張淑靜，趙 林，孫 超，王 靜，馬安寶，曲永赟

（1.山東省林業(yè)科學(xué)研究院，山東 濟(jì)南 250014；2.濟(jì)南棲圣農(nóng)林科技有限公司，山東 濟(jì)南 250014）

近年來(lái)，櫻桃作為一種重要的經(jīng)濟(jì)果樹(shù)在全國(guó)果業(yè)生產(chǎn)中的重要地位越來(lái)越凸顯，已成為我國(guó)鄉(xiāng)村振興、產(chǎn)業(yè)興旺的重要引擎[1-4]。目前，全國(guó)櫻桃的種植面積超過(guò)24.7 萬(wàn)hm2，年總產(chǎn)量在140 萬(wàn)t 左右[5-7]。櫻桃栽培區(qū)域遍布全國(guó)23 個(gè)省市，櫻桃已成為我國(guó)水果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要組成部分。

然而，櫻桃病蟲(chóng)害的發(fā)生已成為制約我國(guó)櫻桃產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要障礙[8-9]。其中，櫻桃枝干病害成為近年來(lái)櫻桃樹(shù)上一種毀滅性病害，發(fā)病嚴(yán)重地區(qū)直接導(dǎo)致櫻桃樹(shù)大面積枯萎死亡，造成櫻桃絕收[10-11]。但目前對(duì)于櫻桃枝干病害的病原及發(fā)病特征研究未有報(bào)道，同時(shí)如何有效采取針對(duì)性生物防治手段未見(jiàn)研究。為了明確櫻桃枝干病害病因，我們對(duì)該病的病原進(jìn)行了初步研究；同時(shí)，篩選到高效拮抗該病原的生防微生物，并探究了該菌株液體制劑對(duì)櫻桃枝干病害的防治效果，為后續(xù)針對(duì)櫻桃枝干病害微生物菌劑的研發(fā)以及櫻桃枝干病害生物防治提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查及采樣

2019年至2020年連續(xù)2年在山東省主要櫻桃產(chǎn)區(qū)煙臺(tái)福山區(qū)、濰坊臨朐縣、泰安天寶鎮(zhèn)以及淄博燕崖鎮(zhèn)進(jìn)行病害調(diào)查，調(diào)查面積超20 hm2。調(diào)查內(nèi)容主要為枝干病害發(fā)生時(shí)間、發(fā)病癥狀、危害程度以及受害株率等。

同時(shí)，我們采集發(fā)生枝干病害的枝段，統(tǒng)一編號(hào)并標(biāo)明采集地點(diǎn)和采集時(shí)間，送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌的分離等相關(guān)研究。

1.2 病原菌分離培養(yǎng)及鑒定

1.2.1 病原菌分離培養(yǎng)

將采集送回的枝段立即進(jìn)行病原菌分離。先用蒸餾水將枝段清洗干凈，再用75%乙醇溶液進(jìn)行消毒；再用無(wú)菌刀片和接種針在枝段病健交界處以及染病的木質(zhì)部和韌皮部取組織塊，接種于孟加拉紅培養(yǎng)基上，在28℃條件下恒溫培養(yǎng)。待培養(yǎng)物長(zhǎng)出，在PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行兩次轉(zhuǎn)板純化。將所有純化的培養(yǎng)物按照采集地點(diǎn)、采集時(shí)間和標(biāo)本號(hào)進(jìn)行統(tǒng)一編號(hào)，保存于4℃冰箱。

1.2.2 致病性接種試驗(yàn)

將活化好的yts-01、yts-02 接種于PDB 培養(yǎng)基中，28℃、120 r/min 培養(yǎng)72 h，經(jīng)過(guò)濾將菌絲體除去，制成yts-01 和yts-02 的孢子懸液。選用健康的2年生櫻桃樹(shù)苗作為供試材料，一共30 株，分成3 組，分別做如下處理：在同一高度處用接種針進(jìn)行扎孔處理：①在傷口處接種yts-01 孢子懸液；②在傷口處接種yts-02 孢子懸液；③在傷口處接種無(wú)菌水作為對(duì)照。選擇的櫻桃樹(shù)有一定的間隔，防止試驗(yàn)過(guò)程交叉感染。每隔5 d 觀察發(fā)病狀況。

1.2.3 病原菌形態(tài)特征觀察

將活化好的病原菌接種于PDA 培養(yǎng)基上，進(jìn)行形態(tài)特征觀察，主要包括菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速度、顏色等；制作切片在顯微鏡下對(duì)其分生孢子形態(tài)、大小等特征進(jìn)行觀察。

1.2.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定

將分離后獲得的病原菌純培養(yǎng)體送至山東森琪生物技術(shù)有限公司進(jìn)行ITS 序列測(cè)序。將測(cè)的序列在在線GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast 分析，得到相關(guān)性序列，利用MEGA7 軟件構(gòu)建yts-01 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并進(jìn)行yts-01 系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.3 熒光假單胞桿菌GH2-1 對(duì)櫻桃枝干病害病原的抑制作用

1.3.1 櫻桃枝干病害病原高效拮抗菌株篩選

利用平板對(duì)峙培養(yǎng)法，對(duì)高效拮抗櫻桃枝干病害病原越橘間座殼（Diaporthe vaccinii）的拮抗菌株進(jìn)行篩選。

將實(shí)驗(yàn)室已保存的14 株待測(cè)拮抗菌株于NA 培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，28℃恒溫培養(yǎng)24 h；用接種環(huán)挑取一環(huán)菌苔接種于含10 mL NB 培養(yǎng)基的50 mL 三角瓶中，于28℃搖床中120 r/min 均勻震蕩36 h，得到待選菌株的活化菌液。將越橘間座殼于PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行活化培養(yǎng)，28℃恒溫培養(yǎng)60 h。用打孔器在活化好的櫻桃枝干病害菌邊緣打取直徑為5 mm 的菌餅，接種在PDA 平板中央；在距中央2.0 cm 的兩側(cè)用移液槍接10 μL 待選菌液；對(duì)照組在另外兩側(cè)相同距離處接種10 μL NB 培養(yǎng)基。每一處理重復(fù)3 次。處理完成后，28℃恒溫培養(yǎng)，逐日觀察待選菌株對(duì)越橘間座殼的抑制作用；待對(duì)照組病原菌長(zhǎng)滿平板后，測(cè)量實(shí)驗(yàn)組病斑的大小，并計(jì)算抑菌率。

抑菌率=[（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）-(處理菌落直徑-菌餅直徑)]/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。

1.3.2 熒光假單胞桿菌GH2-1、發(fā)酵上清液及所產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)櫻桃枝干病害病原的抑制效果

采用平板對(duì)峙法檢測(cè)熒光假單胞桿菌GH2-1 對(duì)櫻桃枝干病害病原生長(zhǎng)的抑制效果。實(shí)驗(yàn)方法同1.3.1。

采用含毒介質(zhì)法檢測(cè)熒光假單胞桿菌GH2-1 發(fā)酵上清液對(duì)櫻桃枝干病害病原生長(zhǎng)的抑制效果。將熒光假單胞桿菌GH2-1 發(fā)酵上清液與PDA 固體培養(yǎng)基按照1:10 的比例充分混合，制成含毒平板；將櫻桃枝干病害病原菌餅接種于平板中央，對(duì)照用無(wú)菌水代替，每個(gè)處理重復(fù)3 次。后續(xù)實(shí)驗(yàn)同上。

采用倒扣平板法檢測(cè)熒光假單胞桿菌GH2-1 所產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)櫻桃枝干病害病原生長(zhǎng)的抑制效果。對(duì)照組：將櫻桃枝干病害病原的菌餅接于PDA 平板中央并倒扣于LB 固體平板上，封口。實(shí)驗(yàn)組：吸取100 μL熒光假單胞桿菌GH2-1 菌液于PDA 平板上，用滅菌的涂布棒均勻涂開(kāi)，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將櫻桃枝干病害病原菌餅接于PDA 平板中央并倒扣于熒光假單胞桿菌GH2-1 平板上，封口，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每一處理重復(fù)3 次。后續(xù)實(shí)驗(yàn)同上。

1.4 熒光假單胞菌GH2-1 液體制劑對(duì)櫻桃枝干病害防治效果

1.4.1 供試藥劑

GH2-1 液體制劑300 倍稀釋液。

1.4.2 供試材料與防治對(duì)象

供試材料為櫻桃幼苗，品種為 ‘紅寶石’；防治對(duì)象為櫻桃枝干病害，病原越橘間座殼（Diaporthe vaccinii）。

1.4.3 試驗(yàn)地情況

試驗(yàn)地設(shè)在濰坊市臨朐縣櫻桃產(chǎn)區(qū)。往年櫻桃枝干病害在該地發(fā)病嚴(yán)重，特別是櫻桃苗移栽后因感染櫻桃枝干病害成活率較低；我們于2020年3月15日、3月31日和4月15日進(jìn)行林間防治櫻桃枝干病害試驗(yàn)。所有試驗(yàn)小區(qū)栽培條件及管理措施一致，施藥時(shí)櫻桃枝干病害處于發(fā)病初期。

1.4.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及安排

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了熒光假單胞菌GH2-1 液體制劑300 倍稀釋液和不施藥清水做對(duì)照共2 個(gè)處理，每個(gè)小區(qū)200 m2，重復(fù)3 次，共6 個(gè)小區(qū)，各小區(qū)隨機(jī)排列。共施藥2 次，第1 次于2020年3月15日進(jìn)行浸根處理；移栽緩苗15 d 后于2020年3月31日第2 次施藥，本次方式為灌根，每一小區(qū)施用量100 kg；4月15 第3 次

施藥，本次方式為噴霧，每一小區(qū)施用量15 kg；5月中旬進(jìn)行發(fā)病情況調(diào)查。

1.4.5 試驗(yàn)調(diào)查及計(jì)算方法

最后1 次用藥間隔30 d 后統(tǒng)計(jì)發(fā)病狀況，并計(jì)算防治效果。

櫻桃枝干病害發(fā)病級(jí)數(shù)參照表1，以單株為單位。

表1 櫻桃枝干病害發(fā)病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Classification standard of cherry stem disease

藥效按式①、②計(jì)算：

病情指數(shù)DI（%）=[∑（病級(jí)數(shù)）×該級(jí)發(fā)病植株數(shù)）]/[（病級(jí)最高值×調(diào)查總株數(shù)）]×100%①

防治效果（%）=（對(duì)照病級(jí)指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100%②

2 結(jié)果與分析

2.1 櫻桃枝干病調(diào)查結(jié)果

2.1.1 櫻桃枝干病危害情況

在連續(xù)2年的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，櫻桃枝干病害在3年以內(nèi)樹(shù)齡的幼林中發(fā)病嚴(yán)重，特別是對(duì)剛移栽的櫻桃幼苗危害尤為嚴(yán)重；4月進(jìn)入發(fā)病高峰。通過(guò)實(shí)地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在調(diào)查的全部幼林中，發(fā)病嚴(yán)重地區(qū)占40%左右，此病區(qū)櫻桃感病率高達(dá)80%以上，死株率約50%以上，特別嚴(yán)重的幾乎全部死亡。

2.1.2 櫻桃枝干病病癥特征

櫻桃枝干病發(fā)病后，樹(shù)干表面有明顯內(nèi)陷區(qū)域，明顯感到樹(shù)皮與樹(shù)干分離；但初發(fā)病源顏色變化不明顯；進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，病原侵染后，發(fā)病部位由木質(zhì)部向韌皮部擴(kuò)展逐漸變黑腐爛，也可由韌皮部向木質(zhì)部擴(kuò)展變黑腐爛，還表現(xiàn)在由近根處向遠(yuǎn)根處進(jìn)行擴(kuò)展，最終導(dǎo)致主桿或側(cè)枝干枯（圖1）。

為了進(jìn)一步確定櫻桃枝干枯死是由病原菌感染所致，我們將部分樣品噴灑無(wú)菌水保濕，3 天后發(fā)現(xiàn)在枝段橫切木質(zhì)部有大量真菌生長(zhǎng)（圖2）。

圖2 感病枝段木質(zhì)部真菌生長(zhǎng)狀況Figure 2 Growth status of xylem fungi in susceptible branches

2.2 病原菌分離培養(yǎng)及鑒定

2.2.1 病原菌分離培養(yǎng)

利用真菌分離技術(shù)將采集送回的142 個(gè)枝段樣品進(jìn)行病原菌分離純化，共分離314 株真菌。經(jīng)平板培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，所有分離菌株分為兩種菌落形態(tài)，其中289 株菌落形態(tài)一致，編號(hào)為yts-01；剩余25 株菌落形態(tài)一致，編號(hào)為yts-02。由此，我們初步推測(cè)yts-01 為櫻桃枝干病害的病原菌。

2.2.2 致病性接種試驗(yàn)

由于致病性接種試驗(yàn)期間溫度和濕度處于發(fā)病最佳條件，在處理10 d 后即可觀察到接種部位發(fā)生變化。結(jié)果顯示，接種yts-01 孢子懸浮液的櫻桃全部發(fā)病，在接種處出現(xiàn)褐色病斑且該區(qū)域明顯內(nèi)陷；接種yts-02 和無(wú)菌水的櫻桃均不發(fā)病。

對(duì)發(fā)病的部位取樣進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)分離到的菌株菌落形態(tài)與試驗(yàn)菌株yts-01一致，符合柯赫氏法則。以上結(jié)果證實(shí)yts-01 為櫻桃枝干病害的病原菌。

2.2.3 病原菌形態(tài)特征觀察

接種在PDA 培養(yǎng)基上的yts-01 菌落生長(zhǎng)速度快，平均生長(zhǎng)速度為1.5 cm/d，6 d 左右基本長(zhǎng)滿平板（圖3-A）。菌落初期為白色、圓形，氣生菌絲疏松不緊密，隨著生長(zhǎng)，出現(xiàn)不規(guī)則同心圓（圖3-A）。后期，在同心圓上生長(zhǎng)出子座（生長(zhǎng)第6 d開(kāi)始出現(xiàn)），且菌落表面變灰色（圖3-B，圖3-C）。

圖3 yts-01 菌落培養(yǎng)特征Figure 3 Colony culture characteristics of yts-01

分生孢子梗較短或分化不明顯，分生孢子串生于分生孢子梗上，呈現(xiàn)圓形、橢圓、長(zhǎng)圓柱等形狀，長(zhǎng)度5～7 μm（圖4）。

圖4 yts-01 分生孢子Figure Conidia of yts-01

2.2.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定

我們將測(cè)序結(jié)果與GenBank 中收錄的DNA 序列進(jìn)行比對(duì)，并建立yts-01 進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果說(shuō)明，櫻桃枝干病病原菌yts-01 與Diaporthe vaccinii（Accession No.LC206678）聚成一支，同源性最高（圖5）。

圖5 yts-01 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 5 Phylogenetic tree of yts-01

因此，綜合菌株的ITS 序列分析與形態(tài)學(xué)特征，鑒定yts-01 為越橘間座殼（Diaporthe vaccinii）。

2.3 熒光假單胞桿菌GH2-1 對(duì)櫻桃枝干病害病原的抑制作用

2.3.1 櫻桃枝干病害病原高效拮抗菌株篩選

結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)例1 中分離到的14 株菌中，有6 株菌對(duì)櫻桃枝干病害菌生長(zhǎng)有抑制效果，分別為GH2-1、GH2-2、GH2-4、GH2-5、GH2-6 和GH2-9（表2）；通過(guò)對(duì)不同菌株抑菌率計(jì)算統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，菌株GH2-1 對(duì)櫻桃枝干病害菌抑制效果高達(dá)90.98%，顯著高于其他菌株（表2）。

表2 不同菌株抑菌率統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of bacteriostasis rate of different strains

前期，我們已鑒定GH2-1 為熒光假單胞菌，故結(jié)合上述抑菌率結(jié)果，選擇熒光假單胞菌GH2-1 為研究對(duì)象進(jìn)行后續(xù)相關(guān)研究。

2.3.2 熒光假單胞桿菌GH2-1、發(fā)酵上清液及所產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)櫻桃枝干病害病原的抑制效果

從圖6可以看出，熒光假單胞桿菌GH2-1、發(fā)酵上清液及其所產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)和對(duì)櫻桃枝干病害病原的生長(zhǎng)有明顯的抑制效果（圖6A、B、C）；抑制后的櫻桃枝干病害病原菌落直徑顯著低于對(duì)照（圖6D、E、F）；抑菌率分別為94.49%、62.51%和72.41%。以上結(jié)果說(shuō)明，熒光假單胞桿菌GH2-1 及其產(chǎn)物能夠高效抑制櫻桃枝干病害病原的生長(zhǎng)。

圖6 熒光假單胞桿菌GH2-1 及其發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)櫻桃枝干病害病原生長(zhǎng)的抑制效果（結(jié)果顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n≥3）。**p＜0.01）Figure 6 Inhibitory effect of Pseudomonas fluorescens GH2-1 and its products on the growth of cherry stem disease pathogens

2.4 熒光假單胞菌GH2-1 液體制劑對(duì)櫻桃枝干病害防治效果

表3結(jié)果表明，最后一次施藥后30 d 后，熒光假單胞菌（P.fluorescens）菌株GH2-1 液體制劑對(duì)櫻桃枝干病害有較好的防治效果，防治效果為74.3%。這進(jìn)一步說(shuō)明菌株GH2-1 在櫻桃枝干病害防治中具有廣泛應(yīng)用前景。

表3 各個(gè)處理后櫻桃枝干病害的發(fā)病指數(shù)及防治效果Table 3 Disease index and control effect of cherry branch disease after each treatment

3 結(jié)論與討論

有文獻(xiàn)報(bào)道，越橘間座殼（Diaporthe vaccinii）能夠引起核桃枝枯病、藍(lán)莓枝枯病的發(fā)生，但未見(jiàn)越橘間座殼引起櫻桃枝干病害的報(bào)道[12-13]。本文從感染櫻桃枝干病的櫻桃枯枝中分離到病原yts-01，通過(guò)柯赫氏法則驗(yàn)證該菌株為櫻桃枝干病害的病原，利用形態(tài)特征觀察及分子生物學(xué)鑒定確定yts-01 為越橘間座殼。由越橘間座殼引起櫻桃枝干病害為首次發(fā)現(xiàn)。鑒于該病具有傳染性強(qiáng)、危害范圍廣、傳播隱匿等特點(diǎn)，應(yīng)對(duì)其生物學(xué)特性和發(fā)生發(fā)展規(guī)律進(jìn)行深入研究，為后續(xù)病害防治提供更多理論依據(jù)。

生物防治因其具有環(huán)保、安全、有效、可持續(xù)等特點(diǎn)成為目前植物病害防治研究熱點(diǎn)[14-15]。本文在確定越橘間座殼為櫻桃枝干病害的病原的基礎(chǔ)上，通過(guò)平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)篩選了對(duì)該病害病原有高效抑制效果的熒光假單胞桿菌GH2-1；并對(duì)熒光假單胞菌GH2-1 的拮抗功能進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，熒光假單胞桿菌GH2-1、發(fā)酵上清液及其所產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)和對(duì)櫻桃枝干病害病原的生長(zhǎng)有明顯的抑制效果（圖6A、B、C）；抑制后的櫻桃枝干病害病原菌落直徑分別顯著低于對(duì)照 （圖6D、E、F）；抑菌率分別為94.49%、62.51%和72.41%。這表明，熒光假單胞桿菌GH2-1 及其產(chǎn)物能夠高效抑制櫻桃枝干病害病原的生長(zhǎng)，但對(duì)于發(fā)揮作用的具體物質(zhì)以及作用原理還需進(jìn)一步研究。

眾所周知，外界非生物因素以及寄主、其他微生物等生物因素都會(huì)嚴(yán)重影響微生物生防制劑在田間防效的穩(wěn)定性，致使其優(yōu)勢(shì)難以長(zhǎng)時(shí)間保持[16]。本文初步研究了熒光假單胞桿菌GH2-1 對(duì)櫻桃枝干病害田間防效，結(jié)果表明，熒光假單胞菌GH2-1 液體制劑在櫻桃枝干病害防治中具有廣泛應(yīng)用前景。后期，還需要根據(jù)櫻桃枝干病害的發(fā)病特點(diǎn)以及熒光假單胞桿菌GH2-1 用藥方式選擇合適的劑型制成微生物菌劑，為櫻桃枝干病害生物防治做出更大貢獻(xiàn)。