李 程， 周 旻， 雷博雅， 常 青， 曹文俊， 王朱健

（1. 復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院檢驗科，上海 200031；2. 復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科，上海 200031）

急性視網(wǎng)膜壞死（acute retinal necrosis，ARN）是一種嚴(yán)重的急性致盲性眼病，主要病因是皰疹病毒感染，包括水痘帶狀皰疹病毒（varicella-zoster virus，VZV）、單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）1型和2型、人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV），以VZV最為常見。ARN病情發(fā)展迅速，預(yù)后較差，及時診斷、治療對預(yù)后至關(guān)重要。臨床上主要根據(jù)臨床表現(xiàn)評估患者病情和抗病毒治療效果。患者臨床表現(xiàn)不典型，或出現(xiàn)晶狀體、玻璃體渾濁進而會影響眼底觀察，干擾診斷。目前，ARN的治療劑量、時間和治療方式尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，需要客觀、有效的指標(biāo)來評估ARN的治療效果。2015年，日本眼科協(xié)會把眼內(nèi)液病毒核酸和抗體檢測納入ARN的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，為ARN的診斷提供了新的依據(jù)。本研究擬通過動態(tài)監(jiān)測接受抗病毒治療的ARN患者房水中VZV DNA載量和IgG抗體的水平，探討其在療效評估中的價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年12月—2019年12月復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院確診為ARN的患者11例，其中男7例、女4例，年齡38～73歲，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照美國葡萄膜炎協(xié)會相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[2]。所有患者均為單眼發(fā)病，確診前均未接受抗病毒治療，排除免疫缺陷疾病。ARN患者確診后均接受8周的強化抗病毒治療，包括玻璃體腔注射、靜脈注射和口服抗病毒藥物。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者自愿簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 ARN患者在眼內(nèi)注射藥物之前行前房穿刺術(shù)，取患病眼房水100 μL。隨后在治療第4天、1周、2周、3周、4周和8周分別采集房水100 μL，-80 ℃凍存。對房水樣本先采用多重聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）進行病毒定性檢測，檢測的病毒包括HSV-1、HSV-2、VZV、EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）、巨細胞病毒（cytomegalovirus，CMV）。VZV DNA陽性患者再采用實時熒光定量PCR檢測病毒載量。

1.2.2 VZV DNA定量檢測 將VZV DNA標(biāo)準(zhǔn)品進行10 倍系列梯度稀釋，作為模板，采用ABI7500熒光定量PCR儀（美國ABI公司）進行實時熒光定量PCR，VZV DNA檢測試劑盒購自武漢百泰基因工程有限公司。嚴(yán)格按試劑和儀器說明書操作，VZV DNA檢出限為1×103拷 貝/mL。

1.2.3 VZV IgG抗體檢測 將凍存的房水樣本取出，平衡至室溫，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測VZV IgG抗體，試劑盒購自德國VirionSerion公司，檢測儀器為Sunrise酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司）。嚴(yán)格按儀器和試劑盒說明書進行操作。以房水S/CO值高于陰性對照的x +2s為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用MedCalc 15.8軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的計量資料以x ±s表示，多組間比較采用ANOVA檢驗。呈非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用Friedman非參數(shù)檢驗。采用Spearman秩相關(guān)分析評估病毒載量對數(shù)值與其他指標(biāo)之間的相關(guān)性?；貧w模型決定系數(shù)用r2值表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ARN患者VZV DNA載量的變化

11例ARN患者治療前房水VZV DNA載量為（6.97±0.57）lg（拷貝/mL），病毒載量范圍為5.94～7.83 lg（拷貝/mL）。隨著抗病毒治療時間的延長，患者房水VZV DNA載量整體呈下降趨勢（P＜0.000 1），治療第4天病毒載量即顯著下降（P=0.003）；第3、4周降幅變緩， 2個時間點之間VZV DNA載量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.208）。見表1、圖1。

2.2 ARN患者VZV IgG抗體水平的變化

11例ARN患者治療前房水VZV IgG抗體水平（S/CO值）為4.84±1.72，范圍為1.83～6.92，與治療前VZV DNA載量呈正相關(guān)（r=0.45，P＜0.05）。接受抗病毒治療后，ARN患者房水VZV IgG抗體水平呈下降趨勢（P=0.001）。治療8周時房水VZV IgG抗體水平顯著低于治療前（P＜0.05），但仍呈陽性，S/CO值范圍為0.40～6.28。見表2。

表1 抗病毒治療前后各時間點房水VZV DNA水平的變化

圖1 11例ARN患者房水VZV DNA載量的動態(tài)變化

表2 ARN患者抗病毒治療前后各時間點房水VZV IgG抗體水平（S/CO值）的變化

2.3 ARN患者VZV DNA載量和IgG抗體變化動力學(xué)分析

VZV DNA載量變化呈雙相指數(shù)下降，第一相（VZV DNA載量變化＜0.5個對數(shù)值）持續(xù)時間為4～17 d，平均為（10.1±3.8）d。第一相持續(xù)時間與治療前VZV DNA載量無相關(guān)性（r=0.09，P＞0.05）。對第二相進行動力學(xué)分析，結(jié)果顯示，有7例擬合度較高（r2＞0.8），VZV DNA載量隨時間呈對數(shù)模型衰減，平均斜率為-0.106±0.038（95%CI為-0.173～ -0.059），斜率與治療前VZV DNA載量無相關(guān)性（r=0.22，P＞0.05）?；颊遃ZV DNA載量降低50%的時間為（3.2±1.1）d（95%CI為1.7～ 5.1 d）。治療8周后，11例ARN患者中，有10例（90.91%）房水VZV DNA低于檢測下限。房水VZV IgG抗體水平在治療1、2、3、4周無明顯變化；治療8周后，11例ARN患者VZV IgG抗體仍均呈陽性。見圖1、圖2。

圖2 11例ARN患者房水VZV IgG抗體水平動態(tài)變化

3 討論

已有研究證實，通過檢測眼內(nèi)液病毒核酸和抗體來診斷ARN具有重要的臨床應(yīng)用價值[3-4]， 但尚缺乏對眼內(nèi)液病毒核酸和抗體在抗病毒治療中的動態(tài)監(jiān)測及療效評估的研究。為此，本研究通過對接受抗病毒治療的ARN患者房水VZV DNA載量及IgG抗體水平進行動態(tài)監(jiān)測，分析VZV對抗病毒治療的動態(tài)反應(yīng)，同時評估療效。

目前，臨床一般采用全身靜脈注射抗病毒藥物聯(lián)合玻璃體腔注射更昔洛韋的方法來治療ARN，療效良好[5]。本研究結(jié)果顯示，ARN患者接受抗病毒治療1周左右房水VZV DNA載量即大幅下降，治療8周時，有10例患者VZV DNA載量低于檢測下限，且視網(wǎng)膜壞死灶均消退，證實8周強化療法可有效降低ARN患者眼中的VZV載量。有研究結(jié)果顯示，實時熒光定量PCR可有效檢測ARN患者VZV活躍性，并監(jiān)測抗病毒治療的效果[6-7]。在ARN的治療過程中，玻璃體腔注射前，為降低眼內(nèi)壓，一般會通過前房穿刺術(shù)抽取房水，抽取出來的房水可進行實時熒光定量PCR檢測，不會對患者造成額外損傷，臨床上具有可操作性。本研究結(jié)果顯示，ARN患者接受抗病毒治療后，VZV DNA載量變化呈雙相指數(shù)[8]下降，這一現(xiàn)象在接受抗病毒治療的乙型肝炎患者中也有呈現(xiàn)[9]。本研究ARN患者第一相的持續(xù)時間為（10.1±3.8）d，明顯短于BERNHEIM等[8]報道的27.8 d和HAFIDI等[10]報道的15.5 d，原因可能與治療方案和病毒對藥物的敏感性有關(guān)；ARN患者VZV DNA載量下降50%的時間為（3.2±1.1）d，與BERNHEIM等[8]報道的（3.0±0.7）d和HAFIDI等[10]報道的4.2 d無明顯差異。本研究中，有1例患者在治療第4周時出現(xiàn)VZV DNA載量的反彈，治療第8周時，仍能檢出VZV DNA，臨床檢查發(fā)現(xiàn)其視網(wǎng)膜壞死灶未完全消退，提示VZV DNA載量檢測結(jié)果與患者臨床表現(xiàn)相符。

VZV感染后，機體可在眼內(nèi)產(chǎn)生局部免疫，產(chǎn)生以IgG為主的特異性抗病毒抗體。有研究結(jié)果顯示，眼內(nèi)HSV、VZV感染后1周即可產(chǎn)生特異性IgG抗體；感染3個月時，房水仍有較高的抗體陽性率[11]。本研究結(jié)果顯示，11例ARN患者初次就診時即可檢測到VZV IgG抗體，S/CO值范圍為1.83～6.92，與VZV DNA載量呈正相關(guān)（r=0.45，P＜0.05）?？贵w滴度的高低由病毒和宿主兩方面決定，病毒毒株的不同、病毒感染量的差異、宿主免疫力的差異、就診時感染階段的不同，均會導(dǎo)致患者的抗體產(chǎn)生情況出現(xiàn)差異。本研究結(jié)果顯示，11名ARN患者接受抗病毒治療后8周，VZV IgG抗體水平顯著下降，但滯后于VZV DNA載量的變化，當(dāng)VZV DNA載量低于檢測下限時，VZV IgG抗體仍為陽性，S/CO值范圍為0.40～6.28。由于目前尚無關(guān)于抗病毒治療后房水VZV IgG抗體半衰期的研究，因此抗體的持續(xù)陽性是否對患眼有持續(xù)性的保護作用，防止ARN復(fù)發(fā)，還有待進一步研究。

本研究尚有一定的局限性：為不增加患者負擔(dān)，獲得最大臨床獲益率，本研究納入的多數(shù)ARN患者因炎癥導(dǎo)致臨床無法準(zhǔn)確評估疾病階段；缺乏包括視網(wǎng)膜壞死灶面積等影像學(xué)檢查結(jié)果，因此未能完成病毒拷貝數(shù)與影像學(xué)指標(biāo)的動態(tài)相關(guān)性分析。后續(xù)將收集更多病例，完善相關(guān)檢查，以全面評估VZV DNA載量和VZV IgG抗體檢測的臨床價值。

綜上所述，采用實時熒光定量PCR檢測VZV DNA載量可用于監(jiān)測ARN病情的進展，亦可反映病毒對藥物的反應(yīng)，有利于及時發(fā)現(xiàn)病毒耐藥，優(yōu)化治療方案，對ARN治療具有重要的指導(dǎo)價值。