陳 嬌 ， 張 蕾 ， 鄭 飛 ， 王 露 ， 晏譽文 ， 郭凌鄖 ，楊建業(yè) ， 沈 俊 ， 王家寧 △

（1湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院心內科，湖北 十堰 442000；2湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院臨床研究所，湖北 十堰 442000）

腹主動脈瘤（abdominal aortic aneurysm，AAA）是指腹主動脈的永久性局限性擴張，以腎下腹主動脈擴張為主，其直徑超過30 mm 或比鄰近血管大50%［1］。且AAA 是導致65歲以上老年男性死亡的一個主要原因［2］。通常AAA 患者多無明顯臨床表現。一旦出現破裂則導致65%～85%的病例出現致命性出血和死亡［3］。流行病學篩查發(fā)現AAA 的主要危險因素包括：高齡、性別、吸煙、家族史、目前患有心血管疾?。òo癥狀性心臟病和外周動脈疾病），高血壓和血脂異常［4］。

目前認為慢性炎癥是AAA 發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，而氧化應激可產生過量活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS 可促進炎癥細胞分泌炎癥因子誘導血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）凋亡，同時激活基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）促進主動脈壁內細胞外基質降解并激活膠原蛋白酶造成彈力纖維破壞，從而造成血管壁彈性減弱最終發(fā)展成動脈瘤。而超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是清除ROS 的主要酶之一。目前在哺乳動物中發(fā)現的SOD 主要有3 種亞型：Cu/Zn-SOD（SOD1）、Mn-SOD（SOD2）和 Fe-SOD（SOD3）。高等動物細胞內主要有SOD1 和SOD2，其中 SOD1 較多。Ishiyama 等［4］采用 TaqMan 法測定基因型，采用ELISA 法測定蛋白濃度，結果證實SOD2可能通過氧化應激反應參與AAA的形成。

目前對AAA 的治療僅有血管內修復或手術修復，而其中僅有10%的適合行血管內修復或手術修復，有一部分人雖然不適合手術修復但仍有較高AAA 破裂風險?？傊壳瓣P鍵是缺乏有效地手段限制主動脈瘤生長，故迫切需要進一步揭示AAA 的分子機制，為臨床管理和藥物開發(fā)提供新的靶點。結合Strauss等的研究結果，認為SOD2可能通過氧化反應與AAA 的形成有關［5］。因此，本課題著眼于SOD2 在AAA 中的表達及其對AAA 發(fā)生發(fā)展的影響，期望通過闡明SOD2 在CaCl2誘導的小鼠AAA 發(fā)生發(fā)展中的影響及可能機制，為臨床AAA 的治療提供新的治療方向和治療靶點。

材料和方法

1 主要材料和試劑

活性氧檢測試劑盒、二氫乙啶（dihydroethidium，DHE；超氧化物陰離子熒光探針）和JC-10 線粒體膜電位熒光探針均購自上海翊圣生物科技有限公司；小鼠 IL-6、IL-10、MMP-9 和 IL-1β ELISA 試劑盒均購自欣博盛生物科技有限公司；總SOD（total SOD，TSOD）和SOD 分型檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；BCA 蛋白濃度測定試劑盒和RIPA 蛋白裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司；兔抗小鼠骨橋蛋白（osteopontin，OPN）抗體購自Immunoway；兔抗小鼠SOD2、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Bcl-2、MMP2 及MMP9 抗體購自Santa Cruz；兔抗小鼠tubulin 抗體購自Sigma；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔Ⅱ抗購自Antgene。

2 方法

2.1 實驗動物模型構建 C57BL/6J 小鼠，SPF 級，雄性，8～10 周齡，體重 25 g 左右，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司；在特定無病原體條件下喂養(yǎng)于湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院動物實驗中心，許可證編號為SCXK（京）2016-0006，常規(guī)飼養(yǎng)。予以0.75 mmol/L氯化鈣外敷腹主動脈誘導AAA模型［6］。

2.2 細胞實驗 原代培養(yǎng)Sprague-Dawley 大鼠主動脈平滑肌細胞并鑒定，用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)，置于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。給予不同濃度（0、0.25、0.5、0.75、1 和 1.5 mmol/L）的H2O2處理細胞誘導細胞凋亡，并在處理后不同時間點鏡下觀察。后續(xù)收集細胞行Western blot 檢測。另取細胞給予有/無Ad-SOD2（MOI 100）處理 48 h 誘導SOD2 過表達，同時給予1 mmol/L H2O2處理細胞2 h，收集細胞行Western blot檢測?；虬凑f明書行ROS檢測、DHE 檢測、JC-10 檢測、Annexin-V/PI 試劑盒進行流式細胞術檢測。

2.3 動物取材和標本收集 給予10%水合氯醛（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，剪開皮膚，暴露心前區(qū)，抽取心室血約1 mL 入抗凝管中。4 ℃靜置（分層后離心取上清）。依次剪開胸部肌肉、胸骨和心包膜，暴露心臟。心尖部穿刺，右心耳處剪開，肝素生理鹽水順沿左心室行全身灌注，同時剪開腹部皮膚、肌肉及腹膜，肉眼見肝臟顏色變白后換用預冷的4%多聚甲醛（或生理鹽水）快速灌注后取主動脈組織。標本放入冰醋酸固定液（去離子水、甲醇、冰醋酸體積比為6∶3∶1）中，室溫固定7 d，擬用于免疫組化檢測。而生理鹽水灌注的組織，放入液氮中，組織變脆后轉入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯友心?，組織蛋白的提取和制樣，擬行Western blot 檢測。

2.4 組織病理檢測 取石蠟包埋組織塊，厚度約5 μm。切片行HE 染色，烤片、脫蠟、水化、蘇木素染色、分化、伊紅復染、脫水、透明后封片，顯微鏡下觀察并拍照，觀察整個血管形態(tài)，細胞核著深藍色，胞質和膠原呈淺紅色。另外切片行彈力纖維染色，先烤片、脫蠟、水化、Verhoeff 染液 A 滴染 20 min、Verhoeff 分化液分化組織、95%乙醇快速分化、VanGieson 染液（9∶1）復染、脫水、透明后封片，鏡下可見彈力纖維呈黑色，膠原呈灰色。

2.5 Western blot檢測SOD2及凋亡相關蛋白表達每組取0.1 mg 組織加入裂解液，冰上勻漿器破碎組織，低溫離心后取上清。BCA 法測量蛋白濃度。每孔取10 μg蛋白樣本上樣進行SDS-PAGE。電泳結束后，冰浴中電轉移法轉印蛋白至PVDF 膜上，5%BSA封閉液室溫封閉后，根據抗體說明書，分別加入1∶1 000 比例稀釋的 SOD2、α-SMA、OPN、Bax、Bcl-2、MMP2、MMP9 單克隆抗體，孵育后，棄去 I 抗，TBST洗膜3 次，然后加入HRP 標記的II 抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL試劑進行曝光顯影。

3 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 8 統(tǒng)計軟件進行數據分析處理及作圖。實驗數據采用均數±標準差（mean±SD）表示。如果數據為正態(tài)分布且方差齊，則采用Student'st檢驗比較兩組間的差異，多組間比較采用單因素方差分析和Tukey 事后分析。對于未通過正態(tài)性檢驗的數據，采用Mann-WhitneyU檢驗比較兩組間的差異，多組間采用單因素方差分析和Tukey事后分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 CaCl2誘導小鼠AAA模型的鑒定

于CaCl2外敷腹主動脈后不同時間點（1、2、4和6周），取腹主動脈組織并行HE 染色，與對照組相比，AAA 組腹主動脈直徑明顯增大。彈力纖維染色提示AAA 組小鼠不僅腹主動脈直徑增大，同時還伴有明顯的彈力纖維斷裂現象，見圖1。

2 SOD2在AAA 小鼠中的表達及其與細胞表型、炎癥因子等的關系

Western blot 結果提示瘤體組織中α-SMA 和SOD2的表達較對照組降低，但隨著時間延長，在第6周時有所上升；免疫組化染色中α-SMA及SOD2結果與Western bot 一致，但OPN 表達在各組間無明顯改變，見圖2A、B；同時由圖1B 可見AAA 組腹主動脈術后炎癥反應明顯，局部組織明顯粘連，但檢測小鼠血清中炎癥因子（IL-6、IL-10 和IL-1β）及MMP9 水平，結果無統(tǒng)計學差異，見圖2C。此外，T-SOD 活性和SOD2活性有明顯改變，結果提示T-SOD在AAA成瘤后明顯下降，而SOD2 在外敷CaCl2早期水平較高，隨后下降至正常水平以下。

3 Ad-SOD2對H2O2誘導氧化應激模型中RASMCs凋亡的影響

為了探討SOD2 是否參與AAA 的發(fā)病過程，本實驗原代培養(yǎng)大鼠主動脈平滑肌細胞后傳代，給予不同濃度（0、0.25、0.5、0.75、1 和 1.5 mmol/L）的H2O2處理細胞2 h 誘導細胞凋亡，鏡下觀察，同時采用 Western blot 檢測 SOD2、MMP2、MMP9、Bax 和 Bcl-2 的表達。結果提示 MMP2、MMP9 和 Bax 的表達隨著H2O2濃度增加而增加，SOD2 和Bcl-2 的表達隨著H2O2濃度增加而下降。培養(yǎng)RASMCs 至合適密度，有/無 Ad-SOD2 感染 RASMCs 48 h 誘導 SOD2 過表達，于感染46 h時加入1 mmol/L H2O22 h誘導細胞凋亡，光鏡下可見SOD2 過表達明顯延緩細胞凋亡，采用Annexin-V/PI 試劑盒進行流式細胞術檢測亦支持這一結果。見圖3。

Figure 1. CaCl2-induce AAA model and identification. A：schematic diagram of CaCl2 induced AAA model；B：endoscopic images of the abdominal aorta；C：the maximum diameter of abdominal aorta；D：HE staining；E：elastic fiber staining CaCl2 external application of abdominal aorta for 6 weeks in AAA group. Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs control group.圖1 CaCl2誘導的AAA模型及其鑒定

Figure 3. Morphological changes of RASMCs and expression of SOD2 and other proteins in RASMCs treated with H2O2. A：morphological changes of RASMCs after H2O2 treatment；B：Western blot results of Bax，Bcl-2，MMP2，MMP9 and SOD2；C：morphological changes of Ad-null/Ad-SOD2-infected RASMCs treated with H2O2；D：apoptosis of RASMCs was detected by flow cytometry. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；△△P＜0.01 vs Ad-null group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs Ad-null+H2O2 group.圖3 H2O2處理RASMCs后細胞形態(tài)及SOD2等蛋白表達的變化

4 Ad-SOD2 對 H2O2 誘導 RASMCs 線粒體膜電位的影響

檢測有/無 Ad-SOD2 感染 RASMCs 時 H2O2誘導的細胞中ROS水平，結果顯示SOD2過表達可明顯清除ROS，見圖4A。同時也檢測有/無Ad-SOD2 感染RASMCs 并予以H2O2誘導細胞凋亡中的超氧化物陰離子水平，結果證實SOD2可明顯降低超氧化物陰離子熒光水平，提示SOD2可清除ROS中的超氧化物陰離子，見圖 4B。檢測有/無 Ad-SOD2 感染 RASMCs 時H2O2誘導細胞凋亡后細胞線粒體的膜電位水平，結果提示Ad-SOD2 感染可延緩RASMCs 線粒體膜電位下降，見圖4C。

5 Ad-SOD2 基因轉移可減輕CaCl2 誘導的小鼠AAA形成

體外細胞實驗證實SOD2 可減輕RASMCs 的凋亡，為進一步明確SOD2 在CaCl2外敷誘導AAA 中是否起保護作用，本實驗在動物建模時腹腔注射Ad-SOD2（1×109pfu），6 周時取腹主動脈進行檢測發(fā)現Ad-SOD2 組腹主動脈炎癥減輕；HE 檢測發(fā)現SOD2可延緩腹主動脈直徑擴張。彈力纖維染色提示給予Ad-SOD2 腹腔注射后可抑制腹主動脈直徑增大，同時減少彈力纖維斷裂。見圖5。

6 Ad-SOD2 對AAA 小鼠細胞表型和炎癥因子的影響

為進一步闡明機制，我們檢測了AAA 組腹主動脈的SOD2等表達，結果提示Ad-SOD2組腹主動脈組織中 α-SMA 和 SOD2 的表達較 AAA 組升高，OPN 無明顯改變；由大體標本可見Ad-SOD2 組腹主動脈的炎癥反應明顯減輕，主動脈直徑相對減少。檢測各組小鼠血清中炎癥因子（IL-6、IL-10 和 IL-1β）及MMP9 水平，差異無統(tǒng)計學意義；對照組血清T-SOD的水平較高，AAA 組血清T-SOD 水平明顯下降，Ad-SOD2 組又明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義。同時AAA組較control組血清SOD2活性有所下降，但差異無統(tǒng)計學意義，而Ad-SOD2 組SOD2 活性明顯升高，與AAA相比有顯著差異。見圖6。

Figure 4. Effect of Ad-SOD2 on mitochondrial membrane potential of H2O2-induced RASMCs. A：ROS levels；B：the level of superoxide anion；C：JC-10 staining. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs Ad-null group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs Ad-null+H2O2 group.圖4 Ad-SOD2對H2O2誘導的RASMCs線粒體膜電位的影響

討 論

AAA 是一種主動脈疾病，患者早期無典型癥狀，大多數的AAA 病變在腎動脈水平以下［1］。在發(fā)達國家，多數患者在接受其他檢查時偶然發(fā)現或者常規(guī)超聲檢查發(fā)現。流行病學篩查發(fā)現AAA的主要危險因素包括：高齡、性別、吸煙、家族史、目前患有心血管疾?。òo癥狀性心臟病和外周動脈疾?。?，高血壓和血脂異常。流行病學提示女性患AAA的概率低于男性，超過70 歲曾吸煙的女性AAA 的患病率約1%，AAA的主要并發(fā)癥是瘤體破裂，據估計全世界每年有15萬到20萬人死于主動脈瘤破裂。雖然AAA女性患病率較男性低，但因AAA 的形態(tài)學和血流動力學特征具有非常明顯的性別差異，導致女性AAA 的破裂風險更高。目前主要治療手段為經典外科手術或主動脈腔內介入治療，尚無有效的藥物手段證實可抑制或逆轉主動脈瘤的進展［1］。故迫切需要發(fā)現預防、抑制甚至逆轉主動脈瘤進展的藥物和方法。

目前常用的AAA 動物模型有多種，主要有皮下泵入輸注血管緊張素II、彈力蛋白局部灌注、氯化鈣或磷酸鈣誘導的模型以及異種移植模型等。本研究采用常用的、經濟的、技術難度中等的CaCl2誘導的小鼠 AAA 模型［1］。CaCl2可以在組織中產生不溶性鹽，引發(fā)慢性炎癥，從而促進動脈瘤的發(fā)展，最終導致外敷CaCl2的主動脈段直徑擴大主動脈壁變薄。CaCl2外敷的腹主動脈在組織病理變化包括外膜炎癥與細胞浸潤，激活炎癥信號分子如 JNK 和 NF-κB［7］，分泌各種MMPs 并降解彈性纖維等［8］。亦有研究表明磷酸鈣誘導的小鼠腹主動脈瘤模型中，主動脈組織彈力纖維斷裂明顯，炎癥加重［9］。這和本研究實驗模型結果一致，外敷CaCl2后腹主動脈周圍炎癥明顯增加，彈力纖維破壞明顯。同時該模型的不足，主要在于一方面它沒有進展到動脈瘤的破裂，另一方面在于此模型動脈瘤不合并動脈粥樣硬化或壁內血栓。

Strauss 等［5］采用 TaqMan 法測定基因型，采用ELISA 法測定蛋白濃度，結果證實SOD2 可能通過氧化應激反應參與AAA 的形成。本研究中CaCl2外敷腹主動脈后誘導慢性炎癥發(fā)生，而炎癥發(fā)生后ROS增加，是機體自我保護引起SOD2應激性增加以利于清除ROS所致。為探討SOD2對小鼠AAA的影響，我們采用致病性低、轉導效率高、無宿主細胞基因組整合的腺病毒為載體的Ad-SOD2腹腔注射誘導小鼠SOD2過表達。本研究檢測了CaCl2誘導的AAA 小鼠血清中促炎因子（IL-6 和IL-1β）和抗炎因子（IL-10），結果均無顯著差異。支持這一結果的是，有報道稱CaCl2誘導的AAA 模型中，動脈瘤組織局部炎癥因子有明顯變化，但循環(huán)血中炎癥因子差異無統(tǒng)計學意義［8］。我們同時檢測了血清T-SOD 和SOD2活性，結果提示AAA 早期T-SOD 活性明顯升高，隨后呈下降趨勢，而SOD2 活性在外敷CaCl21 周時最高，隨后亦逐漸下降。這些結果提示在AAA發(fā)病過程中SOD活性隨之改變。理論上SOD2可減輕炎癥反應，而本研究觀察到，腹腔注射Ad-SOD2誘導SOD2過表達的AAA小鼠的腹主動脈炎癥明顯減輕，彈力纖維破壞減少，同時主動脈直徑的進展受到抑制，與理論推測一致。這些結果提示SOD2可延緩CaCl2誘導的AAA進展。

Figure 5. Protective effect of Ad-SOD2 on CaCl2-induced AAA in mice. A：schematic diagram of CaCl2-induced AAA model；B：endoscopic images of the abdominal aorta and the maximum diameter of the abdominal aorta；C：HE staining；D：elastic fiber staining. Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs AAA group.圖5 Ad-SOD2在CaCl2誘導的小鼠AAA中的保護作用

ROS 主要來源于線粒體，能激活細胞信號傳導，增加促炎細胞因子的產生和釋放，從而維持炎癥反應。而炎癥反應亦可引起氧化應激，加重細胞損傷。ROS 的相對過量積累會破壞細胞內穩(wěn)態(tài)，導致氧化應激和線粒體功能障礙，進一步產生ROS。同時MMP2 和MMP9 被認為是細胞外基質降解中最重要的兩種MMPs，也是AAA 形成和發(fā)展的關鍵因素［10］。早期一項由彈力蛋白酶誘導的小鼠AAA 模型表明，早期病變組織SOD2 升高，同時MMP2 的活性升高［11］。而本研究細胞實驗結果證實伴隨OS 誘導細胞凋亡越明顯MMP2、MMP9 的表達亦越高，和這項研究結果基本一致。本研究采用細胞流式術檢測結果證實SOD2 可明顯抑制RASMCs 凋亡。同時證實H2O2所致氧化應激誘發(fā)細胞凋亡時ROS 水平升高、超氧陰離子水平升高同時細胞線粒體膜電位明顯下降。而給予Ad-SOD2后ROS及超氧陰離子水平明顯下降，同時延緩了線粒體膜電位下降，說明SOD2 對線粒體膜電位有一定的保護作用。

本研究的最大缺陷在于未能排除同齡小鼠腹主動脈起始直徑的差異；同時該模型由給予外敷CaCl2造成急性炎癥所致，而人患AAA多由慢性炎癥所致，這與人類的AAA 發(fā)病機制亦有所不同，故不能完全模擬AAA的發(fā)病機制；因為該模型為急性起病，亦不利于長期的臨床藥物研究。但是動物實驗結果提示SOD2 可通過減輕主動脈周圍炎癥、減少主動脈壁內彈力纖維破壞從而對AAA起一定的保護作用。這對臨床AAA的治療提供新的治療方向和治療靶點。也為進一步研究AAA發(fā)病機制提供了新思路。

Figure 6. Effects of Ad-SOD2 transfer on expression of inflammatory factors in AAA mice. A：Western blot results of α-SMA and SOD2；B：immunohistochemical staining of α-SMA，OPN and SOD2；C：the content of IL-6，IL-10，IL-1β and MMP9，and the activity of SOD2 and total SOD. Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs AAA group.圖6 Ad-SOD2腹腔注射對AAA小鼠主動脈細胞表型和炎癥因子的影響