張文棟，張 蘇，宓曉雨，程 宇，張 晨，王思亓，王龍鳳，江 蕓

（南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210023）

大腸桿菌O157:H7作為危害性、致病性和致死性較高的食源性致病菌，其對于食品安全和人群健康具有重大意義，大量文獻(xiàn)報(bào)道該菌可污染生鮮肉、奶類、蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品。該菌對人體健康的危害與其攜帶的、、、等毒力基因編碼產(chǎn)生的多種毒力因子密切相關(guān)。假單胞菌是生鮮肉貯藏末期主要優(yōu)勢腐敗菌，也是牛奶、海產(chǎn)品、蔬菜等多種食品中常見腐敗菌。研究表明大腸桿菌O157:H7等食源性致病菌及假單胞菌等腐敗菌能夠黏附于食品加工相關(guān)的多種材料表面（如不銹鋼、木質(zhì)、橡膠、塑料、玻璃等）而形成生物菌膜，從而導(dǎo)致食品在屠宰、加工、貯藏、運(yùn)輸、消費(fèi)各環(huán)節(jié)受到交叉污染，引發(fā)食品安全威脅。生物菌膜對外界應(yīng)激的抵抗力增強(qiáng)、不易清除，已被證實(shí)是最主要的交叉污染源頭和傳播中心，對食品安全形成重大威脅。

自然環(huán)境中，生物菌膜幾乎都是由多種微生物形成的，群落內(nèi)部復(fù)雜的相互作用顯著影響著生物菌膜的結(jié)構(gòu)與活性。有研究表明混合菌膜比單種菌膜對消毒劑等抗菌物質(zhì)的抵抗力更強(qiáng)。生鮮肉、奶類等食品中污染的大腸桿菌O157:H7與假單胞菌形成混合菌膜時(shí)，將增加食品安全風(fēng)險(xiǎn)。目前，關(guān)于大腸桿菌O157:H7與食品中主要腐敗微生物混合菌膜形成的研究尚少見報(bào)道，尤其是混合菌膜形成時(shí)對其毒性的影響報(bào)道更少?；旌铣赡r(shí)不同交互作用可能影響混合菌膜的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)，包括致病菌的毒性，進(jìn)一步影響食品生產(chǎn)加工中生物性危害的防控措施。

因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合生產(chǎn)加工實(shí)際情況，以不銹鋼為生物菌膜形成的載體表面，研究3 株大腸桿菌O157:H7與前期從冷鮮肉貯藏末期分離的3 株假單胞菌及1 株假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為對象，研究兩種菌不同菌株之間混合菌膜形成時(shí)的交互作用，進(jìn)一步選取大腸桿菌O157:H7代表菌株，采用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription real-time polymerase chain reaction，RT-realtime PCR）定量分析其與4 株假單胞菌混合成膜時(shí)毒力基因表達(dá)的變化。本研究可為揭示食源性致病菌和腐敗菌混合菌膜形成的交互作用及進(jìn)一步風(fēng)險(xiǎn)防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

大腸桿菌O157:H7共3 株：菌株CICC21530，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；菌株ATCC43895，購自美國菌種保藏中心；菌株95，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省動物源食品生產(chǎn)與安全保障重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈。假單胞菌4 株：熒光假單胞菌ATCC13525（本實(shí)驗(yàn)編號為P13525），購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；其余3 株肉源假單胞菌為本實(shí)驗(yàn)室前期從腐敗豬肉中分離所得，其中熒光假單胞菌1 株P(guān)1、莓實(shí)假單胞菌2 株P(guān)7和P11。

胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptone soya agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）、酵母提取物（yeast extract，YE）、山梨醇麥康凱瓊脂（Sorbitol macconkey agar，SMAC）、伊紅美藍(lán)瓊脂（Eosin methylene blue agar，EMB）、假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基基礎(chǔ)、CFC基礎(chǔ)添加劑、亞碲酸鉀、P-09噻孢霉素北京陸橋技術(shù)有限公司；利福平、氨芐西林 南京藤春生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（片劑） 南京峰昌生物科技有限公司；氯化鈉、乙醇（均為分析純） 南京化學(xué)試劑有限公司；DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞（C502-02） 南京諾唯贊生物科技股份有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；Total RNA提取試劑（D9108A）、Premix（RR901A）、PrimeSTAR Max DNA Polymerase（R045A）、PCR純化試劑盒（Takara 9761）、pUCm-T質(zhì)粒、熒光定量試劑盒（RR420A）日本Takara公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2F超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HVE-50立式壓力蒸汽滅菌鍋 日本Hirayama公司；SG403A生物安全柜 美國Baker公司；HX-4拍打式無菌均質(zhì)器 上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；QL-200微型渦旋混合儀 海門其林貝爾儀器有限公司；2-16KL高速冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司；ZQTY-70臺式振蕩培養(yǎng)箱上海知楚儀器有限公司；DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司；DYCP-32B電泳儀 北京六一生物科技有限公司；Thermal Cycler普通PCR儀 美國Applied Biosystems公司；CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、Universal Hood II凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 菌液制備

將3 株大腸桿菌O157:H7凍存液劃線接種于TSA-YE平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種于3 mL TSB中，37 ℃振蕩（220 r/min）培養(yǎng)18 h，再轉(zhuǎn)接1 mL菌液至100 mL TSB中，37 ℃振蕩（220 r/min）培養(yǎng)18 h，菌液濃度達(dá)到9（lg（CFU/mL））左右。將4 株假單胞菌凍存液分別劃線接種于TSA-YE平板上，28 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落接種于3 mL TSB中，28 ℃ 振蕩（220 r/min）培養(yǎng)24 h，再轉(zhuǎn)接1 mL菌液至100 mL TSB中，28 ℃振蕩（220 r/min）培養(yǎng)24 h，菌液濃度達(dá)到8（lg（CFU/mL））左右。

1.3.2 大腸桿菌O157:H7和假單胞菌混合培養(yǎng)時(shí)的菌體泳動能力分析

將1.3.1節(jié)菌液離心，PBS洗滌重懸3 次，調(diào)整3 株大腸桿菌O157:H7和4 株假單胞菌的菌液濃度約為6（lg（CFU/mL）），制備接種菌液，其中1 株大腸桿菌O157:H7和1 株假單胞菌包括3 個處理組：大腸桿菌O157:H7與假單胞菌等量混合、大腸桿菌O157:H7與PBS等量混合、假單胞菌與PBS等量混合，備用。

采用軟瓊脂平板法分析泳動能力（swimming和swarming）。具體方法如下：配制swimming培養(yǎng)基（1%胰蛋白胨、0.5% NaCl、0.3%瓊脂粉和0.25%葡萄糖）；配制swarming平板培養(yǎng)基（2.5% LB、0.5%葡萄糖和0.5%瓊脂粉），于制好的平板中心表面分別滴加3 μL上述備用菌液，分別于25 ℃靜置培養(yǎng)8、20 h。用游標(biāo)卡尺測定細(xì)菌擴(kuò)散菌圈直徑，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5 次。

1.3.3 選擇性計(jì)數(shù)平板的篩選

為對混合菌膜中的兩種菌進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)，首先需要確定選擇性計(jì)數(shù)平板。分別制備SMAC、CT-SMAC、EMB、TSA-氨芐培養(yǎng)基（100 μg/mL）、TSA-利福平培養(yǎng)基（150 μg/mL）、假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基。將1.3.1節(jié)大腸桿菌O157:H7菌液和假單胞菌菌液，經(jīng)10 倍梯度稀釋，選擇合適稀釋度，各取100 μL分別涂布至上述平板。大腸桿菌O157:H7于37 ℃培養(yǎng)24 h、假單胞菌28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落形成情況。

1.3.4 大腸桿菌O157:H7與假單胞菌混合菌膜形成時(shí)的交互作用

1.3.4.1 混合菌膜制備

食品加工過程中多數(shù)接觸面為不銹鋼材質(zhì)，因此本實(shí)驗(yàn)選用食品級304不銹鋼片作為菌膜形成接觸面。為防止不銹鋼片表面附著化學(xué)雜質(zhì)及油污影響，使用前對不銹鋼片進(jìn)行徹底清洗：丙酮溶液中浸泡3 h，擦拭干凈，乙醇溶液浸泡過夜，最后用蒸餾水洗凈晾干，實(shí)驗(yàn)前于121 ℃滅菌20 min備用。

將1.3.1節(jié)大腸桿菌O157:H7菌液和假單胞菌菌液，PBS洗滌重懸3 次，接種至TSB制備兩種菌單菌菌液及兩種菌混合菌液，其中兩種菌濃度均約6（lg（CFU/mL））。分別吸取2 mL加入含有直徑1 cm不銹鋼片的12 孔板中。封口膜包被，25 ℃靜置培養(yǎng)72 h。

1.3.4.2 生物菌膜中細(xì)菌的培養(yǎng)計(jì)數(shù)

培養(yǎng)結(jié)束后取出不銹鋼片，用無菌生理鹽水漂洗3 次以去除未黏附的菌體，放入含有10 mL生理鹽水和玻璃珠的離心管中渦旋1 min，梯度稀釋，選取合適稀釋度涂布于1.3.3節(jié)確定的選擇性平板上，大腸桿菌O157:H7于37 ℃培養(yǎng)24 h，假單胞菌28 ℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.5 大腸桿菌O157:H7毒力基因表達(dá)水平測定

1.3.5.1 生物菌膜和浮游菌的制備與計(jì)數(shù)

選取1 株大腸桿菌O157:H7代表菌株，將其分別與4 株假單胞菌進(jìn)行混合培養(yǎng)和菌膜形成，分組同1.3.4節(jié)，為了獲得更多菌體細(xì)胞，于浸沒不銹鋼片（75 mm×25 mm×1 mm）的TSB中進(jìn)行，25 ℃靜置培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后，取出不銹鋼片，用生理鹽水洗滌3 次去除未黏附的菌體，用棉球擦拭法采集鋼片上的生物菌膜，將擦拭的棉球置于裝有10 mL無菌PBS（pH 7.2）和一定玻璃珠的離心管中，充分渦旋均質(zhì)3 min，定量吸取一定體積菌懸液12 000×離心15 min（4 ℃），得到生物菌膜的菌體沉淀，以備核酸提取。

取出不銹鋼片后，同時(shí)對培養(yǎng)液中的浮游菌進(jìn)行核酸提取。吸取各組浮游菌液4 mL，4 ℃、10 000×離心5 min，PBS重懸洗滌3 次，取菌體沉淀以備核酸提取。

此外，不銹剛片表面形成的菌膜均質(zhì)后進(jìn)行選擇性平板涂布，浮游菌液經(jīng)梯度稀釋后同時(shí)進(jìn)行大腸桿菌O157:H7選擇性平板涂布，37 ℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。菌數(shù)結(jié)果將用于后期基于單位菌數(shù)基因表達(dá)量的計(jì)算。

1.3.5.2 總RNA提取及cDNA合成

按照Total RNA提取試劑（D9108A）說明書進(jìn)行，用核酸蛋白微量測定儀測量提取的總RNA的核酸濃度和純度，確定提取的RNA濃度純度合格（OD/OD在1.8～2.0之間），調(diào)整RNA濃度后，根據(jù)PrimeScript?RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄的體系（10 μL）：2 μL 5×Prime ScriptMaster Mix混合液、2 μL RNA和6 μL Rnase free HO；反應(yīng)程序?yàn)椋?7 ℃反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)15 min，85 ℃反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)5 s，4 ℃，∞。將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA于-20 ℃保存進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.5.3 標(biāo)準(zhǔn)檢測質(zhì)粒構(gòu)建

大腸桿菌O157:H7 4 種毒力基因、、和的引物序列見表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)體系（50 μL）：Premix25 μL、上下游引物各1 μL、模板DNA 1 μL、ddHO 22 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃變性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸30 s，反應(yīng)35 個循環(huán)，4 ℃，∞。將上述cDNA分別進(jìn)行4 種毒力基因普通PCR擴(kuò)增及驗(yàn)證。驗(yàn)證后利用高保真酶PrimeSTAR Max Premix試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增以獲得目的片段。

表1 毒力基因real-time PCR的引物Table 1 Primers used for real-time PCR detection of virulence genes

PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和割膠純化，與pUCm-T vector連接后轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞。藍(lán)白斑篩選陽性克隆子，LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)一步提取質(zhì)粒后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，NCBI BLAST比對。比對正確的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)檢測質(zhì)粒，采用微量分光光度計(jì)測定純度和濃度，OD/OD值在1.8～2.0之間，表明質(zhì)粒的純度較好，利用公式質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)/（copies/μL）＝（6.02×10）×（質(zhì)粒濃度/（ng/μL）×10）/（DNA長度×660），計(jì)算質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)。

1.3.5.4 real-time PCR構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線

用無菌無酶水對質(zhì)粒10 倍梯度稀釋，以5～6 個梯度的質(zhì)粒溶液作為cDNA模板，按照SYBR Green Master (ROX) 10 μL、上下游引物各0.4 μL、cDNA 1 μL、ddHO 8.2 μL的反應(yīng)體系進(jìn)行real-time PCR。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s后，95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸30 s反應(yīng)40 個循環(huán)，60～95 ℃，熔點(diǎn)分析。以lg copies為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，構(gòu)建一元線性方程，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5.5 菌液和菌膜樣品中毒力基因的real-time PCR分析

將1.3.5.2節(jié)制備的cDNA作為模板，進(jìn)行real-time PCR獲得毒力基因的Ct值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算單菌培養(yǎng)、混菌培養(yǎng)的浮游菌中單位體積毒力基因表達(dá)量（copies/μL），以及單種菌膜、混合菌膜中單位面積毒力基因表達(dá)量（copies/cm）?？紤]到單菌培養(yǎng)時(shí)、混菌培養(yǎng)時(shí)，浮游菌數(shù)、菌膜菌數(shù)的差異，進(jìn)一步計(jì)算基于單位菌數(shù)的毒力基因表達(dá)量（copies/CFU），公式如下：

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

利用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及圖表分析，應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行顯著性分析，采用ANOVA進(jìn)行單因素方差分析及Duncan多重比較檢驗(yàn)（＜0.05），兩組之間顯著性差異采用檢驗(yàn)分析（＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩菌混合時(shí)的泳動能力變化

大腸桿菌O157:H7菌株CICC21530、ATCC43895和菌株95分別與4 株假單胞菌混合培養(yǎng)時(shí)菌體泳動能力見圖1～3。結(jié)果可見，3 株大腸桿菌O157:H7的泳動能力均顯著小于4 株假單胞菌泳動能力（＜0.05），兩菌混合時(shí)的泳動圈均顯著大于O157單菌和小于假單胞菌單菌，表明混合培養(yǎng)時(shí)假單胞菌的泳動能力受到顯著抑制。

圖1 大腸桿菌O157:H7菌株CICC21530分別與4 株假單胞菌混合時(shí)的菌體泳動能力（n=5）Fig.1 Motility of co-cultures of E.coli O157:H7 CICC21530 with four Pseudomonas strains,separately (n=5)

圖2 大腸桿菌O157:H7菌株ATCC43895分別與4 株假單胞菌混合時(shí)的菌體泳動能力（n=5）Fig.2 Motility of co-cultures of E.coli O157:H7 ATCC43895 with four Pseudomonas strains,separately (n=5)

圖3 大腸桿菌O157:H7菌株95與4 株假單胞菌混合時(shí)的菌體泳動能力（n=5）Fig.3 Motility of co-cultures of E.coliO157:H7 95 with four Pseudomonas strains,separately (n=5)

2.2 選擇性計(jì)數(shù)平板的確定

所用的選擇性計(jì)數(shù)培養(yǎng)基有SMAC、CT-SMAC、SEMB、TSA+利福平平板、TSA+氨芐平板、CFC假單胞菌選擇性平板，部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。大腸桿菌O157:H7只在TSA-利福平平板生長，在CFC假單胞菌選擇性平板上不生長；假單胞菌在CFC假單胞菌選擇性平板上生長，在TSA-利福平平板不生長；兩菌在SMAC、CT-SMAC、SEMB、氨芐平板均不生長。因此，本實(shí)驗(yàn)將TSA-利福平平板作為混菌中大腸桿菌O157:H7的計(jì)數(shù)平板，將CFC假單胞菌選擇性平板作為混菌中假單胞菌的計(jì)數(shù)平板。

圖4 大腸桿菌O157:H7和假單胞菌混合培養(yǎng)計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的確定Fig.4 Determination of counting media for mixed culture of E.coli O157:H7 and Pseudomonas

2.3 大腸桿菌O157:H7和假單胞菌混合菌膜形成時(shí)的交互作用

大腸桿菌O157:H7菌株CICC21530、ATCC43895和菌株95分別與4 株假單胞菌25 ℃、72 h菌膜形成情況見圖5～7。

圖5 大腸桿菌O157:H7 CICC21530和4 株假單胞菌混合菌膜形成Fig.5 Mixed biofilm formation of E.coli O157:H7 CICC21530 and four Pseudomonas isolates

菌株CICC21530與假單胞菌25 ℃、72 h菌膜形成情況如圖5所示。CICC21530與假單胞菌P1、P7混合成膜時(shí)，混合菌膜中CICC21530與其單種菌膜形成量無顯著差異（圖5A、B），CICC21530與P11、P13525混合成膜時(shí)，顯著少于其單種菌膜形成量（＜0.05）（圖5C、D）。4 種混合菌膜中假單胞菌的量均顯著受到CICC21530抑制，少于其單種菌膜形成量（＜0.05）。

ATCC43895和P7、P11共培養(yǎng)時(shí)，混合菌膜中的量顯著低于各自單種菌膜形成量（＜0.05），產(chǎn)生了相互抑制（圖6B、C）。ATCC43895和P1、P13525共培養(yǎng)時(shí)，混合菌膜中ATCC43895菌膜形成未受明顯影響，而ATCC43895顯著抑制了P1和P13525菌膜形成（＜0.05）（圖6A、D）。

圖6 大腸桿菌O157:H7 ATCC43895和4 株假單胞菌混合菌膜形成Fig.6 Mixed biofilm formation of E.coliO157:H7 ATCC43895 and four Pseudomonas isolates

菌株95與P1、P7、P13525會相互抑制菌膜形成（圖7A、B、D），混合菌膜中的形成量比其單種菌膜形成量減少（＜0.05）。菌株95與P11共培養(yǎng)時(shí)，95的菌膜形成未受影響，而95抑制了P11菌膜形成（圖7C）。

圖7 大腸桿菌O157:H7菌株95和4 株假單胞菌混合菌膜形成Fig.7 Mixed biofilm formation of E.coliO157:H7 95 and four Pseudomonas isolates

綜上可見，3 株大腸桿菌O157:H7分別與4 株假單胞菌混合菌膜形成時(shí)，兩種菌未發(fā)生相互促進(jìn)，而4 株假單胞菌菌膜形成均受到了大腸桿菌O157:H7的抑制。

2.4 大腸桿菌O157:H7 CICC21530毒力基因表達(dá)分析

2.4.1 4 種毒力基因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

大腸桿菌O157:H7 CICC21530的4 種毒力基因、、和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如表2所示，其中為標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)值，為測得的Ct值。由表2可知，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，Ct值在5～40之間，滿足標(biāo)準(zhǔn)曲線要求。

表2 毒力基因stx1、stx2、eae和hly的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Standard curves for quantitation of the virulence genes stx1,stx2,eae and hly

2.4.2 浮游菌中單位體積毒力基因表達(dá)量的變化

大腸桿菌O157:H7 CICC21530與4 株假單胞菌（P1、P7、P11、P13525）共培養(yǎng)時(shí)，CICC21530單菌培養(yǎng)及混合培養(yǎng)時(shí)浮游菌中單位體積毒力基因（、、和）的表達(dá)量如圖8所示。與CICC21530單菌培養(yǎng)相比，混合培養(yǎng)時(shí)CICC21530單位體積4 種毒力基因表達(dá)量均顯著減少（＜0.05），4 株假單胞菌產(chǎn)生了不同程度的抑制作用。

圖8 單菌培養(yǎng)及混合培養(yǎng)時(shí)浮游菌中單位體積毒力基因表達(dá)量Fig.8 Virulence genes expression per unit volume of planktonic cells in single and mixed cultures

2.4.3 生物菌膜中單位面積毒力基因表達(dá)量的變化

大腸桿菌O157:H7 CICC21530與4 株假單胞菌共培養(yǎng)時(shí)，CICC21530單種菌膜及混合菌膜中單位面積毒力基因（、、和）的表達(dá)量如圖9所示。與單種菌膜相比，混合菌膜中CICC21530單位面積4 種毒力基因表達(dá)量均顯著減少（＜0.05）。

圖9 單種與混合生物菌膜中單位面積毒力基因表達(dá)量Fig.9 Virulence genes expression per unit area in single and mixed biofilms

2.4.4 浮游菌中單位菌數(shù)毒力基因表達(dá)量的變化

CICC21530與4 株假單胞菌共培養(yǎng)時(shí)，CICC21530單菌培養(yǎng)及混合培養(yǎng)時(shí)浮游菌中單位菌數(shù)毒力基因的表達(dá)如圖10所示。與單菌培養(yǎng)相比，混合培養(yǎng)時(shí)浮游菌中CICC21530單位菌數(shù)4 種毒力基因表達(dá)量均顯著減少（＜0.05）。

圖10 單菌培養(yǎng)及混合培養(yǎng)時(shí)浮游菌中單位菌數(shù)毒力基因表達(dá)量Fig.10 Virulence genes expression per unit cell number of planktonic cells in single and mixed cultures

2.4.5 生物菌膜中單位菌數(shù)毒力基因表達(dá)量的變化

CICC21530與4 株假單胞菌共培養(yǎng)時(shí)，CICC21530單種菌膜及混合菌膜中單位菌數(shù)毒力基因表達(dá)量如圖11所示。與單種生物菌膜相比，CICC21530混合菌膜中單位菌數(shù)4 種毒力基因表達(dá)量均顯著減少（＜0.05）。

圖11 單種與混合生物菌膜中單位菌數(shù)毒力基因表達(dá)量Fig.11 Virulence genes expression per unit cell number in single and mixed biofilms

綜合2.4.4節(jié)基于單位菌數(shù)的結(jié)果，表明CICC21530生物菌膜中4 種毒力基因表達(dá)量均顯著高于浮游菌中的表達(dá)量（＜0.05），表明生物菌膜的形成增強(qiáng)了菌體毒力基因的表達(dá)。

3 討論

大腸桿菌O157:H7和假單胞菌可以同時(shí)存在于肉類、奶類、蔬菜等食品中，當(dāng)它們形成混合菌膜時(shí)將大大增加食品安全風(fēng)險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)首先從泳動性反映混合培養(yǎng)時(shí)兩菌之間的相互作用。細(xì)菌的泳動能力包括swimming（單一菌體運(yùn)動行為）和swarming（群體菌體運(yùn)動行為），研究表明生物菌膜的形成與細(xì)菌泳動能力呈現(xiàn)一定相關(guān)性，菌體通過泳動到達(dá)材料表面并產(chǎn)生附著，在鞭毛/菌毛的作用下黏附固著進(jìn)一步形成生物菌膜。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌O157:H7與假單胞菌各菌株菌體泳動性存在差異，這與銅綠假單胞菌、芽孢桿菌、蜂房哈夫尼菌、沙門氏菌、副溶血弧菌等細(xì)菌泳動性的研究報(bào)道結(jié)論相似。本實(shí)驗(yàn)中大腸桿菌O157:H7與假單胞菌相比，假單胞菌的泳動能力更強(qiáng)，這可能與假單胞菌的菌體特性（鞭毛/菌毛及結(jié)構(gòu)）、良好的適應(yīng)環(huán)境與繁殖能力有關(guān)。不同細(xì)菌混合培養(yǎng)時(shí)，細(xì)菌間交互作用會影響各自泳動能力。

食品中存在復(fù)雜的微生物生態(tài)系統(tǒng)，它們之間在不同生存環(huán)境下可能產(chǎn)生不同的交互作用。同樣，混合菌膜內(nèi)不同菌種之間也可發(fā)生不同交互作用，呈現(xiàn)促進(jìn)、競爭、或中立效應(yīng)。關(guān)于大腸桿菌或大腸桿菌O157:H7與其他細(xì)菌的多菌種混合菌膜形成有不同研究報(bào)道。有研究發(fā)現(xiàn)糞腸球菌、不動桿菌、惡臭假單胞菌、銅綠假單胞菌、食品加工廠一些分離雜菌等促進(jìn)大腸桿菌或大腸桿菌O157:H7的菌膜形成；另一些研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌、沙門氏菌、格式假單胞菌等抑制大腸桿菌或大腸桿菌O157:H7的菌膜形成。反之，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌或大腸桿菌O157:H7可抑制銅綠假單胞菌、成團(tuán)泛菌的菌膜形成，但未影響沙拉加工廠中分離菌株的黏附。關(guān)于假單胞菌與其他細(xì)菌混合菌膜的相關(guān)研究中也有不同報(bào)道。Kives等將原料乳中分離的熒光假單胞菌和乳酸乳球菌在脫脂乳中7 ℃共培養(yǎng)72 h探究混合菌膜的形成，研究發(fā)現(xiàn)兩種菌的成膜量均顯著高于單菌的成膜量；Zhu Junli等利用結(jié)晶紫染色法定量熒光假單胞菌和波羅的海希瓦氏菌不同培養(yǎng)溫度（4、15 ℃和30 ℃）下單種和混合菌膜形成量差異，結(jié)果表明兩種菌的成膜量均顯著低于單菌；Lapointe等探究了熒光假單胞菌、植物乳桿菌、假腸膜明串珠菌在20 ℃共培養(yǎng)12 d時(shí)混合菌膜的形成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)混合菌膜中的明串珠菌、植物乳桿菌的成膜量均顯著高于單菌，而熒光假單胞菌與單菌時(shí)無顯著差異。本實(shí)驗(yàn)中3 株大腸桿菌O157:H7和4 株假單胞菌混合成膜時(shí)，3 株大腸桿菌O157:H7菌膜形成未受影響或受到假單胞菌的抑制，而4 株假單胞菌菌膜形成均受到了大腸桿菌O157:H7的抑制。上述關(guān)于混合成膜時(shí)細(xì)菌間相互作用的研究報(bào)道不完全一致，這可能與不同菌種、菌株及成膜條件差異性相關(guān)。

菌膜形成時(shí)，由于生存環(huán)境和生存狀態(tài)改變，有可能導(dǎo)致致病菌的毒力發(fā)生變化，進(jìn)而影響食品安全風(fēng)險(xiǎn)。Wang Yang等利用RT-real-time PCR相對定量發(fā)現(xiàn)，與浮游菌中毒力基因表達(dá)量相比，豬鏈球菌生物菌膜中、和三種毒力基因表達(dá)量下調(diào)；譚芳等利用RT-real-time PCR相對定量發(fā)現(xiàn)在銅綠假單胞菌生物菌膜形成過程中，其毒力基因表達(dá)增強(qiáng)，毒力基因調(diào)控的毒素LasA、LasB彈性蛋白酶、鼠李糖脂、綠膿素分泌均增高；Wang Huhu等采用RT-real-time PCR相對定量研究沙門氏菌發(fā)現(xiàn)，與浮游菌相比，在TSB中成膜后毒力基因表達(dá)量呈現(xiàn)顯著上調(diào)的趨勢，而在肉汁滲出液中成膜后基因在7 d時(shí)出現(xiàn)顯著降低，和毒力基因表達(dá)量在培養(yǎng)周期內(nèi)持續(xù)降低。Sánchez等通過轉(zhuǎn)錄組分析比較了牙齦卟啉單胞菌在生物菌膜和浮游菌狀態(tài)下基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)在生物菌膜中與細(xì)菌黏附、侵襲或毒力相關(guān)的幾個編碼蛋白的基因（、、、、）表達(dá)上調(diào)；Charlebois等通過RNA測序研究了產(chǎn)氣莢膜梭菌在生物菌膜和浮游菌之間基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)生物菌膜中編碼-氯條蛋白、膠原酶、壞死性腸炎毒素B、全溶素O和磷脂酶C的基因下調(diào)，而編碼溶血素的基因上調(diào)。上述生物菌膜中毒力基因表達(dá)變化的研究報(bào)道并不完全一致，可能與不同菌種、不同菌株以及不同階段的生物菌膜等有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過絕對定量分析，消除菌數(shù)差異后發(fā)現(xiàn)大腸桿菌O157:H7生物菌膜中4 種毒力基因（、、和）表達(dá)量均顯著高于浮游菌，表明生物菌膜的形成不僅導(dǎo)致致病菌抗性增強(qiáng)，不易消除，還可能導(dǎo)致毒力增強(qiáng)，從而增加食品安全風(fēng)險(xiǎn)。

上述是關(guān)于單種菌菌膜形成時(shí)毒力基因表達(dá)變化，實(shí)際生產(chǎn)加工中，食品加工接觸表面形成的生物菌膜大多是由多種細(xì)菌組成的混合菌膜，研究混合菌膜形成時(shí)致病菌毒力的變化更具有實(shí)際意義。Kart等利用RTreal-time PCR相對定量，以看家基因?yàn)閮?nèi)參基因，分析了與變形桿菌混合成膜時(shí)白色念珠菌毒力基因表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)與單種菌膜相比，白色念珠菌和基因表達(dá)顯著上調(diào)，、和基因表達(dá)下調(diào)。Cavalcanti等利用相對定量，以為內(nèi)參基因，研究混合成膜時(shí)白色念珠菌毒力基因表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)與白色念珠菌單種菌膜相比，白色念珠菌和血鏈球菌混合成膜時(shí)、、和顯著上調(diào)，白色念珠菌和牙齦卟啉單胞菌混合成膜時(shí)和表達(dá)下調(diào)，當(dāng)3 種菌混合成膜時(shí)白色念珠菌上調(diào)了、和，白色念珠菌毒力因子表達(dá)與混合菌膜中不同的細(xì)菌種類有關(guān)。Cope等利用相對定量，分別以基因、基因?yàn)閮?nèi)參基因，研究肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌混合成膜時(shí)毒力基因表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)混合成膜時(shí)肺炎鏈球菌丙酮酸氧化酶基因表達(dá)上調(diào)，而溶血素、黏附因子A的基因表達(dá)下調(diào)。陳忠軍等采用相對定量，以16S rRNA為內(nèi)參基因，研究3 種細(xì)菌混合成膜時(shí)金黃色葡萄球菌毒力基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)與金黃色葡萄球菌單種菌膜相比，混合菌膜中金黃色葡萄球菌毒力基因上調(diào)顯著的有腸毒素基因、，顯著下降的有溶血素基因和脫皮毒素基因。需要注意的是，采用RTreal-time PCR相對定量對混菌中的某一種菌進(jìn)行基因表達(dá)分析時(shí)，應(yīng)該選擇該菌特異的內(nèi)參基因。目前，采用RT-real-time PCR絕對定量方法研究混合菌膜中致病菌毒力基因表達(dá)差異，此類報(bào)道尚少見。絕對定量不僅可了解接觸面或生長環(huán)境中因細(xì)菌毒力基因表達(dá)差異而引起的安全風(fēng)險(xiǎn)變化，亦可通過消除菌數(shù)差異來分析菌體毒力基因表達(dá)的變化。本實(shí)驗(yàn)采用絕對定量發(fā)現(xiàn)大腸桿菌O157:H7和假單胞菌混合成膜時(shí)，與大腸桿菌O157:H7單種菌膜相比，混合菌膜中單位面積4 種毒力基因表達(dá)量均顯著減少，表明接觸面混合菌膜的風(fēng)險(xiǎn)性比大腸桿菌O157:H7單種菌膜有所降低；消除菌數(shù)差異后發(fā)現(xiàn)，單位菌數(shù)4 種毒力基因表達(dá)量均顯著減少，表明混合成膜時(shí)假單胞菌抑制了大腸桿菌O157:H7菌體毒力基因的表達(dá)。值得注意的是，該菌感染劑量極低，致病性較強(qiáng)，故即使毒力基因表達(dá)減少，其菌膜的安全風(fēng)險(xiǎn)仍不容忽視。食品生產(chǎn)加工中不同環(huán)境條件、不同來源菌種和菌株等可導(dǎo)致它們發(fā)揮不同交互作用，在生產(chǎn)加工接觸面形成不同結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的混合菌膜，并可進(jìn)一步影響其抗性及致病性。因此結(jié)合實(shí)際食品環(huán)境，加強(qiáng)對食源性有害分離菌株混合菌膜形成和控制的深入研究具有重要的科學(xué)意義。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)探討了主要食源性致病菌大腸桿菌O157:H7和食品中常見腐敗菌假單胞菌的不同菌株之間混合生物菌膜形成時(shí)的交互影響。細(xì)菌泳動性結(jié)果提示兩種菌共培養(yǎng)時(shí)假單胞菌泳動能力受到顯著抑制。生物菌膜的培養(yǎng)計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)兩種菌混合成膜時(shí)，不同菌株之間交互作用不完全相同，兩種菌未發(fā)生相互促進(jìn)，其中4 株假單胞菌的菌膜形成均受到3 株大腸桿菌O157:H7顯著抑制。大腸桿菌O157:H7 CICC21530與4 株假單胞菌共培養(yǎng)成膜時(shí)，采用RT-real-time PCR絕對定量發(fā)現(xiàn)，與大腸桿菌O157:H7單種菌膜相比，混合菌膜中單位面積毒力基因表達(dá)量均顯著減少，表明接觸面混合菌膜的風(fēng)險(xiǎn)性比大腸桿菌O157:H7單種菌膜有所降低；消除菌數(shù)差異后發(fā)現(xiàn)，單位菌數(shù)毒力基因表達(dá)量均顯著減少，表明混合成膜時(shí)假單胞菌抑制了大腸桿菌O157:H7菌體毒力基因的表達(dá)。此外，菌膜中單位菌數(shù)毒力基因表達(dá)顯著高于浮游菌，表明菌膜形成后大腸桿菌O157:H7毒力增強(qiáng)，安全風(fēng)險(xiǎn)增加。本研究可為揭示食源性致病菌和腐敗菌混合菌膜形成的交互作用及進(jìn)一步風(fēng)險(xiǎn)評估和風(fēng)險(xiǎn)防控提供科學(xué)依據(jù)。