趙 萍，金文剛,3, ，蘭阿峰，劉俊霞，裴金金，陳德經(jīng),3

（1.陜西理工大學生物科學與工程學院，秦巴生物資源與生態(tài)環(huán)境省部共建培育國家重點實驗室，陜西 漢中 723001；2.陜西理工大學 陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723001；3.陜西理工大學 陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 漢中 723001）

大鯢（）是我國人工養(yǎng)殖成熟的重點水產(chǎn)動物品種之一，已在多個省、市實現(xiàn)了規(guī)模化人工養(yǎng)殖，其食用和藥用價值極高，含有豐富的氨基酸、人體必需脂肪酸、礦物質(zhì)、微量元素及維生素。隨著大鯢養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，商品鯢價格不斷下跌，給養(yǎng)殖企業(yè)、養(yǎng)殖戶造成了較大經(jīng)濟損失，大鯢精深加工與開發(fā)利用已成為制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。迄今，研究人員已在大鯢營養(yǎng)評價、分割加工與貯藏保鮮、生物活性成分、熱加工方便食品等方面進行了較多嘗試，促進了一些高附加值產(chǎn)品的上市以及產(chǎn)業(yè)鏈的延伸。目前，大鯢低溫肉制品（冷鮮和速凍肉）已成為最重要的初加工產(chǎn)品形態(tài)，但冷鮮肉存在易腐敗變質(zhì)、貨架期短的缺陷。肉類腐敗變質(zhì)主要是由微生物的生長繁殖導致，而引起腐敗變質(zhì)的菌群主要為少數(shù)優(yōu)勢特定腐敗菌。查明并抑制引起大鯢肉腐敗變質(zhì)的優(yōu)勢菌群，是冷藏過程中實現(xiàn)品質(zhì)控制和延長貨架期的根本。

Illumina MiSeq高通量測序技術是研究微生物多樣性的一種分子生物學手段，該技術以細菌基因序列信息為基礎，通過細菌的基因序列研究水產(chǎn)品貯藏過程中微生物（尤其是優(yōu)勢腐敗菌）的組成及變化。傳統(tǒng)的微生物群落多樣性研究，主要是通過生理生化實驗及表型進行鑒定，耗費時間且不能對其進行精確鑒定，難以獲得微生物群落多樣性變化的真實情況。與傳統(tǒng)研究方法相比，Illumina MiSeq高通量測序技術具有無需分離純化、測定速度快、結(jié)果精準、利用微量樣品就能實現(xiàn)所有微生物檢測、安全性和自動化程度高、分析全面等優(yōu)點。其中16S rDNA被認為是最適于細菌系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定的指標，通常作為揭示生物物種的特征核苷酸序列，16S rDNA擴增子測序是對高變區(qū)進行測序分析和菌種鑒定，既可以提高效率還可以節(jié)約成本。目前，高通量測序技術已成功應用于深水玫瑰蝦、鯛魚、貽貝、鯧魚等水產(chǎn)品低溫貯藏過程中微生物多樣性分析。

隨著大鯢分割加工的產(chǎn)業(yè)化推進，有關大鯢分割肉氣調(diào)包裝、冰藏和微凍貯藏理化品質(zhì)指標的研究已有報道。冷鮮肉被譽為21世紀鮮肉消費的主流，課題組前期對大鯢肉冷藏過程中主要理化指標和揮發(fā)性成分進行了初步探討，然而大鯢肉冷藏過程中微生物菌群組成和特定腐敗菌的研究，還鮮見報道。為此，本研究采用高通量測序技術探究大鯢肉冷藏期間微生物菌群演替規(guī)律，旨在為后期靶向抑菌及冷藏保鮮奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活健康子二代大鯢3 尾（（2.51±0.36）kg），購自陜西漢中龍頭山水產(chǎn)養(yǎng)殖開發(fā)有限公司大鯢生態(tài)養(yǎng)殖基地。

三氯乙酸 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲基紅、亞甲基藍 北京鼎國生物技術有限責任公司；氧化鎂天津市百世化工有限公司；硼酸 天津市福晨化學試劑廠；鹽酸 杭州匯普化工儀器有限公司；瓊脂 北京奧博星生物技術有限責任公司；Qubit dsDNA Assay Kit試劑盒美國Life Technologies公司；Magpure Soil DNA LQ Kit試劑盒 廣州Magen公司；Tks Gflex DNA ploymerase試劑盒 寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司。

1.2 儀器與設備

AD18型分散均質(zhì)機 上海昂尼儀器儀表有限公司；SW-CJ-IFD型潔凈工作臺 上海博迅實業(yè)公司；LQ-C1003型電子天平 深圳市飛亞衡器有限公司；FA3204B型電子天平 上海精科天美科學儀器有限公司；COHS-250型生化培養(yǎng)箱 常州金壇良友儀器有限公司；Centrifuge 5418型臺式高速離心機 德國Eppendorf公司；580BR10905型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；SN 002358型QIAxtractor高通量核酸提取儀 德國QIAGEN公司；2100型生物分析儀 美國Aglient公司；2000型NanoDrop微量分光光度計 美國Thermo Fisher公司；2500型凝膠成像儀 北京Tanon公司。

1.3 方法

1.3.1 大鯢肉樣品的制備

鮮活大鯢經(jīng)放血、熱燙、刮黏液、去內(nèi)臟和清洗后，用聚乙烯袋20 min內(nèi)運回實驗室，去頭、皮、四肢、尾，并切成約5.0 cm×2.0 cm×0.5 cm的肉塊，放入黑色托盤中并用保鮮膜密封4 ℃冷藏，于宰后第0、2、4、6、8天取樣，每個時間點取6 個平行，分別記為T0（T0-1、T0-2、T0-3、T0-4、T0-5、T0-6），T2、T4、T6、T8的標記與T0相似，定時將樣品取出，置于超凈工作臺上，去除保鮮膜，用事先滅菌好的剪刀將肉樣剪碎，混勻，用鑷子裝在15 mL離心管中，置于-80 ℃冰箱中貯藏，用于細菌菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）測定和高通量測序。

1.3.2 細菌菌落總數(shù)和TVB-N測定

按照GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》和GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》方法，對不同冷藏時間大鯢肉中菌落總數(shù)和TVB-N含量進行測定。

1.3.3 高通量測序

將制取的不同冷藏時間大鯢肉樣本用干冰保存運送至上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司，基于Illumina MiSeq平臺進行高通量測序。

1.3.3.1 基因組DNA提取

按照Magpure Soil DNA LQ Kit試劑盒說明書提取樣本的基因組DNA，在2 mL的離心管中，加入約500 mg的玻璃珠，再加入0.25～0.5 g大鯢肉樣品和0.6～0.8 mL Buffer SOL，在渦旋儀上以最高速度渦旋5～10 min，再加入60 μL Buffer SDS至樣品中，渦旋混勻30 s，詳細提取方法按照試劑盒說明書進行。之后利用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000微量分光光度計檢測DNA濃度。

1.3.3.2 PCR擴增與建庫

以基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物，TaKaRa公司的Tks Gflex DNA polymerase進行1輪PCR，確保擴增效率和準確性。第1輪PCR產(chǎn)物使用電泳檢測，檢測后使用磁珠純化，純化后作為2輪PCR模板，并進行2輪PCR擴增，并再次使用電泳檢測，檢測后使用磁珠純化，純化后對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測和Qubit定量。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等量混樣，并利用Illumina Novaseq 6000測序系統(tǒng)上機測序。細菌多樣性鑒定對應區(qū)域16S V3-V4區(qū)。引物序列：343F 5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′；798R 5′-AGGGTATCTAATCCT-3′。

1輪PCR體系：15 μL 2×Gflex PCR Buffer、1 μL 5 pmol/μL Primer F、1 μL 5 pmol/μL Primer R、≥1 μL（50 ng）Template DNA、0.6 μL TKS Gflex DNA Polymerase（1.25 U/μL），加水補足至30 μL。PCR程序：94 ℃預變性5 min，循環(huán)1 次；94 ℃變性30 s；56 ℃退火30 s，循環(huán)26 次；72 ℃延伸20 s；72 ℃延伸5 min，循環(huán)1 次；4 ℃保藏。

2輪PCR體系：15 μL 2×Gflex PCR Buffer、0.6 μL TKS Gflex DNA Polymerase（1.25 U/μL）、1 μL Adapter I5、1 μL Adapter I7、50 ng第1輪產(chǎn)物，加水補足至30 μL。PCR程序：94 ℃預變性5 min，循環(huán)1 次；94 ℃變性30 s；56 ℃退火30 s，循環(huán)7 次；72 ℃延伸20 s；72 ℃延伸5 min，循環(huán)1 次；4 ℃保藏。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

測序完成后，使用Trimmomatic軟件對原始雙端系列進行去雜，去雜后的雙端系列利用FLASH軟件進行拼接。為保證結(jié)果的準確性，可進行精準去雜，去除含有模糊堿基、單堿基高重復區(qū)的序列與及長度過短的序列，同時，利用UCHIME軟件檢測并去除序列中的嵌合體。處理后形成的有效序列，采用Vsearch軟件，根據(jù)序列的相似性，將相似度≥97%的序列歸為多個操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。使用QIIME軟件包挑選出各個OTU的代表序列，并將所有代表序列與數(shù)據(jù)庫進行對比注釋。16S使用Silva（version132）數(shù)據(jù)庫對比，物種對比注釋使用RDP classifier軟件，保留置信區(qū)間＞0.7的注釋結(jié)果，物種比對注釋使用BLAST軟件?；诜诸愋畔W，探討大鯢肉在冷藏期間微生物群落結(jié)構變化。使用Excel對原始數(shù)據(jù)進行處理、匯總，采用SPSS 25進行顯著性分析，其中多重比較采用Duncan法，＜0.05，差異顯著，利用Origin 2021進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鯢肉冷藏過程中菌落總數(shù)和TVB-N值的變化

通常水產(chǎn)魚類菌落總數(shù)≥6（lg（CFU/g））時達到腐敗，由圖1A可知，隨著冷藏時間的延長，菌落總數(shù)總體呈上升的趨勢，在0～4 d增加緩慢，4～8 d增加較快，在第6天超過水產(chǎn)品可接受的上限，第8天達到最大值8.41（lg（CFU/g）），已經(jīng)超出了可食用水產(chǎn)品的微生物閾值。在冷藏初期，菌落總數(shù)增長速率較慢，主要是低溫、pH值的降低與及初始腐敗菌落數(shù)較低。隨著冷藏時間的延長，菌落總數(shù)增長速率加快，主要是由于蛋白質(zhì)的自溶及代謝物的積累有利于腐敗菌的生長繁殖。TVB-N是由具有揮發(fā)性的氨、伯胺、仲胺及叔胺等低級堿性含氮化合物組成，主要是由于食品在酶和微生物的作用下，使蛋白質(zhì)及非蛋白的含氮化合物降解產(chǎn)生氨及胺類等揮發(fā)性堿性含氮化合物。根據(jù)G B/T 18108—2008 規(guī)定，魚肉中TVB-N 值達到30 mg/100 g，是消費者可接受的上限，由圖1B可知，大鯢肉在冷藏期間TVB-N值呈增加的趨勢，在前4 d增加緩慢，TVB-N值由6.61 mg/100 g增加到12 mg/100 g，之后快速增加并在第6天接近可接受上限，在第8天超出可接受上限達到最大值47.8 mg/100 g。大鯢肉在發(fā)生自溶生化變化前期，蛋白質(zhì)降解速度較慢，引起蛋白質(zhì)降解的主要因素為內(nèi)源酶，在自溶階段，蛋白質(zhì)的分解為微生物的生長繁殖提供了營養(yǎng)物質(zhì)，使得微生物迅速增長，然后微生物產(chǎn)生各種蛋白酶作用于蛋白質(zhì)，又使得蛋白質(zhì)分解，所以在自溶階段后TVB-N值迅速增加。

圖1 大鯢肉冷藏過程中菌落總數(shù)（A）和TVB-N值（B）的變化Fig.1 Changes in total bacterial count (A) and TVB-N content (B) of giant salamander meat during cold storage

2.2 PCR擴增結(jié)果

如圖2所示，所有樣品的PCR擴增產(chǎn)物條帶介于750～500 bp之間，特異性和亮度較好，無副帶和拖帶，說明各樣品純度較高，PCR擴增條件合適，可用于后續(xù)的高通量測序分析。

圖2 PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoretograms of PCR-amplified products

2.3 測序樣本數(shù)據(jù)分析

高通量測序獲得不同冷藏期大鯢肉30 個樣品原始DNA序列，經(jīng)質(zhì)控和優(yōu)化后得到有效序列，相關信息見表1?？芍煌洳仄跇悠返挠行蛄袛?shù)均在40 000以上，有效序列百分比達73%以上，平均長度范圍為412.55～425.01 bp，表明樣本的有效序列滿足后續(xù)微生物多樣性分析要求。

表1 樣品測序信息Table 1 Results of sample sequencing

將有效序列按照97%的相似度進行OTU分類，并選取每個OTU中豐度最大的序列為該OTU的代表序列，繪制Venn圖，如圖3所示。0、2、4、6、8 d樣品中共有的OTU數(shù)分別為3 016、3 040、1 979、1 456、1 576，獨有的OTU數(shù)分別為715、721、119、24、37；而0 d-2 d、2 d-4 d、4 d-6 d、6 d-8 d中共有的OTU數(shù)分別為1 985、1 629、1 165、1 056。隨著冷藏時間的延長樣本中總OTU數(shù)呈降低的趨勢，且后三個時間段顯著降低，說明冷藏前期大鯢肉的微生物多樣性可能比冷藏后期更豐富，一些微生物只能在富氧的環(huán)境中生存。同時樣本中獨有的OTU與總OTU變化趨勢相似，但前后時間段之間共有OTU變化幅度較小，說明大鯢肉在冷藏過程中其菌群結(jié)構變化很大，但主要菌群變化較小。根據(jù)OTU的特點能將5 個時間段劃分為3 個區(qū)間，即冷藏前期（0、2 d）、冷藏中期（4 d）、冷藏后期（6、8 d），各區(qū)之間變化顯著。

圖3 樣品中微生物群落共享和獨有的OTU Venn分析Fig.3 Venn analysis of shared and unique OTUs of microbial communities between samples

2.4 α多樣性分析

多樣性是根據(jù)97%相似度水平下的OTU信息，通過Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)等對樣品微生物物種豐富度和多樣性進行評估。Chao1指數(shù)反映樣品的菌群豐度，估計群落中含OTU的數(shù)目；Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映樣品中微生物群落的多樣性，Shannon指數(shù)越大，說明群落多樣性越高，Simpson指數(shù)則與之相反，值越大，說明群落多樣性越低。本研究得到的大鯢肉不同冷藏時間樣品多樣性相關指數(shù)如表2所示。不同冷藏時間樣本中微生物的覆蓋率均大于99%，表明測序結(jié)果可以反映實際情況。在0 d時Chao1指數(shù)最大，表明此時菌群豐度最高，隨著冷藏時間的延長，Chao1指數(shù)逐漸降低，說明微生物的豐富度逐漸降低，且冷藏中、后期較前期降低顯著（＜0.05）。隨著冷藏時間的延長，Shannon指數(shù)逐漸降低，Simpson指數(shù)則與之相反，表明大鯢肉的微生物菌群多樣性逐漸降低。冷藏前期氧含量充足、微生物生長繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)較少、同時各種微生物存在生存適應階段，因此，在冷藏前期微生物豐度和多樣性較高；隨著冷藏時間的延長，環(huán)境中氧含量降低、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)在內(nèi)源酶和外源酶的作用下降解，為微生物的生長繁殖提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)、優(yōu)勢物種大量繁殖并產(chǎn)生代謝物和毒素等，引起部分物種死亡導致冷藏后期微生物多樣性和豐富度降低，與Huang Wenbo等的研究結(jié)果相似。

表2 樣品微生物多樣性指數(shù)Table 2 Microbial diversity indexes of samples

圖4A為樣本物種累積曲線，用于描述隨著抽樣量的增大物種增加狀況，在生物多樣性和群落調(diào)查中，被廣泛用于抽樣量充分性的判斷以及物種豐富度估計，隨著抽樣量的增加，曲線趨于平緩，表明此環(huán)境中的物種并不會隨著樣本量的增加而顯著增多，抽樣充分。圖4B為樣本Rank Abundance曲線，用于同時解釋樣品多樣性的兩個方面，即樣品所含物種的豐富度（指一個群落或生境中物種數(shù)目的多寡）和均勻程度（指一個群落或生境中全部物種個體數(shù)目的分布均勻程度），物種豐富程度由曲線在橫坐標上的長度反映，曲線越寬（橫軸的跨度越大），表示物種的組成越豐富；物種組成的均勻程度由曲線的形狀反應，曲線越平坦（縱軸的跨度越大），表示物種組成的均勻程度越高。由圖4B可知，隨著OTU數(shù)量的增多，曲線逐漸平坦，表示樣本中物種組成均勻度逐漸提高，即冷藏前期較冷藏中、后期物種豐富度和多樣性高。

圖4 樣本物種累積曲線（A）和Rank Abundance曲線（B）Fig.4 Species accumulation curves (A) and Rank Abundance curves (B)

2.5 群落多樣性分析

2.5.1 樣品在門水平上的多樣性

如圖5所示，在門分類水平上，0、2 d中主要菌門為擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes），相對豐度均在3 7%～4 2%之間；其次為變形菌門（Proteobacteria），相對豐度分別為14.2%、11.2%；Fibrobacteres、Actinobacteria、Spirochaetes相對豐度在3%～1%之間，其他菌門相對豐度均小于1%。4、6、8 d較0、2 d變化顯著，絕對優(yōu)勢菌門為變形菌門，相對豐度在84.7%以上，顯著高于冷藏前期，而擬桿菌門、厚壁菌門，相對豐度在7%～2%之間，顯著低于冷藏前期，其他菌門均小于1%。變形菌門中包含水產(chǎn)品常見的腐敗菌，如希瓦氏菌屬、假單胞菌屬。總而言之，在整個冷藏過程中，擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門為優(yōu)勢菌門，說明這3 種微生物對大鯢肉的品質(zhì)起著重要作用，從門水平上講，細菌的種類大致相同，而豐度差別比較大。

圖5 樣本中微生物在門水平相對豐度分布Fig.5 Relative abundance and distribution of microorganisms in samples at the phylum level

2.5.2 樣品中細菌在屬水平上的多樣性

為細化研究不同樣品中微生物多樣性的差異，進一步在屬水平上分析大鯢肉冷藏過程中細菌群落多樣性。如圖6所示，0、2 d中主要菌屬為擬桿菌屬（），相對豐度分別為17.6%、19.1%，隨著時間的延長，相對豐度明顯下降，在4、6、8 d相對豐度分別下降至2.8%、0.7%、1.3%；其次為，相對豐度分別為8.5%、9.1%，在冷藏中后期豐度均低于1.5%，顯著下降；其余菌屬相對豐度均小于1%。而在4、6、8 d中假單胞菌屬（）為絕對優(yōu)勢菌屬，相對豐度分別為43.5%、56.4%、47.8%，較冷藏前期大幅增加，說明冷藏后期的條件更有利于其生長；其次為氣單胞菌屬（）、相對豐度在10%左右，沙雷氏菌屬（）相對豐度在5%左右，在4、6、8 d相對豐度分別為6.4%、1.3%、1.6%，這些菌屬較冷藏前期明顯增加；其余均屬相對豐度均小于1%。在屬水平上，不同冷藏期所含細菌的種類多樣性和豐富度存在較大的差異。此外，大鯢肉在冷藏初期，菌群種類極為豐富，隨著冷藏時間的延長，物種的種類逐漸減少。

圖6 樣本中微生物在屬水平相對豐度分布Fig.6 Relative abundance and distribution of microorganisms in samples at the genus level

2.6 樣本差異分析

基于由物種組成（某些距離矩陣算法也會考慮到物種進化關系）計算得到的距離矩陣進行主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA）。如圖7A所示，PC1為54.19%，PC2為26.73%，PC1和PC2疊加解釋度達80.92%。在所有樣品中0、2、8 d組內(nèi)樣本之間距離較小，表明組內(nèi)微生物群落結(jié)構差異較小，且0、2 d組內(nèi)微生物群落結(jié)構相似度較8 d高；而4 d和6 d組內(nèi)樣品之間距離較大，表明組內(nèi)微生物結(jié)構差異較大，主要是由于菌群在大鯢肉表面分布不均導致。整體看，0、2 d樣品之間相互重疊且集中分布在第2象限，8 d樣品集中分布在第4象限，4、6 d樣品分散在第1、4象限且6 d在第4象限的樣品更多，綜上表明，0-2、4、6、8 d之間微生物結(jié)構差異較大。

圖7 樣本中微生物群落PCoA（A）和LEfSe分析差異物種注釋分支圖（B）Fig.7 PCoA analysis (A) and LEfSe analysis of differential species annotated clade (B) of microbial communities in samples

LEfSe分析可以分析組間菌群差異，找出組間差異的微生物種類。如圖7B所示，不同顏色表示不同分組，紅色節(jié)點表示在紅色組別中豐度相對較高的差異顯著物種，綠色節(jié)點表示在綠色組別中豐度相對較高的差異顯著物種，黃色節(jié)點表示在兩組比較中并無顯著差異的物種，節(jié)點直徑大小與相對豐度大小呈正比，每層節(jié)點由內(nèi)向外分別表示門、綱、目、科、屬。在微生物門水平上，5 組中差異顯著的種類包括5 個，分別是變形菌門、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門、纖維桿菌門（Fibrobacteres）、厚壁菌門。在微生物屬水平上，5 組樣本中顯著差異的菌屬共鑒定出16 個，冷藏前期假黃單胞菌屬（）、Rikenellaceae_RC9_gut_group、uncultured_bacterium、9、擬桿菌屬、纖維桿菌屬（）、毛螺菌屬（）、、顯著上調(diào)。冷藏中期沙雷氏菌屬（）、不動桿菌屬（）顯著上調(diào)。冷藏后期氣單胞菌屬、假單胞菌屬、ambiguous_taxa、、1顯著上調(diào)。

2.7 累加統(tǒng)計分析

如圖8所示，A、D兩組變化趨勢相同，均是冷藏前期豐度較高，中、后期明顯下降，A組在5 個冷藏節(jié)點的值分別為46.32%、46.17%、7.22%、2.36%、2.99%，D組為51.60%、51.17%、12.72%、7.57%、10.54%。其中，擬桿菌屬、9、毛螺菌屬為專性厭氧菌，Rikenellaceae_RC9_gut_group為瘤胃微生物主要生活在厭氧環(huán)境中，該類菌屬，在冷藏初期，貯藏環(huán)境中氧含量較高，不利于生長繁殖，在冷藏中后期貯藏環(huán)境中氧含量較低，能進行生長繁殖，但不具有生長優(yōu)勢，生長繁殖受到抑制，導致相對豐度明顯下降。B組在整個冷藏期間波動相對較小，但在冷藏中期豐度較高，在5 個冷藏節(jié)點的值分別為0.46%、0.66%、13.49%、5.42%、6.46%。其中沙雷氏菌屬為革蘭氏陰性桿狀兼性厭氧菌，菌株能產(chǎn)生粉色、紅色或深紅色色素，對大鯢肉顏色有顯著影響，不動桿菌屬為革蘭氏陰性好氧菌，屬于條件致病菌，是機體抵抗力降低時易感染的革蘭氏陰性菌，在冷藏中期相對豐度顯著增加，表明大鯢肌肉組織自身抗菌活性顯著下降，在冷藏后期快速下降，主要是由于假單胞菌屬的快速增殖競爭營養(yǎng)成分和產(chǎn)生大量代謝物和毒素，冷藏環(huán)境中氧含量降低，對其繼續(xù)增殖具有抑制作用。

圖8 不同菌群累加占比分析Fig.8 Change in relative abundance of different bacterial groups during storage

C組在冷藏中、后期菌群豐度大幅增加，可以判定為主要致腐菌屬，在5 個冷藏節(jié)點的值分別為1.62%、2.00%、66.57%、84.65%、80.02%。其中假單胞菌屬為革蘭氏陰性需氧桿狀細菌，分解蛋白質(zhì)的能力極強，容易導致肉類變黏，代謝產(chǎn)物硫化氫、過氧化氫會使肉類變色，生長的最適pH值為7.0～8.5，能利用H和CO作為能源且能在冰箱中生長繁殖，不能在pH值6或6以下生長，是低溫貯藏肉制品中常見的腐敗菌，其致腐性受群體感應系統(tǒng)的調(diào)控。結(jié)合圖6可知，該菌在冷藏中后期相對豐度顯著增加至50%左右，為主要致腐菌屬。在大鯢肉發(fā)生自溶生化變化前期，蛋白質(zhì)等大分子降解較少，pH值較低，微生物種類較多，該菌的生長繁殖速度相對較慢；在自溶階段及之后，蛋白質(zhì)等大分子在酶的作用下分解為小分子，貯藏環(huán)境中氧含量降低，部分菌種因不適應環(huán)境而死亡，pH值逐漸升高，有利于該菌的生長繁殖，導致冷藏中后期大幅增加；但在第8天相對豐度較第6天略微下降，主要是由于微生物大量生長繁殖，導致代謝物和毒素積累，對自身生長具有抑制作用。氣單胞菌屬能代謝產(chǎn)生氧化三甲胺和硫化氫，與假單胞菌屬類似，是大鯢肉在冷藏過程中變色、發(fā)黏并產(chǎn)生不良氣味的原因之一，、ambiguous_taxa、1在冷藏中后期相對豐度增加，其中相對豐度值在中后期達到10%左右，但其致腐性有待研究。

2.8 進化分析

系統(tǒng)發(fā)育學也稱系統(tǒng)發(fā)生學，通過某一分類水平上序列間堿基的差異構建進化樹能夠揭示出有關生物進化過程的順序，了解生物進化歷史和機制，是研究物種形成和進化關系的有力工具。使用FastTree軟件繪制組合圖，選擇豐度在前50的OTU，根據(jù)最大似然法構建進化樹，并以熱圖展示OTU在不同樣本的豐度。由圖9可知，進化樹可以分為5 個大的分支，第1個分支為變形菌門中的部分屬，主要為假單胞菌屬，絕大部分菌屬在冷藏中、后期豐度較高，是影響大鯢肉品質(zhì)的關鍵菌群。第2個分支主要包括了厚壁菌門中的部分菌屬，第3個分支主要包括梭桿菌門中的梭菌屬，第4個分支主要包括了纖維桿菌門中的纖維桿菌屬，第5個分支包括擬桿菌門中的部分屬，主要為擬桿菌屬。后4個分支除1，其余菌屬均在冷藏前期豐度較高。通過進化分析可知，菌落演替與冷藏時間具有良好的相關性。

圖9 TOP 50物種進化樹及OTU豐度組合圖Fig.9 Phylogenetic tree and OTU abundance combinations of TOP 50 species

2.9 基于16S的KEGG功能預測

京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）是有關生物系統(tǒng)比較完善的數(shù)據(jù)庫，關聯(lián)基因組信息和功能信息的知識庫。其由基因蛋白序列（KEGG Genes）、具有內(nèi)源性和外源性的化學物質(zhì)（KEGG Ligand）、分子相互作用和代謝通路圖（KEGG Pathway）、各種生物之間的層次關系（KEGG Brite）構成。KEGG在L2水平共41 種代謝通路，其中相對豐度值占比居前15的代謝通路如表3所示?？梢钥闯觯み\輸、特征差、細胞過程和信號傳導、脂代謝、新陳代謝在冷藏中后期表現(xiàn)為增加的趨勢。其中膜運輸?shù)南鄬ωS度最大，達到13%左右，膜運輸包括ABC轉(zhuǎn)運器、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、細菌分泌系統(tǒng)3 條代謝通路，其中，磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)是細菌吸收碳水化合物的主要機制；ABC轉(zhuǎn)運器廣泛存在于細菌、古細菌和真核生物中，主要是將ATP水解與多種底物主動轉(zhuǎn)運結(jié)合起來；細菌分泌系統(tǒng)在革蘭氏陰性細菌中具有高度的保守性。由3 條代謝通路的特性可以看出，膜運輸在冷藏中后期豐度的升高，與革蘭氏陰性菌的增加密切相關。

表3 KEGG功能預測Table 3 KEGG function prediction

碳水化合物代謝、復制和修復、能量代謝、翻譯、輔助因子和維生素代謝、核苷酸代謝、轉(zhuǎn)錄、遺傳信息處理、折疊、分類和降解隨著冷藏時間的延長均表現(xiàn)為降低的趨勢。其中碳水化合物代謝、能量代謝、輔助因子和維生素代謝等能為細菌的生長繁殖提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)；復制與修復、轉(zhuǎn)錄、遺傳信息處理、折疊等是微生物自身合成遺傳物質(zhì)的主要代謝通路；該類代謝通路相對豐度的變化趨勢與圖8中主要致腐菌的變化趨勢相反，表明致腐菌的大量增殖和微生物群落結(jié)構的變化對代謝通路環(huán)境有明顯的影響，弓湃等研究指出假單胞菌屬中CbrAB-CrcZ-Crc參與碳代謝抑制調(diào)控，能為假單胞菌適應環(huán)境變化和提高在自然界中的競爭力做出代謝優(yōu)化調(diào)控，賦予假單胞菌相比同一環(huán)境中其他微生物而言更多的競爭優(yōu)勢，更有利于假單胞菌在環(huán)境中生存。

氨基酸代謝通路在整個冷藏過程中波動較小，氨基酸代謝在微生物演替中的作用主要包括兩個方面，一方面是氨基酸的合成代謝，用于合成自身獨特的蛋白質(zhì)、多肽和其他含氮物質(zhì)，以產(chǎn)生相應的氮源為微生物利用；另一方面是氨基酸的分解代謝，通過脫氨基、轉(zhuǎn)氨基、聯(lián)合脫氨基的方式分解為-酮酸、胺類和二氧化碳。其中-酮酸可合成非必需氨基酸、轉(zhuǎn)變?yōu)樘羌磅ヮ?、氧化產(chǎn)生能量；二氧化碳大部分直接排到細胞外。同時能量代謝中糖酵解和三羧酸循環(huán)產(chǎn)生二氧化碳都會導致環(huán)境中二氧化碳濃度的升高，有利于兼性厭氧菌屬的生長繁殖，是冷藏中后期乳球菌屬（）、沙雷氏菌屬、拉恩氏菌屬（）、檸檬酸桿菌屬、希瓦氏菌屬等豐度明顯增高的主要原因。

3 結(jié)論

通過Illumina MiSeq測序技術對托盤包裝大鯢肉冷藏過程中的5 個時期30 個樣品進行分析，初步明確了大鯢肉冷藏期間菌相組成及變化規(guī)律，主要結(jié)論如下：1）大鯢肉在冷藏過程中微生物豐度隨著冷藏時間的延長逐漸降低；門水平分析發(fā)現(xiàn)，細菌優(yōu)勢菌門從冷藏前期（0、2 d）的擬桿菌門、厚壁菌門逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橹校? d）、后期（6、8 d）的變形菌門；屬水平分析表明，細菌優(yōu)勢菌屬從冷藏前期的擬桿菌屬、逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橹?、后期的假單胞菌屬、氣單胞菌屬、、沙雷氏菌屬?）PCoA顯示0-2、4、6、8 d之間微生物結(jié)構差異較大，兩個PC疊加解釋度達80.92%；LEfSe分析表明，引起大鯢肉各冷藏期差異顯著的菌門主要為變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、纖維桿菌門、厚壁菌門，菌屬主要為假黃單胞菌屬、、沙雷氏菌屬、不動桿菌屬、氣單胞菌屬、假單胞菌屬、ambiguous_taxa、、Rikenellaceae_RC9_gut_group、_9、擬桿菌屬、纖維桿菌屬、毛螺菌屬、、_1。3）進化分析表明大鯢肉冷藏過程中微生物菌群的演替與冷藏時間具有較強相關性。綜合分析，引起冷藏過程中托盤包裝大鯢肉腐敗變質(zhì)的微生物可能為假單胞菌屬、氣單胞菌屬、和沙雷氏菌屬。該研究為今后大鯢肉冷藏過程中靶向抑菌保鮮及貨架期延長提供參考。