李 赟， 尹 萍， 張武文， 李 凱， 童國慶

（上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，上海 201203）

近年來，全球借助輔助生殖技術助孕的患者持續(xù)增多[1]。體外受精（in vitro fertilization，IVF）是目前治療不孕癥的主要方法。精子形態(tài)是精液參數(shù)的重要指標之一，其對胚胎發(fā)育的影響尚有不確定性[2-3]。本研究篩選了上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院生殖醫(yī)學中心因女方輸卵管因素行IVF的患者，收集取卵當日優(yōu)化處理后的精液，通過分析正常形態(tài)精子百分率對胚胎發(fā)育的影響，探索可以改善IVF臨床治療結(jié)局的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2019年6月—2020年12月上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院生殖醫(yī)學中心行IVF的患者255例。入組標準：（1）單純因輸卵管因素導致不孕；（2）女方年齡≤35歲；（3）術前體檢中未發(fā)現(xiàn)異常指標；（4）獲卵數(shù)≥3個；（5）男方年齡≤45歲；（6）男科門診生育力檢查未發(fā)現(xiàn)器質(zhì)性疾病。取卵當日對經(jīng)優(yōu)化處理的精液進行精子形態(tài)學分析，正常形態(tài)精子百分率均高于臨床正常值（≥4%），符合最佳IVF授精要求。以正常形態(tài)精子百分率均值為分界點分為A組（正常形態(tài)精子百分率≤19.03%，128例）和B組（正常形態(tài)精子百分率＞19.03%，127例）。本研究納入標本的正常形態(tài)精子百分率情況見表1。

表1 正常形態(tài)精子百分率

1.2 精液樣本采集

男方禁欲2～7 d，采集精液前排尿，并用肥皂清潔以減少標本污染，使用手淫法在專用取精室收集精液標本，置于37 ℃培養(yǎng)箱中溫育30 min后觀察1次，然后10 min觀察1次，總時長不超過1 h，待完全液化后行精液優(yōu)化 處理。

1.3 精液優(yōu)化處理

采用密度梯度離心法進行精液優(yōu)化處理：在15 mL的專用離心管中加入1～2 mL 80%濃度的梯度液，在其上方緩慢地加入相應體積的40%濃度梯度液，沿管壁加入2～4 mL精液，使其形成明顯分界線后，300×g離心20 min，棄上清液，用相同體積培養(yǎng)液混勻、沉淀；取5 μL優(yōu)化處理的精液，加入10 μm厚Marker精子計數(shù)板（以色列Sefi Medical Instruments公司）腔室，計算精子密度，并將其調(diào)整至前向運動精子總數(shù)＞10×106/mL；留取適量精液推片，用于精子形態(tài)分析；其余精液待后續(xù)IVF加精使用。

1.4 精子形態(tài)分析

采用新型改良巴氏染色法（珠海貝索生物技術有限公司）對精液涂片進行染色分析。（1）將精液涂片放入95%乙醇固定不少于 15 min；（2）依次浸入80%、50%乙醇各30 s后緩水洗干凈；（3）放入蘇木精染液染色3～ 5 min后，水洗12 min；（4）酸性乙醇（70%乙醇200 mL加入1 mL濃鹽酸）溶液浸1～4次；（5）緩水沖洗回藍，平衡5 min后，依次放置于50%、80%乙醇30 s，再用6.95%乙醇脫水 2 min；（6）浸入改良巴氏染色液2～5 min，瀝凈；（7）用95%乙醇洗2次，每次10～20 s；（8）用無水乙醇脫水30 s，取出，待風干后行顯微鏡鏡檢。讀片人員為2位取得世界衛(wèi)生組織人類精液與處理實驗手冊培訓證書者。評判標準參照《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》[4]中的精子形態(tài)學標準，在油鏡下分析精子頭部的頂體、細胞核、頸部和中段、主段的形態(tài)；每次連續(xù)計數(shù)完全鏡下視野精子數(shù)不少于200條；2次計數(shù)核準需符合95%可信區(qū)間范圍，計算每份標本2次計數(shù)的均值。

1.5 IVF

采用3037受精皿進行IVF，每個3037受精皿中加入卵母細胞≤15個。加精后，將培養(yǎng)皿放置于37 ℃、6%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。受精 1 6～1 8 h后觀察受精情況。以卵細胞原核（pronucleus，PN）≥1為受精，記錄受精情況，其中2PN為正常受精。取卵72 h后再次觀察，記錄胚胎細胞數(shù)和細胞內(nèi)的碎片情況。按胚胎實驗室標準操作規(guī)程（standard operation procedure，SOP）觀察胚胎等級，執(zhí)行標準分為4個等級：（1）Ⅰ級為卵裂球大小均勻，形態(tài)規(guī)則，透明帶完整，細胞質(zhì)均勻、清晰，無顆粒，碎片率為0%～5%；（2）Ⅱ級為卵裂球大小略不均勻，形態(tài)較不規(guī)則，細胞質(zhì)內(nèi)有顆粒，碎片率為6%～20%；（3）Ⅲ級為卵裂球大小明顯不均勻，有明顯的形態(tài)不規(guī)則，細胞質(zhì)內(nèi)有較多顆粒，碎片率為21%～50%；（4）Ⅳ級為卵裂球大小嚴重不均勻，細胞質(zhì)內(nèi)有非常多的顆粒，碎片率＞50%。6個細胞，Ⅰ、Ⅱ級胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎；≥6個細胞，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級胚胎為有效胚胎。

1.6 主要觀察指標

主要觀察指標包括受精率（受精數(shù)/取卵數(shù)×100%）、異常受精率（異常受精數(shù)/受精數(shù)× 100%）、卵裂率（卵裂數(shù)/受精數(shù)×100%）、優(yōu)質(zhì)胚胎率（優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/有效胚胎數(shù)×100%）、有效胚胎率（有效胚胎數(shù)/卵裂數(shù)×100%）。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計分析，非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)P25～P75）]表示，組間比較采用Z檢驗。計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 A組與B組基本資料比較

A組與B組基本資料差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.2 2個組胚胎相關指標比較

B組有效胚胎率顯著高于A組（P=0.038）；受精率、卵裂率、異常受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎率2個組差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表2 A組與B組基本資料比較

表3 精液優(yōu)化處理后正常形態(tài)精子百分率與胚胎相關參數(shù)的關系

3 討論

隨著我國生育政策的放開，居民生育需求大幅增加，但其中有10%～15%的有生育意愿的夫婦患有不孕不育癥[5]，使得我國輔助生殖總周期數(shù)一直呈上升的趨勢。精子對卵子的激活是IVF技術的關鍵步驟[6]，精子形態(tài)是重要的精子基礎參數(shù)，直接影響精子的功能[7-8]。正常形態(tài)精子百分率對胚胎發(fā)育的影響目前尚不明確。有研究結(jié)果顯示，正常形態(tài)精子百分率不影響胚胎發(fā)育[9-10]；但也有學者采用世界衛(wèi)生組織精液分析評判標準[4]，發(fā)現(xiàn)正常精子形態(tài)會影響IVF的胚胎發(fā)育[11-13]；但這些研究均未提及精液標本是否收集于IVF取卵當日。由于男性精液質(zhì)量有一定的波動性，所以本研究嚴格篩選了單純因女方輸卵管因素行IVF的非高齡女性，男方未見器質(zhì)性異常，且獲卵數(shù)≥3個的IVF周期。收集取卵當日獲取的新鮮精液，并進行優(yōu)化處理，使前向精子總數(shù)＞10×106/mL。 由于無法將評估后的精子再用于IVF，多數(shù)胚胎實驗室SOP未將精子形態(tài)作為IVF常規(guī)檢測。本研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化處理后的正常形態(tài)精子百分率對胚胎發(fā)育過程中的受精率、卵裂率、異常受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎率無影響（P＞0.05），但對有效胚胎率有顯著影響（P=0.038），提示精子形態(tài)缺陷可能對胚胎的發(fā)育有負面影響。NIKOLOVA等[14]也證實了這一結(jié)論，他們對精子形態(tài)、活率以及DNA碎片與胚胎形態(tài)動力學及IVF臨床妊娠結(jié)果的相關性進行了分析，發(fā)現(xiàn)精子缺陷（卷尾、頭部缺陷和多重缺陷）不僅對胚胎形態(tài)動力學有影響，對臨床妊娠率亦有顯著影響。因此，IVF當日精子形態(tài)分析可作為臨床結(jié)果的潛在預測因子[14]。正常形態(tài)精子百分率相對較低的患者，精子頭部可能存在內(nèi)部缺陷，而精子頭部缺陷主要影響胚胎發(fā)育的最后階段，精子中段缺陷與胚胎卵裂有關，尾部缺陷與胚胎的早期發(fā)育有關。已有研究證實了精子質(zhì)量可能與精子的染色質(zhì)區(qū)域組裝分離是否存在異常、精子DNA的完整和凋亡[15-16]、精子是否存在于高濃度的活性氧（reactive oxygen species，ROS）環(huán)境有關[17]。 高濃度的ROS會對精子的DNA造成損傷，從而導致精子的DNA產(chǎn)生單鏈或雙鏈斷裂?；谙嚓P研究的推測，本研究對精液進行了優(yōu)化處理，去除不活動的死精子和精液中的白細胞，以及少量原始細胞，降低ROS水平，從而優(yōu)化整體精液參數(shù)。有研究發(fā)現(xiàn)，精液優(yōu)化處理可以顯著提高精子正常形態(tài)百分率，優(yōu)化精子質(zhì)量[18]，降低ROS，減少精子的損傷，從而提高精卵結(jié)合后正常發(fā)育的可能性[19]，凸顯了精液優(yōu)化處理的重要性。本研究結(jié)果顯示，高正常形態(tài)精子百分率可顯著增加有效胚胎率，提示精液優(yōu)化處理后，正常形態(tài)精子百分率可用于預測胚胎實驗室中胚胎發(fā)育的結(jié)局。

綜上所述，對因女方輸卵管因素而導致不孕、男方在生育能力上不存在器質(zhì)性異常的夫婦，建議在進入IVF治療周期前，先行優(yōu)化處理后的精子形態(tài)學檢查，評估正常形態(tài)精子百分率的水平，相對較高的正常形態(tài)精子百分率有利于IVF時在胚胎培養(yǎng)過程中得到相對較好的胚胎結(jié)局；而對于即使在精液優(yōu)化處理后，正常形態(tài)精子百分率僅高于參考區(qū)間的患者，建議先行早期男科臨床治療干預措施，以輔助提高精子形態(tài)質(zhì)量，提高有效胚胎率，從而獲得更好的胚胎結(jié)局，改善IVF治療的結(jié)局。