黃雙杰，常亞麗，趙雅梅，曹夢珍，陳 義，郭桂義

（信陽農(nóng)林學(xué)院茶學(xué)院/河南省豫南茶樹資源綜合開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南省茶葉加工與檢測工程技術(shù)研究中心，河南 信陽 464000）

茶作為世界三大非酒精飲料之一，因具有獨(dú)特的滋味、香氣、營養(yǎng)價(jià)值和保健功效而受到廣大消費(fèi)者的喜愛。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界飲茶人口已超過30億，遍布160多個國家和地區(qū)［1］。近年來，隨著人們生活水平的提高，食品安全越來越受到關(guān)注。茶樹作為多年生葉用作物，具有喜氮和易于積累硝酸鹽的特點(diǎn)［2,3］。因此，建立和完善茶葉中硝酸鹽含量的檢測方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前國內(nèi)外已報(bào)道的硝酸鹽測定方法有很多［3,4］，如分光光度法［5］、離子色譜法［6,7］、氣相分子吸收光譜法［8］和電化學(xué)法［9］等。其中，分光光度法具有操作簡單、經(jīng)濟(jì)、對實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求低等特點(diǎn)，應(yīng)用較為普遍。水楊酸比色法作為分光光度法的一種，常用于植物組織中硝酸鹽氮含量的測定，其原理是在濃H2SO4條件下，NO3-與水楊酸反應(yīng)生成硝基水楊酸，產(chǎn)物硝基水楊酸在堿性條件下（pH＞12）顯黃色，于波長410 nm處有最大吸收峰，在一定范圍內(nèi)，其顏色深淺與含量成正比，可直接比色測定［10］。水楊酸比色法測定茶葉硝酸鹽的研究早有報(bào)道［11,12］，但筆者在采用水楊酸比色法測定茶葉硝酸鹽氮含量時(shí)發(fā)現(xiàn)，茶葉消煮后的濾液為黃褐色，加顯色劑后并不呈現(xiàn)特征性顏色，可能由于茶葉中含有大量的多酚、色素和抗壞血酸等物質(zhì)，干擾了顯色效果。古小玲等在采用比色法測定茶葉亞硝酸鹽時(shí)遇到同樣的問題，通過加入堿式乙酸鉛飽和溶液對茶湯進(jìn)行脫色處理，將回收率提高到60%［13,14］。

活性炭是由木質(zhì)、煤質(zhì)和石油焦等含碳原料經(jīng)熱解、活化加工制備而成，是一種價(jià)格低廉、吸附性能良好的吸附劑，具有發(fā)達(dá)的孔隙結(jié)構(gòu)、較大的比表面和良好的化學(xué)結(jié)構(gòu)，能夠吸附液體中的色素物質(zhì)，具有脫色、脫臭的效果［15］。依據(jù)形狀可將其分為粉末和顆粒兩大類［16］，其中粉末活性炭常用于飼料［16］、醬腌菜［17］和調(diào)味醬［18］中的硝酸鹽和亞硝酸鹽測定，脫色效果良好，回收率在95%以上。那么它是否可用于茶葉硝酸鹽氮含量測定，目前尚不清楚。本研究在水楊酸比色法的基礎(chǔ)上，首先以脫色效果為考察指標(biāo)，探索粉末活性炭1（Active carbon 1，AC1）和活性炭2（Active carbon 2，AC2）的脫色效果，確定最佳用量，在此基礎(chǔ)上對系列濃度硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行處理，研究最佳用量條件下兩種活性炭對硝態(tài)氮回收率的影響，確定一種較好的脫色劑，使水楊酸比色法測定硝酸鹽在茶葉上得以應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

SpectraMax M2酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；H1850R臺式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；FW100高速萬能粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器公司）；FA2104SN電子分析天平（1/10000，上海青浦）；SYG-1-1電熱恒溫水浴鍋（上海本亭儀器有限公司）；Milli-Q Biocel純水系統(tǒng)（法國JSAZ公司）；Costar 96孔酶標(biāo)板（美國Corning公司）。

水楊酸、濃硫酸和氫氧化鈉、硝酸鉀（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；去離子水（18.25 MΩ cm）。

1.2 材料與處理

供試材料為七年生的福鼎大白茶［Camellia sinensis(L.) O. Kuntze. cv.Fuding dabaicha］的成熟葉（生物學(xué)頂端往下計(jì)算，第五片葉）和嫩梢，取自信陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研基地。將茶樹的成熟葉和嫩梢放于微波爐中，中高火殺青2 min，置于70～80℃的烘箱，烘至恒重，用萬能粉碎機(jī)粉碎均勻，裝入自封袋，放入-20℃冰箱，用于活性炭脫色試驗(yàn)。

AC1（分析純，鄭州申淘友儀器有限公司）：材質(zhì)為木屑，粉狀，細(xì)度為80目（占比15%）和200目（占比85%）混合，理論比表面積為450～900 m2·g-1；AC2（優(yōu)級純，鄭州牛特牌農(nóng)業(yè)技術(shù)有限公司）：材質(zhì)為椰殼，粉狀，細(xì)度為200目，理論比面積約1000 m2·g-1。

1.2.1 樣品處理

稱取3 g磨碎混勻后的茶粉，置于250 mL錐形瓶中，加入150 mL去離子水，用保鮮膜封口，置入沸水浴中提取30 min后取出，抽濾，將試樣洗入250 mL容量瓶中，加水定容至刻度。

1.2.2 試劑配法

NO3--N標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 mg·L-1）：精確稱取0.7221 g烘干至恒重的硝酸鉀溶于去離子水中，定容至1000 mL。

5%水楊酸-硫酸溶液：稱取5 g水楊酸溶于100 mL濃硫酸（密度為1.84）中，攪拌溶解后，貯存于棕色瓶中，置冰箱保存1周有效。

8%氫氧化鈉溶液：稱取20 g氫氧化鈉溶于250 mL去離子水中。

1.2.3 脫色活性炭用量探索

預(yù)實(shí)驗(yàn)過程中，在6 mL的茶樣濾液中逐漸添加活性炭，AC1和AC2分別添加至6 g和0.6 g時(shí)，茶樣濾液顏色初步消失。為進(jìn)一步確定確定兩種活性炭用量對茶樣濾液干擾色素的脫色效果，取6 mL經(jīng)1.2.1項(xiàng)下處理后的濾液9份，分別放入9支10 mL刻度帶蓋離心管中，分別標(biāo)記為0、1、2、3、4、5、6、7和8號管，依次加入不同劑量的AC1或AC2（表1）。蓋好蓋后震蕩搖勻3～5 min，8000 rpm離心20 min，用注射器吸取上清液2 mL，過0.45 μm孔徑的水系濾膜于1.5 mL離心管中，觀察濾液脫色效果。

表1 兩種活性炭用量對茶液顏色去除效果Table 1 Effect of AC1 or AC2 in various dosages on color removal of tea extract

1.2.4 硝態(tài)氮系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

吸取100 mg·L-1NO3--N標(biāo)準(zhǔn)溶液0、2.5、5、10、15、20、30、40、50和60 mL分 別 放 入100mL的容量瓶，用去離子水定容至刻度，使之成0、2.5、5、10、15、20、30、40、50和60 mg·L-1NO3--N系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.5 最佳用量條件下兩種活性炭對硝態(tài)氮測定結(jié)果和回收率的影響

預(yù)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)兩種活性炭均具有茶樣濾液脫色效果，但是否在吸附色素的同時(shí)帶走硝態(tài)氮還不清楚。為進(jìn)一步探索最佳用量條件下兩種活性炭對硝酸鹽測定結(jié)果和回收率的影響，設(shè)置3個處理組：對照組（CK）、活性炭1組（AC1）和活性炭2組（AC2）。CK：為1.2.4項(xiàng)下配制的NO3--N系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，不添加活性炭；AC1：在CK基礎(chǔ)上加入1.2.3項(xiàng)下脫色所需要的AC1的量；AC2：在CK基礎(chǔ)上加入1.2.3項(xiàng)下脫色所需要的AC2的量（表2）。

表2 標(biāo)準(zhǔn)工作液前處理Table 2 Pretreatment on standard solutions

吸取上述處理組樣品液0.2 mL置于10 mL刻度帶蓋離心管中，加入5%的水楊酸-硫酸溶液0.4 mL，混勻后置室溫下20 min，再加入9.4 mL 8%NaOH溶液，待冷卻至室溫后，以空白做參比，在酶標(biāo)儀410 nm波長下測其吸光度。用CK標(biāo)準(zhǔn)曲線上的回歸方程計(jì)算活性炭脫色后NO3--N濃度，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)液脫色后的NO3--N回收率。

AC回收率（%）＝AC/CK×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種活性炭加入量確定

為探索兩種活性炭能否去除茶樣濾液中的干擾色素，在6 mL的前處理液中逐漸添加活性炭，觀察兩種活性炭處理下濾液的顏色變化。由圖1可知，隨著活性炭用量的增加，茶樣濾液顏色逐漸由深變淺直至消失，當(dāng)AC1用量增加至6 g（1%，W/V），AC2用量為0.6 g（1‰，W/V）時(shí)，濾液顏色初步消失。故本試驗(yàn)確定6 mL備用濾液中加入AC1的量為6 g，AC2為0.6 g。以上結(jié)果表明AC1和AC2均能達(dá)到脫色效果，且AC2的脫色效果強(qiáng)于AC1。

圖1 兩種活性炭對茶葉濾液顏色去除效果Fig. 1 Effects of activated carbon treatments on color removal of tea extract

2.2 最佳用量條件下兩種活性炭對硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)液測定結(jié)果和回收率的影響

為進(jìn)一步探索1% AC1和1‰ AC2是否依賴硝態(tài)氮濃度對茶樣濾液中硝態(tài)氮產(chǎn)生吸附效果，配制系列不同濃度的硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)行活性炭脫色回收試驗(yàn)。與CK相比，AC1處理下的各濃度硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)液的顏色沒有明顯變化，而AC2處理后的顏色明顯變淡（圖2-A）。對410 nm波長下的吸光度進(jìn)行測定，通過相關(guān)性分析計(jì)算回歸方程，發(fā)現(xiàn)CK與AC1處理?xiàng)l件下的硝態(tài)氮濃度與吸光度顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.9995和0.9998，而AC2處理后的硝態(tài)氮濃度與吸光度的相關(guān)性較低，R2為0.9396（圖2-B）。

圖2 活性炭處理對濾液硝態(tài)氮濃度的影響Fig. 2 Effects of activated carbon treatments on NO3--N concentration in filtrate

進(jìn)一步將吸光度代入CK組直線回歸方程計(jì)算硝態(tài)氮濃度，并統(tǒng)計(jì)回收率，與CK相比，AC1處理下的各硝態(tài)氮濃度變化較小，統(tǒng)計(jì)差異不顯著，回收率在96.61%～115.04%；而AC2處理下的各硝態(tài)氮濃度顯著下降，回收率受硝態(tài)氮濃度的影響，在硝態(tài)氮濃度為0～5 mg·L-1時(shí)，回收率為0%，而在10～60 mg·L-1范圍時(shí)，回收率隨硝態(tài)氮濃度的增加由2.24%增加到29.24%（表3）。

表3 活性炭處理對濾液中硝態(tài)氮回收率的影響Table 3 Effects of activated carbon treatments on recovery of NO3--N in filtrate

3 結(jié)論與討論

植物體內(nèi)硝態(tài)氮含量，不僅反映植物的氮素營養(yǎng)狀況，而且對于鑒定食用植物及其加工制品的品質(zhì)也有重要意義。水楊酸比色法常用于植物體內(nèi)硝態(tài)氮含量的測定，但與其他植物不同，茶葉中含有大量茶多酚、色素等復(fù)雜化合物，對茶葉硝態(tài)氮的測定存在干擾，樣品前處理一直是個難題。古小玲等［14］在測定茶葉亞硝酸鹽時(shí)，采用堿式乙酸鉛和硫酸溶液對茶湯進(jìn)行脫色和參數(shù)優(yōu)化，將回收率提高到72.90%～86.53%。本研究嘗試?yán)没钚蕴苛己玫奈叫阅?，探索了兩種粉末活性炭對茶葉前處理液的脫色效果和硝態(tài)氮回收率的影響。結(jié)果表明，兩種活性炭均具備脫色效果，對于等量備用濾液，脫色所需AC1和AC2的量分別為1%和1‰（圖1），與AC1相比，AC2的脫色效果較好，但對硝態(tài)氮的吸附也較強(qiáng)，造成回收率顯著減少。AC2對回收率的影響依賴溶液中硝態(tài)氮的濃度，在硝態(tài)氮濃度為0～5 mg·L-1時(shí)，回收率為0%，而在10～60 mg·L-1范圍時(shí)，回收率隨硝態(tài)氮濃度的增加由2.24%增加到29.24%；而AC1對硝態(tài)氮的影響較小，回收率在96.61%～115.04%之間（表3）。因此本研究表明可采取1% AC1對茶樣濾液進(jìn)行脫色。

吸附是一個復(fù)雜的表面現(xiàn)象，影響活性炭吸附的因素有很多，如較大的比表面積、表面豐富的官能團(tuán)和離子交換量等［19］比表面是影響活性炭物理吸附性能的主要因素之一，比表面積的大小決定了吸附質(zhì)吸附位點(diǎn)的多少［20］。本研究所采用的AC2理論比表面積較大，可能是其吸附性能較高的原因之一?；钚蕴勘砻娴墓倌軋F(tuán)主要分為含氧官能團(tuán)和含氮官能團(tuán)，前者包括羧基、羧酸酐、內(nèi)酯基、羥基和羰基等，特別是酸性官能團(tuán)使活性炭表現(xiàn)出極性特征和陽離子交換特性；后者包含氨基、內(nèi)酞胺基、類吡啶基和類酰胺基等，使活性炭表面表現(xiàn)出堿性特征以及陰離子交換特性［19－21］。有研究認(rèn)為兩種官能團(tuán)能夠分別為NH4+和NO3-提供陽離子和陰離子交換位點(diǎn)，在脫氮應(yīng)用中發(fā)揮重要作用［21,22］。本研究中AC2表現(xiàn)出對NO3-的強(qiáng)烈吸附特性，推測其表面可能含有大量的含氮官能團(tuán)?？赡芤?yàn)槭忻婀?yīng)的活性炭性質(zhì)參數(shù)有限，一些常規(guī)比色法盡管也提到添加活性炭去除色素，但并未對活性炭的規(guī)格、劑量和性質(zhì)參數(shù)提出明確要求，因此在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)測定目標(biāo)選擇適合的活性炭，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。