朱家峰， 李 倩， 方 柳， 姚 倩， 張侍玉， 張?zhí)m娥△

（1濰坊醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，山東 濰坊 261053；2濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261053）

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人口老齡化的加劇，心血管危險(xiǎn)因素對(duì)人類健康的影響愈加顯著，心血管疾?。╟ardiovascular diseases，CVD）是全球范圍內(nèi)影響發(fā)病率和死亡率的主要原因［1］，也是首位死亡原因［2］。在過去 20 年（1997～2018 年），全球 CVD 的死亡率幾乎沒有變化，尤其心力衰竭（心衰）更是如此，其 5 年死亡率仍然高達(dá) 45%～55%［3］。目前，我國(guó)CVD 患病率仍處于持續(xù)上升階段，現(xiàn)有患病人數(shù)大約3.3 億，是主要的死亡原因，其中農(nóng)村為46.66%，城市為43.81%。因此，CVD 已成為一個(gè)日益嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問題，防治工作刻不容緩［4］。

高血壓是CVD 的關(guān)鍵危險(xiǎn)因素，而持續(xù)高血壓會(huì)導(dǎo)致心臟功能下降和嚴(yán)重的心臟損傷。血管緊張素II（angiotensin II，Ang II）是腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）的關(guān)鍵組成部分，介導(dǎo)高血壓心臟損傷［5］和炎癥細(xì)胞/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)；并且，RAS 影響心肌細(xì)胞內(nèi)過程，包括促炎細(xì)胞因子和活性氧的產(chǎn)生增加、纖維化、肥大、細(xì)胞凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等［6-7］。Yang 等［8］發(fā)現(xiàn)，減少心肌炎癥反應(yīng)和凋亡會(huì)減輕Ang II 誘導(dǎo)的小鼠心臟損傷和重構(gòu)的進(jìn)展，改善心功能。AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）活化能夠調(diào)節(jié)心臟代謝和炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)小鼠心臟免受缺血性損傷［9］。因此，如何抑制Ang II 誘導(dǎo)的心肌炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡是治療及預(yù)防心肌損傷和重構(gòu)的重要方向。

胰島素生長(zhǎng)因子1 受體（insulin growth factor 1 receptor，IGF1R）是一種酪氨酸激酶，在心臟中廣泛表達(dá)，具有調(diào)節(jié)心臟收縮功能和細(xì)胞增殖分化的重要生理作用［10］。有研究表明，IGF1R 在小鼠心臟中的過表達(dá)最終導(dǎo)致收縮性能的下降和間質(zhì)纖維化的增加，并且IGF1R 在小鼠缺血性心臟病和心力衰竭中過表達(dá)［11-12］。然而，有研究在雌性小鼠中使用IGF1R 單克隆抗體有效改善了心臟功能［13］。因此本研究利用Ang II 誘導(dǎo)小鼠高血壓心臟損傷，旨在探討IGF1R缺失對(duì)Ang II 誘導(dǎo)的小鼠心肌炎癥反應(yīng)和心肌細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物

SPF 級(jí)、6～8 周齡雄性野生型（wild-type，WT）C57BL/6 小 鼠 和 雜 合 子Igf1r基 因 敲 除（Igf1r+/-）C57BL/6小鼠（體重22～24 g）各20只購(gòu)自賽業(yè)（廣州）生物科技有限公司［許可證號(hào)SCKX（粵）2018-0032］，飼養(yǎng)在濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，進(jìn)行溫度、濕度控制和12 h 的光-暗循環(huán)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)根據(jù)山東省人民政府出版的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》和《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物護(hù)理與使用委員會(huì)批準(zhǔn)（No. 2020SDL163）。

2 主要試劑

Ang II購(gòu)自上海索萊寶生物科技有限公司；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase-MB，CK-MB）和心肌鈣蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）的ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司；TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。TRIzol 試劑購(gòu)自 Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄 Ace?qPCR RT 試劑盒和SYBR?Green 購(gòu)自Toyobo；所用引物由上海生工生物工程有限公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成，序列見表1?？?IGF1R、caspase-3、caspase-8、AMPK 和 p-AMPK 單克隆抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology；抗GAPDH單克隆抗體購(gòu)北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；羊抗兔Ⅱ抗和羊抗鼠Ⅱ抗均購(gòu)自Proteintech。

3 主要方法

3.1 小鼠模型及實(shí)驗(yàn)分組 研究表明，Ang II 皮下注射2 周可以誘導(dǎo)小鼠心臟損傷和心肌重構(gòu)［14］，因此本研究對(duì)Ang II 組小鼠皮下注射Ang II（2 mg·kg-1·d-1）2 周以構(gòu)建心肌損傷模型。將 WT 和Igf1r+/-小鼠各20 只按照隨機(jī)數(shù)字表法各分為2 組，共4 組，即 WT+saline 組、WT+Ang II 組、Igf1r+/-+saline 組和Igf1r+/-+Ang II 組，每組 10 只。saline 組小鼠皮下注射等體積的生理鹽水2周。

3.2 小鼠心功能測(cè)定 在4 組小鼠連續(xù)處理2 周后，禁食禁水8 h 測(cè)量體重（body weight，BW）并以3%異氟烷麻醉小鼠，快速進(jìn)行眼球取血后用二氧化碳安樂處死小鼠，然后對(duì)心臟重量（heart weight，HW）和脛骨長(zhǎng)度（tibial length，TL）進(jìn)行測(cè)量。

3.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)IGF1R 在心臟組織中的表達(dá) 收集WT 和Igf1r+/-小鼠心臟進(jìn)行固定、包埋，利用免疫組織化學(xué)法分別檢測(cè)心臟組織樣本IGF1R的表達(dá)情況。IGF1R 定位于細(xì)胞質(zhì)，以棕黃色顆粒為染色陽(yáng)性。ImageJ 圖像分析軟件對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行分析和定量。

3.4 ELISA 檢測(cè)炎癥因子 將4 組小鼠血液4 ℃靜置 24 h 后，3 000×g離心 15 min 收集血清，按 ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平，將10 μL樣品（用40 μL樣品稀釋劑按1∶5的比例稀釋）加入到ELISA 涂層板上的相應(yīng)孔中，然后加入100 μL HRP 偶聯(lián)試劑。僅在空白孔中加入樣品稀釋劑。密封后，在37 ℃下孵育60 min。用洗滌液沖洗 5 次后，每孔依次加入 50 μL 顯色劑 A 和 50 μL 顯色劑B，37 ℃黑暗孵育15 min。最后，用 50 μL 終止液在室溫下終止反應(yīng)5～10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)的吸光度，根據(jù)不同ELISA 試劑盒的方法計(jì)算出炎癥因子的濃度。

3.5 TUNEL 檢測(cè)心肌組織中細(xì)胞凋亡 取小鼠心臟標(biāo)本，PBS 沖洗干凈后，4%多聚甲醛固定，用組織刀片沿水平45°進(jìn)行橫切后，進(jìn)行石蠟包埋和制作5 μm 厚石蠟切片。然后將各組心肌組織切片室溫下用二甲苯和梯度乙醇溶液（二甲苯10 min，二甲苯8 min，100%乙醇5 min，90%乙醇2 min，70%乙醇2 min，70%乙醇，蒸餾水2 min）脫蠟。樣品與20 mg/L蛋白酶K（無(wú)DNase）在37 °C 下孵育15 min。切片用PBS 洗滌 3 次后，用 TUNEL 反應(yīng)溶液在 37 °C 下孵育1 h。切片用抗熒光衰退劑（含DAPI）密封，然后再用PBS 沖洗。在熒光顯微鏡下觀察和拍照，細(xì)胞凋亡率：凋亡細(xì)胞與總細(xì)胞的比值。

3.6 RT-qPCR 用TRIzol 試劑從小鼠左心室中獲得總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄Ace?qPCR RT試劑盒將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。以引物為起始位點(diǎn)，在SYBR?Green 作用下，采用LightCycle 480 Instrument II PCR 檢測(cè)儀（Roche）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃延長(zhǎng) 10 min。內(nèi)參照為 β-actin，結(jié)果使用 2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析。

3.7 免疫印跡法 四組心臟組織加入RIPA 裂解緩沖液、蛋白酶和磷酸酶抑制劑。將加入裂解液的組織在冰上輕輕攪拌 40 min，4 ℃、12 000×g離心 15 min 后收集上清液。用BCA 檢測(cè)試劑盒（Thermo）測(cè)定蛋白樣品的濃度，并在95 ℃下與加載緩沖液孵育10 分鐘。對(duì)分子量大于10 kD 的蛋白質(zhì)進(jìn)行10%的Tris-Tricine-SDS-PAGE 電泳，并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF 膜中。在室溫下，用5%脫脂牛奶和Tris 緩沖鹽水/Tween-20（pH 7.4）封閉細(xì)胞膜1 h，加入Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，TBST洗3次，每次10 min，使用相應(yīng)Ⅱ抗常溫孵育1 h，使用化學(xué)發(fā)光辣根過氧化物酶底物可視化蛋白條帶，利用Alpha化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)FluorChem FC3 獲取條帶，并ImageJ 圖像分析軟件測(cè)量蛋白條帶灰度值進(jìn)行定量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 19.0 和 GraphPad Prism 9.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖表繪制。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（means±SD）表示。兩組樣本之間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組之間差異使用雙因素方差分析，然后采用LSD 法檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Igf1r基因敲除小鼠的構(gòu)建

為了研究IGF1R 信號(hào)是如何調(diào)節(jié)Ang II 誘導(dǎo)的心臟重構(gòu)，使用CRISPR/Cas9 基因敲除技術(shù)構(gòu)建Igf1r基因敲除小鼠，見圖1A。從小鼠尾巴中獲得的總RNA，通過PCR 方法鑒定出Igf1r+/-小鼠，見圖1B。通過免疫組織化學(xué)檢測(cè)法檢測(cè)IGF1R 在心臟中的表達(dá)，Igf1r+/-小鼠的IGF1R 陽(yáng)性表達(dá)量顯著低于WT 小鼠（P＜0.01），見圖1C。

2 IGF1R敲除緩解Ang II誘導(dǎo)的小鼠心肌損傷

Figure 1. Establishment and analysis of insulin growth factor 1 receptor（IGF1R）gene knockout mice. A：protocols of Igf1r+/- mouse model generation. The CRISPR/Cas9 gene technology was used to selectively knock out mouse Igf1r gene. Through in vitro transcription，Cas9-mediated mRNA and generated gRNAs were injected into mouse zygotes to knock out exons 3 to 20 of the target gene Igf1r. B：identification of the genotype in Igf1r+/- mouse model by PCR. C：immunohistochemical staining of IGF1R in the heart of WT and Igf1r+/-mice（scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs WT group.圖1 IGF1R敲除小鼠的構(gòu)建和分析

在本研究中，Igf1r+/-和WT 小鼠皮下注射Ang II（2 mg·kg-1·d-1）2 周，實(shí)驗(yàn)方案如圖 2A 所示。如表 2所示，各組小鼠BW 無(wú)顯著差異（P＜0.05）；與WT+saline 組相比，WT+Ang II 組小鼠 HW 顯著增加（P＜0.01），與 WT+Ang II 組相比，Igf1r+/-+Ang II 組小鼠HW 顯著減少（P＜0.01）；心臟功能重要評(píng)價(jià)指標(biāo)HW/BW 和HW/TL 也出現(xiàn)了相一致的結(jié)果。采用RT-qPCR 法檢測(cè)各組小鼠心臟組織腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）的 mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與WT+saline組相比，WT+Ang II組小鼠心臟BNP表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與WT+Ang II 組相比，Igf1r+/-+Ang II 組小鼠心臟BNP 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），見圖2B。采用ELISA 法檢測(cè)各組小鼠血清cTnT和CK-MB含量，結(jié)果顯示，與WT+saline 組相比，WT+Ang II 組小鼠血清 cTnT 和 CK-MB 含量顯著增加（P＜0.01）；與WT+Ang II 組相比，Igf1r+/-+Ang II組小鼠血清cTnT和CK-MB含量顯著減少（P＜0.05），見圖2C、D。采用免疫印跡法檢測(cè)各組小鼠心臟IGF1R 蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與WT+saline 組相比，WT+Ang II組小鼠心臟IGF1R蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與WT+Ang II 組相比，Igf1r+/-+Ang II組小鼠心臟IGF1R 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），見圖2E。

表2 各組小鼠心臟指數(shù)Table 2. Cardiac indexes of the mice in each group（Mean±SD. n=10）

3 IGF1R 敲除降低Ang II 誘導(dǎo)的小鼠心臟組織炎癥因子水平

通過RT-qPCR 法檢測(cè)各組小鼠心臟組織中炎癥因子 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的 mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與 WT+Ang II 組相比，WT+Ang II 組小鼠心臟組織中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的 mRNA 表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）；與WT+Ang II 組相比，Igf1r+/-+Ang II 組小鼠心臟組織中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的 mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01），見圖3A。再通過ELISA 法檢測(cè)各組小鼠血清中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6蛋白水平，結(jié)果顯示，與WT+Ang II 組相比，WT+Ang II 組小鼠血清中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平均顯著升高（P＜0.01）；與WT+Ang II 組相比，Igf1r+/-+Ang II 組小鼠血清中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平均顯著降低（P＜0.01），見圖3B。

4 IGF1R 敲除減少Ang II 誘導(dǎo)的小鼠心肌細(xì)胞凋亡

TUNEL 染色結(jié)果顯示，與WT+Ang II 組相比，WT+Ang II 組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與WT+Ang II組相比，Igf1r+/-+Ang II組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.01），見圖4A。免疫印跡結(jié)果顯示，與 WT+Ang II 組相比，WT+Ang II 組小鼠心臟組織中caspase-3 和caspase-8 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與WT+Ang II 組相比，Igf1r+/-+Ang II組小鼠心臟組織中caspase-3 和caspase-8 表達(dá)水平顯著降低，見圖4B。

5 IGF1R 敲除通過促進(jìn)AMPK 磷酸化減輕Ang II誘導(dǎo)的心臟損傷

免疫印跡結(jié)果顯示，與WT+Ang II 組相比，WT+Ang II 組小鼠心臟組織中AMPK 磷酸化水平顯著降低（P＜0.01）；與WT+Ang II 組相比，Igf1r+/-+Ang II 組小鼠心臟組織中AMPK 磷酸化水平顯著升高（P＜0.05），見圖5。

Figure 2. The expression of insulin growth factor 1 receptor（IGF1R）was up-regulated in the peocess of angiotensin II（Ang II）-induced cardiac injury. A：the myocardial injury model was established by subcutaneous injection of Ang II（2 mg·kg-1·d-1）for 2 weeks，while the mice in control group were subcutaneously injected with the same volume of normal saline for 2 weeks；B：the mRNA expression level of brain natriuretic peptide（BNP）in mouse cardiac tissues was detected by RT-qPCR（n=6 to 8）；C and D：the serum levels of cardiac troponin T（cTnT）and creatine kinase-MB（CK-MB）in mice were measured by ELISA（n=6）；E：the protein expression of IGF1R in mouse cardiac tissues was detected by Western blotting（n=4）. Mean±SD.*P＜0.05，**P＜0.01 vs WT+saline group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs WT+Ang II group.圖2 IGF1R在Ang II誘導(dǎo)的心臟損傷過程中表達(dá)上調(diào)

Figure 3. Insulin growth factor 1 receptor（IGF1R）knockout attenuated angiotensin II（Ang II）-induced cardiac inflammation. A：the mRNA expression levels of tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin-1β（IL-1β）and IL-6 in mouse cardiac tissues were detected by RT-qPCR（n=6 to 8）；B：the serum levels of TNF-α，IL-1β and IL-6 in mice were detected by ELISA（n=6）. Mean±SD.**P＜0.01 vs WT+saline group；##P＜0.01 vs WT+Ang II group.圖3 IGF1R敲除可減輕Ang II引起的心臟炎癥

Figure 5. Insulin growth factor 1 receptor（IGF1R）knockout attenuated angiotensin II（Ang II）-induced cardiac injury by promoting AMP-activated protein kinase（AMPK）phosphorylation. The protein levels of phosphorylated AMPK（p-AMPK）and AMPK were detected by Western blotting. Mean±SD. n=3 to 4.**P＜0.01 vs WT+saline group；#P＜0.05 vs WT+Ang II group.圖5 IGF1R敲除通過促進(jìn)AMPK磷酸化減輕Ang II誘導(dǎo)的心臟損傷

討 論

心臟損傷引發(fā)重構(gòu)的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要包括心肌細(xì)胞肥大、纖維化、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等。在心血管疾?。ㄈ缧募∪毖獡p傷、冠心病、心力衰竭和動(dòng)脈粥樣硬化等）發(fā)生過程中常常伴隨著炎癥反應(yīng)。心肌細(xì)胞受到氧化應(yīng)激刺激后，會(huì)產(chǎn)生炎癥因子，過量的炎癥因子會(huì)使細(xì)胞出現(xiàn)生長(zhǎng)異常、自噬和凋亡的失調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞異常凋亡［15-16］，從而引起心臟損傷，甚至出現(xiàn)心力衰竭。因此，如何減少氧化應(yīng)激、心肌炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡對(duì)緩解心肌損傷至關(guān)重要。最近，有關(guān)IGF1R 信號(hào)通路參與心血管疾?。òㄐ呐K纖維化［17］、缺氧損傷［18］、心肌重構(gòu)和糖尿病心肌病［19］）逐漸成為研究熱點(diǎn)。IGF1R 信號(hào)在心血管系統(tǒng)中具有控制細(xì)胞生存、分化、細(xì)胞凋亡和炎癥作用［20］。但是IGF1R 在不同類型的心臟疾病中可能發(fā)揮不同作用。Huynh 等［21］的研究表明，小鼠 IGF1R過表達(dá)能夠通過激活A(yù)KT通路減少心肌梗死和凋亡來(lái)抑制糖尿病心肌病的發(fā)生。而Takeda等［22］在高血壓心肌肥厚小鼠模型中卻檢測(cè)到IGF1R 高表達(dá)并且能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，增加心臟纖維化。為了進(jìn)一步了解IGF1R 信號(hào)通路與心血管疾病的關(guān)系，因此本研究探討了IGF1R 與心肌損傷之間的關(guān)系并明確了其作用機(jī)制。本研究觀察到IGF1R 在Ang II誘導(dǎo)的小鼠心臟損傷過程中表達(dá)顯著上調(diào)，這與既往研究在缺血性心臟病和心力衰竭時(shí)IGF1R 表達(dá)顯著升高［12］的結(jié)果一致。心臟損傷時(shí)伴有心肌細(xì)胞的代償性肥大和心室的擴(kuò)大，所以Ang II 刺激WT 小鼠后導(dǎo)致 HW、HW/BW 和 HW/TL 顯著升高，而Igf1r+/-小鼠給予Ang II 刺激后并沒有引起上述觀察指標(biāo)的變化。心肌細(xì)胞損傷后，細(xì)胞膜被破壞，細(xì)胞產(chǎn)生的心肌損傷特異性標(biāo)志物CK-MB 和cTnT 會(huì)在血液循環(huán)中升高［23］；并且心臟功能的重要指標(biāo)BNP 的表達(dá)也會(huì)增加。我們繼續(xù)觀察到，Ang II 刺激的WT 小鼠心臟組織中BNP及血清中CK-MB和cTnT顯著升高，而Igf1r+/-小鼠中Ang II誘導(dǎo)的心臟損傷明顯減輕，表明敲除IGF1R能夠緩解Ang II 誘導(dǎo)的小鼠心功能損傷。

炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致心臟損傷和重構(gòu)的一個(gè)關(guān)鍵生物學(xué)過程，并且IGF1R 在炎癥過程的啟動(dòng)中起著重要作用。既往研究顯示，Ang II能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和小鼠心肌組織炎癥小體的激活以及炎癥因子（如TNF-α、IL-1β 和IL-6）釋放［24］，這些炎癥因子的表達(dá)量越高，說(shuō)明組織炎性損傷的情況越嚴(yán)重，從而促進(jìn)心功能損傷。本研究顯示，Ang II 刺激WT 小鼠后導(dǎo)致炎癥因子TNF-α、IL-1β 和IL-6均顯著升高，而Ang II刺激的Igf1r+/-小鼠心肌組織炎癥因子水平顯著下降，表明IGF1R缺失抑制了心肌炎癥。

在Ang II 誘導(dǎo)的心肌損傷中，心臟炎癥反應(yīng)可激活凋亡信號(hào)通路，主要通過內(nèi)在途徑（線粒體）和外在途徑（受體介導(dǎo)）來(lái)促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。caspase蛋白家族廣泛參與細(xì)胞凋亡，其中caspase-3 和caspase-8是凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白：caspase-8是由腫瘤壞死因子受體家族所誘導(dǎo)的，受到Fas外在途徑凋亡通路影響［25］；caspase-3 可以通過內(nèi)在途徑（線粒體）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［25-26］。所以 caspase-3 和 caspase-8 表達(dá)越高說(shuō)明細(xì)胞凋亡越多。本研究檢測(cè)到Ang II 刺激WT 小鼠導(dǎo)致caspase-3 和caspase-8 表達(dá)顯著增加，表明出現(xiàn)了Ang II誘導(dǎo)了嚴(yán)重的細(xì)胞凋亡，但是Ang II刺激的Igf1r+/-小鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著下降，表明IGF1R敲除能夠緩解Ang II 誘導(dǎo)的心肌組織凋亡。此外，本研究通過TUNEL 染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況也得到了一致的結(jié)果。

AMPK 廣泛存在于心肌細(xì)胞中，是能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，在生理和病理情況下都發(fā)揮著重要的功能。當(dāng)心肌發(fā)生損傷時(shí)，心肌細(xì)胞中ATP 的濃度降低，激活A(yù)MPK。AMPK 激活可以減少促炎細(xì)胞因子TNF-α 的表達(dá)，發(fā)揮抗炎、抗氧化的作用，并可以抑制蛋白合成，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而對(duì)心臟起到一定的保護(hù)作用［27］。有研究表明，抑制IGF1R 表達(dá)可減輕程序性細(xì)胞死亡和炎癥，從而緩解心肌重構(gòu)［28］。但是，關(guān)于抑制IGF1R 表達(dá)是否通過激活A(yù)MPK 途徑減輕心肌損傷，目前尚未見到報(bào)道。為進(jìn)一步闡明IGF1R缺失是如何抑制心臟炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡而發(fā)揮保護(hù)心臟作用的，我們利用免疫印跡法檢測(cè)了各組小鼠心肌組織中AMPK 磷酸化水平的變化。結(jié)果顯示，Ang II 刺激WT 小鼠可導(dǎo)致其心肌組織中p-AMPK/AMPK 比值顯著降低，而Ang II 刺激的Igf1r+/-小鼠心肌組織中p-AMPK/AMPK 顯著升高，表明IGF1R敲除可能通過促進(jìn)AMPK 磷酸化來(lái)抑制心肌損傷中的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，進(jìn)而對(duì)心肌組織起到保護(hù)作用。

綜上所述，本研究顯示IGF1R敲除可減輕Ang II誘導(dǎo)的小鼠心肌損傷，并通過抑制心肌炎癥反應(yīng)和心肌細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮作用，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)小鼠心肌組織中AMPK 磷酸化有關(guān)。但關(guān)于IGF1R在Ang II 誘導(dǎo)的心肌損傷中發(fā)揮作用的具體分子機(jī)制仍需要研究。