，Col3）的表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與 SHR+NS 組相比，R568 干預(yù) 8 周后，大鼠腎組織中CaSR 表達(dá)顯著升高，而NAGL 和Col3 的表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。NAGL 免疫組化的結(jié)果同Western blotting 和qRT-PCR 一致。見(jiàn)圖3。

Figure 3. Effects of R568 on CaSR，NAGL and Col3 expression in the rat kidneys. A：the expression of CaSR and NAGL in the rat kidneys was determined by Western blotting；B：the expression of NAGL in the rat kidneys was determined by immunohistochemistry（×400）；C：the expression of CaSR mRNA in the rat kidneys；D：the expression of NAGL mRNA in the rat kidneys；E：the expression of Col3 mRNA in the rat kidneys. Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs WKY group；#P＜0.05 vs SHR+NS group.圖3 R568對(duì)大鼠腎臟CaSR、NAGL及Col3表達(dá)的影響

4 R568 對(duì)大鼠腎臟NLRP3 炎癥小體和PLC 信號(hào)通路表達(dá)的影響

NLRP3炎癥小體的激活可以釋放大量成熟的炎癥物質(zhì)IL-1β 和IL-18，這些炎癥因子會(huì)加重高血壓腎損傷。為了探究擬鈣劑R568 是否通過(guò)調(diào)控NLRP3 炎癥小體參與高血壓腎損傷，我們采用Western blotting 和qRT-PCR 檢測(cè)大鼠腎臟中NLRP3炎癥小體的表達(dá)。結(jié)果顯示，與WKY 組相比，SHR+NS組腎組織中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與SHR+NS組相比，R568干預(yù)8 周后，大鼠腎組織中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖4A～D。

為了進(jìn)一步闡明R568 調(diào)控NLRP3 炎癥小體的分子機(jī)制，我們采用免疫組化檢測(cè)各組大鼠腎組織中PLC 蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，與WKY 組相比，SHR+NS 組大鼠腎組織中PLC 蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與 SHR+NS 組相比，R568 干預(yù) 8 周后，大鼠腎組織中PLC蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖4E。這些結(jié)果表明，擬鈣劑R568通過(guò)激活PLC 信號(hào)通路抑制NLRP3 炎癥小體的激活，從而降低大鼠血壓，減輕高血壓腎損傷。

5 R568對(duì)大鼠腎臟中巨噬細(xì)胞極化的影響

為了驗(yàn)證巨噬細(xì)胞極化是否參與R568 降低SHR 血壓及減輕腎損傷的過(guò)程，我們采用免疫組化檢測(cè)各組大鼠腎組織中CD68（巨噬細(xì)胞標(biāo)志物）的表達(dá)，采用免疫熒光檢測(cè)CaSR、CD86（M1 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物）和CD206（M2 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物）的表達(dá)，鑒定腎臟組織中巨噬細(xì)胞極化類(lèi)型。結(jié)果顯示，與 WKY 組相比，SHR+NS 組大鼠腎組織中 CaSR 和CD206 的表達(dá)顯著降低，而 CD68 和 CD86 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與 SHR+NS 組相比，R568 干預(yù) 8 周后，大鼠腎組織中CaSR 和CD206 的表達(dá)顯著升高，而 CD68 和 CD86 表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖 5。以上結(jié)果表明，在高血壓腎損傷過(guò)程中，擬鈣劑R568 通過(guò)減少巨噬細(xì)胞數(shù)量，抑制巨噬細(xì)胞向M1極化，促進(jìn)其向M2極化，從而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

討 論

原發(fā)性高血壓是環(huán)境和遺傳共同作用的心血管疾病，占高血壓病例中的95%以上，雖然臨床上治療高血壓的藥物種類(lèi)繁多，但高血壓控制現(xiàn)狀仍令人擔(dān)憂(yōu)。高發(fā)病率和低控制率提示高血壓仍是危害人類(lèi)健康的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。新型降壓藥的研究在控制血壓，降低心血管疾病的發(fā)生率和致死率方面顯得極其重要。腎損傷是高血壓進(jìn)展過(guò)程中重要的靶器官損傷，也是引起終末期腎病的主要因素［9］，其主要的病理變現(xiàn)為腎小球硬化，小管間質(zhì)區(qū)纖維化、腎小管萎縮以及小葉間動(dòng)脈的變性［10］，臨床上則表現(xiàn)為尿素和肌酐升高，同時(shí)伴隨大量蛋白尿。大量研究證明治療高血壓相關(guān)疾病，只有控制血壓，改善靶器官損傷才能有效降低心血管事件的發(fā)病率和致死率［8］。

眾多資料表明，CaSR 參與高血壓的發(fā)生發(fā)展，且在調(diào)節(jié)血壓上發(fā)揮一定的作用［11］。腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）系統(tǒng)激活后，腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)變，成為肌成纖維細(xì)胞。這種適應(yīng)性的轉(zhuǎn)變是為了適應(yīng)炎性微環(huán)境，成纖維細(xì)胞產(chǎn)生大量膠原蛋白，破壞基質(zhì)降解合成的平衡，最終損害腎小球和腎小管，導(dǎo)致高血壓腎纖維化［12-14］。此外，我們研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，激活CaSR，通過(guò)抑制RAS 活性，降低大鼠血壓，改善血管增殖重構(gòu)［15］。因此，我們大膽推測(cè)CaSR 參與高血壓腎損傷的發(fā)生發(fā)展。我們的研究結(jié)果表明，激活CaSR 可以降低SHR 大鼠血壓，改善高血壓腎損傷，而Zhang等［16］研究發(fā)現(xiàn)，使用 CaSR 抑制劑 Calhex 231 干預(yù)SHR 大鼠可以降低大鼠血壓，這種結(jié)果差異可能和藥物注射時(shí)間劑量以及藥物作用機(jī)理有關(guān)，具體機(jī)制仍待進(jìn)一步闡明。

腎臟疾病是多因素誘發(fā)的機(jī)體不良病變，其中NLRP3 炎癥小體的激活參與腎臟疾病的進(jìn)展［17］。NLRP3 炎癥小體是一種多聚體蛋白，促炎介質(zhì)IL-1β和IL-18 的合成分泌是NLRP3 炎癥小體被激活的生物學(xué)標(biāo)志［18］。本研究結(jié)果表明，在SHR中，NLRP3炎癥小體參與高血壓腎損傷的發(fā)生發(fā)展，激活CaSR 可以抑制NLRP3 炎癥小體活化，從而改善高血壓腎損傷。巨噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮不可或缺的作用，同時(shí)因其強(qiáng)大的異質(zhì)性成為研究熱點(diǎn)。在不同的疾病模型里，巨噬細(xì)胞極化后發(fā)揮的生物學(xué)作用并不是完全一致的，如在腫瘤中，M1型巨噬細(xì)胞可以抑制腫瘤的侵襲和生長(zhǎng)，而M2型巨噬細(xì)胞則促進(jìn)了腫瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)［19］；在大鼠心梗模型中，M1型巨噬細(xì)胞主要出現(xiàn)在心梗早期，其分泌大量炎癥因子促進(jìn)組織形成瘢痕組織，M2 型巨噬細(xì)胞則在后期發(fā)揮修復(fù)瘢痕組織的效應(yīng)［20］。由此可見(jiàn)，巨噬細(xì)胞極化類(lèi)型的平衡失調(diào)，可能反映了機(jī)體自身的免疫狀態(tài)和疾病的進(jìn)程。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，在SHR大鼠中，激活CaSR 可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1極化減少，向M2極化增多，從而改善高血壓腎損傷。研究表明，組織中的巨噬細(xì)胞數(shù)量的維持有兩種方式，一種是外周血單核細(xì)胞源性的巨噬細(xì)胞只能靠循環(huán)中單核細(xì)胞的募集補(bǔ)充，另一種是胚胎起源的巨噬細(xì)胞，通過(guò)原位增殖補(bǔ)充自身數(shù)量［21-23］。有趣的是，我們?cè)诤笃趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，激活CaSR，可以降低單核細(xì)胞趨化因子受體CCR2的表達(dá)，初步解釋了腎臟巨噬細(xì)胞部分由外周血單核細(xì)胞募集在此，補(bǔ)充腎臟巨噬細(xì)胞的數(shù)量。

綜上所述，CaSR 激活可經(jīng)PLC 信號(hào)通路抑制NLRP3 炎癥小體激活，減少巨噬細(xì)胞向M1 極化、促進(jìn)其向M2 極化，以降低SHR 大鼠血壓，改善高血壓腎損傷。遺憾的是，巨噬細(xì)胞極化的具體信號(hào)通路仍有待進(jìn)一步探究，目前考慮PLC 和腺苷酸環(huán)化酶信號(hào)通路可能參與巨噬細(xì)胞極化，因此后期的研究會(huì)主要探討這兩條信號(hào)通路在高血壓腎損傷中調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的具體作用。本研究發(fā)現(xiàn)為高血壓腎損傷的發(fā)病機(jī)制提供了治療新思路和臨床藥物新靶點(diǎn)。

Figure 4. Effects of R568 on activation of NLRP3 inflammasomes in the kidneys of hypertensive rats. A：the protein expression of CaSR and NLRP3 inflammasome-associated molecules determined by Western blotting；B，C and D：the mRNA expression of NLRP3 inflammasome-associated molecules determined by qRT-PCR；E：the expression of PLC determined by immunohistochemistry（×400）. Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs WKY group；#P＜0.05 vs SHR+NS group.圖4 R568對(duì)高血壓大鼠腎臟NLRP3炎癥小體活化的影響

Figure 5. Effects of R568 on macrophage polarization in the kidneys of hypertensive rats. A：the expression of macrophage marker CD68（×400）；B：immunofluorescence staining of CD86，CD206 and CaSR（×400）；C，D and E：the mRNA expression of CD86，CD206 and CaSR. Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs WKY group；#P＜0.05 vs SHR+NS group.圖5 R568對(duì)高血壓大鼠腎臟巨噬細(xì)胞極化的影響