趙姝婷，王維浩,2，全志剛，王 娟，劉德志，王一飛，武云嬌，蘇有韜，魏春紅，曹龍奎,2,3,

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319；3.黑龍江省天然產(chǎn)物模擬移動(dòng)床色譜分離技術(shù)創(chuàng)新中心，黑龍江 大慶 163319）

綠豆原產(chǎn)于亞洲的印度東北部、緬甸等地，其中碳水化合物占63%，膳食纖維占16%，是淀粉的重要來(lái)源。綠豆淀粉因其高直鏈淀粉含量和高交聯(lián)特性，可用于生產(chǎn)具有多種益生作用的抗性淀粉（resistant starch，RS）。RS在小腸中不消化，但是可以在大腸中發(fā)酵和吸收，對(duì)于調(diào)節(jié)血糖水平，改善糖脂吸收和促進(jìn)腸道有益菌增值方面有著重要作用。RS分為5 種類(lèi)型，其中化學(xué)改性淀粉被歸類(lèi)為RS4。RS4抗消化能力與取代基引起的消化酶攻擊空間受阻有關(guān)，取代基的引入導(dǎo)致更大的立體位阻效應(yīng)，阻止了酶-底物復(fù)合物的形成，使其具有抗降解性，如醚化、交聯(lián)和酯化。目前檸檬酸酯化淀粉的制備方法主要為干熱法、濕熱法和電位循環(huán)法。當(dāng)?shù)矸酆蜋幟仕峄旌象w系受熱時(shí)，酸攻擊淀粉鏈，檸檬酸酐將淀粉鏈上的羥基取代。干熱酯化法是被用于生產(chǎn)改良淀粉制劑、食品工業(yè)、制藥等最常用的方法。添加其他化學(xué)成分的食品安全性難以控制，檸檬酸作為較安全的食品添加劑是近年來(lái)應(yīng)用最廣泛且安全的制備RS4的物質(zhì)之一。

硒是動(dòng)植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的微量元素，不能自身合成，只能從食品和硒補(bǔ)充劑中獲得。硒在自然界中的存在形式可根據(jù)硒的形態(tài)分為有機(jī)硒和無(wú)機(jī)硒。與無(wú)機(jī)硒相比，有機(jī)硒更容易被人體吸收。硒多糖因其穩(wěn)定性強(qiáng)、生物活性高被廣泛應(yīng)用于硒補(bǔ)劑中。由于天然硒多糖中硒含量較低，因此需要通過(guò)硒化獲得硒含量豐富的有機(jī)硒多糖。硒多糖組成分為單聚糖和雜聚糖兩類(lèi)，主要連接方式為1-3糖苷鍵，絕大多數(shù)為-構(gòu)型。硒化修飾是通過(guò)NaSeO與半縮醛羥基（C-OH）和酯基發(fā)生反應(yīng)形成，利用糖鏈上的羥基、氨基等活性基團(tuán)與硒化試劑中的含硒化合物通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合在糖鏈上，檸檬酸酯化淀粉因具有較多的半縮醛羥基和酯基可作為硒化的主要原料。有研究表明，平菇、苦瓜、龍骨等植物硒化多糖有顯著降糖作用，可能是由于它們具有對(duì)-淀粉酶和-葡萄糖苷酶的抑制活性。王峙力等將甜玉米芯多糖進(jìn)行硒化后發(fā)現(xiàn)對(duì)兩種酶的抑制作用顯著升高。同時(shí)，硒是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的重要組成部分，能促進(jìn)受損胰島細(xì)胞修復(fù)及葡萄糖代謝降低血糖水平，Lian Kexun等通過(guò)研究硒化甘草多糖體內(nèi)抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)血液和肝臟中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性顯著升高，肝腎中丙二醛的含量顯著降低。RS4也可通過(guò)抑制與糖代謝有關(guān)酶活抵抗糖類(lèi)消化，二者協(xié)同改善體內(nèi)糖代謝情況。本研究以RS4為原料進(jìn)行硒化，在抵抗消化的基礎(chǔ)上增強(qiáng)對(duì)酶的抑制作用，同時(shí)硒的引入可以增強(qiáng)抗氧化活性，修復(fù)受損的胰島細(xì)胞，進(jìn)一步強(qiáng)化其生物學(xué)功能。硒化綠豆RS4（selenized mung bean resistant starch，MB-RS4·Se（IV））可作為抗氧化劑和酶抑制劑，研究其可能在體內(nèi)發(fā)揮的作用，為尋找新型、高效、低毒的輔助降糖補(bǔ)硒食品及藥物提供初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)以綠豆抗性淀粉（mung bean resistant starch，MB-RS4）為原料，采用硝酸-亞硒酸鈉法制備MB-RS4·Se（IV），并對(duì)硒化前后MB-RS4采用掃描電鏡、紫外光譜、傅里葉變換紅外光譜、X射線衍射、凝膠滲透色譜、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）測(cè)定顆粒形貌、相對(duì)分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)變化；考察體外對(duì)-葡萄糖苷酶和-淀粉酶抑制作用并進(jìn)行酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析，為硒化綠豆抗性淀粉在功能性食品和天然藥物的開(kāi)發(fā)領(lǐng)域提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆淀粉（食品級(jí)） 市售。

亞硒酸鈉 天津市大茂化學(xué)試劑廠；-葡萄糖苷酶（水解酶類(lèi)，酶活力40～80 U/mg）、豬胰-淀粉酶（水解酶類(lèi)，酶活力50 U/mg） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；4-硝基苯基---吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl--glucopyranoside，pNPG） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；可溶性淀粉 北京北化精細(xì)化學(xué)品有限公司；所有無(wú)機(jī)試劑均為分析純，購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

DGA-9080A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 梅特勒-托利多儀器上海有限公司；真空冷凍干燥機(jī) 基因有限公司；透析袋（m為1 000 Da） 上海源葉生物科技有限公司；S-570掃描電子顯微鏡 日本日立公司；D/MAX2000V型X射線衍射儀 日本理學(xué)制造公司；T6系列紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；4500傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)Thermo Nicolet公司；GPC-20A高效凝膠滲透色譜（high performance gel permeation chromatography，GPC）儀、RID-20示差折光檢測(cè)器 日本島津公司；AVANCE III 600M NMR儀 德國(guó)布魯克公司；SPECTROstar Nano酶標(biāo)儀 德國(guó)BMG LABTECH公司。

1.3 方法

1.3.1 MB-RS4的制備

根據(jù)李蒙娜的方法并作適當(dāng)修改。將淀粉與檸檬酸按照干基比5∶2混合，加入適量蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)混合體系pH 3.5左右，室溫靜置12 h，于40 ℃烘干。取出干燥樣品粉碎過(guò)60 目篩，取篩下物于150 ℃酯化4 h，反應(yīng)產(chǎn)物用無(wú)水乙醇洗滌3 次，37 ℃烘干至水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%，即得MB-RS4（RS4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為83.72%）。

MB-RS4測(cè)定方法：準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g樣品，加入5 mL-淀粉酶和葡萄糖苷酶混合液后，取不同時(shí)間的水解液采用GOPOD法進(jìn)行測(cè)定。

根據(jù)下式計(jì)算樣品中RS4含量：

式中：和分別為淀粉酶水解反應(yīng)20 min和120 min后產(chǎn)生的葡萄糖含量；TS為樣品中的總淀粉含量/mg；0.9為換算系數(shù)。

1.3.2 MB-RS4·Se（IV）的制備

根據(jù)王麗波等的方法并作適當(dāng)修改。用50 mL體積分?jǐn)?shù)為0.5%的HNO溶液溶解樣品（1.0 g），在室溫下攪拌30 min，加入1.0 g NaSeO和0.7 g BaCl，將混合物在66 ℃攪拌反應(yīng)3.5 h。冷卻至室溫滴加1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7～8。加入0.5 g NaSO除去溶液中的雜質(zhì)Ba，4 000 r/min離心15 min，取上清液后透析出反應(yīng)產(chǎn)生的無(wú)機(jī)鹽和多余的NaSeO、濃縮、醇沉，凍干即得MB-RS4·Se（IV），得率為26.450 6%。

1.3.3 MB-RS4·Se（IV）得率計(jì)算

按式（4）計(jì)算MB-RS4·Se（IV）得率：

式中：為MB-RS4·Se（IV）的質(zhì)量/g；為MB-RS4的質(zhì)量/g。

1.3.4 MB-RS4·Se（IV）中硒含量的測(cè)定

1.3.4.1 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)國(guó)標(biāo)選用分光光度法測(cè)MB-RS4·Se（IV）中硒含量。測(cè)得硒標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為=19.380 21-0.042 04，=0.995 7，其中：為硒含量/mg，為吸光度。

1.3.4.2 MB-RS4·Se（IV）中硒含量的測(cè)定

在酸性條件下MB-RS4·Se（IV）中Se可以與鄰苯二胺生成絡(luò)合物，絡(luò)合物在330～340 nm處有紫外吸收特征峰，根據(jù)此原理測(cè)得MB-RS4·Se（IV）中的硒含量。

5 mg樣品中加入2 mL HNO溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%），4 ℃放置過(guò)夜。將樣品加熱至燒杯中無(wú)橙黃色煙霧生成，冷卻至室溫加入6 mol/L的鹽酸8 mL繼續(xù)加熱至無(wú)白色煙霧生成，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶，加入2 mL鄰苯二胺（質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%）溶液，然后用HCl溶液定容并調(diào)節(jié)pH 2，避光反應(yīng)1 h，最后用5 mL甲苯萃取，在334 nm波長(zhǎng)處測(cè)定有機(jī)相吸光度，按下式計(jì)算樣品中硒含量：

式中：為有機(jī)相中硒的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；為定容后待測(cè)溶液體積（25 mL）；為有機(jī)相總體積（5 mL）；為待測(cè)溶液體積（2 mL）；為MBRS4·Se（IV）質(zhì)量（5 mg）。

本實(shí)驗(yàn)制備所得MB-RS4·Se（IV）中硒含量為2.21 mg/g。

1.3.5 MB-RS4·Se（IV）的結(jié)構(gòu)測(cè)定

1.3.5.1 掃描電子顯微鏡觀察

根據(jù)Asad等的方法并作適當(dāng)修改對(duì)樣品的形貌和微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。將樣品置于雙面膠帶噴金，于50.0 kV收集圖像。

1.3.5.2 紫外光譜測(cè)定

配制質(zhì)量濃度為2 mg/mL樣品溶液，蒸餾水作空白對(duì)照，注射器吸取待測(cè)樣品，針孔過(guò)濾器過(guò)濾，190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，掃描間隔1 nm。

1.3.5.3 傅里葉變換紅外光譜測(cè)定

根據(jù)Castrocampos等的方法并作適當(dāng)修改對(duì)兩種物質(zhì)進(jìn)行分析，將2 mg樣品與200 mg溴化鉀（KBr）粉末混合并壓片于4 000～400 cm測(cè)定。

1.3.5.4 X射線衍射圖譜分析

根據(jù)González等的方法并作適當(dāng)修改。將干燥細(xì)膩的樣品均勻分散于板框內(nèi)壓實(shí)，使得樣品表面光滑平整，將樣品框固定后測(cè)試。衍射測(cè)試條件：管電流40 mA、管電壓40 kV、Cu靶波長(zhǎng)1.540 6 ?、Co靶波長(zhǎng)1.790 26 ?、掃描速率7°/min、2測(cè)量范圍5°～70°。

1.3.5.5 GPC法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量及分布

采用窄分布聚乙二醇（polyethylene glycol，PEO）作標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)校正法。標(biāo)準(zhǔn)樣品：窄分布PEO標(biāo)樣組；RID-20示差折光檢測(cè)器；樣品處理：取50 mg樣品，加1 mL 90%二甲基亞砜溶液，溶解過(guò)夜，加2.5 mL無(wú)水乙醇，離心去除上清液，沉淀經(jīng)無(wú)水乙醇洗滌2 次，風(fēng)干后加入（0.1 mol/L NaNO+0.06% NaN溶液）溶解，于121 ℃反應(yīng)20 min，5 000 r/min離心10 min，取20 μL上樣檢測(cè)；流速：0.6 mL/min，柱溫：35 ℃。

采用TSKgel GMPWXL凝膠色譜柱分別對(duì)改性前后MB-RS4相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定。樣品數(shù)據(jù)采用日本島津HW-2000 GPC色譜工作站分析計(jì)算。

1.3.5.6 NMR測(cè)定

根據(jù)Li Min等的方法并作適當(dāng)修改，將樣品溶于DO，充分振蕩使其完全溶解，D-NMR（H-NMR、C-NMR）。

1.3.6 MB-RS4·Se（IV）體外酶活抑制測(cè)定

根據(jù)Wang Hao等的方法并作適當(dāng)修改。將-葡萄糖苷酶用0.1 mol/L（pH 6.8）磷酸鹽緩沖溶液稀釋成1 U/mL，配制pNPG濃度為5 mmol/L。測(cè)定時(shí)，向96 孔板加入50 μL樣品溶液，同時(shí)加入50 μL pNPG溶液，37 ℃孵育10 min，取出加入100 μL-葡萄糖苷酶溶液37 ℃孵育45 min，加入50 μL濃度為0.2 mol/L的NaCO溶液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm波長(zhǎng)處吸光度（）。反應(yīng)體系見(jiàn)表1，以阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照，酶活抑制率計(jì)算按式（6）計(jì)算：

表1 α-葡萄糖苷酶抑制作用反應(yīng)體系Table 1 Composition of reaction system for α-glucosidase inhibition μL

式中：為添加樣品和酶時(shí)測(cè)定抑制組吸光度；為將酶液換為等體積緩沖溶液的對(duì)照組吸光度；為將樣品替換為等體積ddHO的背景組吸光度；為將樣品以等體積ddHO替代，酶液以緩沖溶液替代測(cè)定空白組吸光度。

1.3.6.2 抑制-葡萄糖苷酶動(dòng)力學(xué)分析

固定酶濃度為1 U/mL，96 孔板中加入50 μL不同濃度樣品溶液，同時(shí)加入50 μL不同濃度pNPG溶液，在37 ℃孵育10 min，取出加入100 μL-葡萄糖苷酶溶液37 ℃孵育45 min，加入50 μL濃度為0.2 mol/L的NaCO溶液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm吸光度。最大酶促反應(yīng)速率（）、米氏常數(shù)（）等動(dòng)力學(xué)參數(shù)可通過(guò)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖確定，即酶反應(yīng)速率（）的倒數(shù)1/與底物濃度（pNPG）的倒數(shù)1/[]的關(guān)系圖。

1.3.6.3 對(duì)-淀粉酶的抑制作用

根據(jù)Sangilimuthu等的方法并作適當(dāng)修改。用緩沖溶液配制濃度為2 U/mL的豬胰-淀粉酶和1%的可溶性淀粉，將不同濃度梯度的樣品溶液40 μL與-淀粉酶40 μL混合37 ℃孵育30 min，加入40 μL可溶性淀粉后繼續(xù)孵育10 min，然后加入160 μL 3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）保溫5 min煮沸顯色，稀釋2 倍體積后取200 μL于96 孔板，在540 nm測(cè)定抑制組吸光度，同時(shí)做對(duì)照組、背景組和空白組，通過(guò)式（3）計(jì)算抑制率，體系內(nèi)所加溶液體積如表2所示。

表2 α-淀粉酶抑制作用反應(yīng)體系Table 2 Composition of reaction system for α-amylase inhibition μL

1.3.6.4 抑制-淀粉酶動(dòng)力學(xué)分析

將黨員后備培養(yǎng)、黨員教育管理、村級(jí)事務(wù)管理等納入對(duì)黨組織書(shū)記考核，強(qiáng)化督導(dǎo)檢查，對(duì)出現(xiàn)的問(wèn)題及時(shí)診斷、及時(shí)對(duì)癥下藥。同時(shí)加強(qiáng)對(duì)基層黨組織書(shū)記干事創(chuàng)業(yè)的考核，將致富帶富能力當(dāng)做重要考核指標(biāo)。

根據(jù)曾傲瓊的方法并作適當(dāng)修改。固定酶濃度為2 U/mL，40 μL不同濃度樣品溶液中加入40 μL-淀粉酶混勻，于37 ℃孵育30 min，取出加入不同濃度可溶性淀粉40 μL，于37 ℃孵育10 min，加入160 μL DNS保溫5 min煮沸顯色，稀釋2 倍體積取200 μL于96 孔板，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。最大酶促反應(yīng)速度（）、米氏常數(shù)（）等動(dòng)力學(xué)參數(shù)可通過(guò)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖確定，即酶反應(yīng)速率（）的倒數(shù)1/與底物濃度（pNPG）的倒數(shù)1/[]的關(guān)系圖。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 MB-RS4、MB-RS4·Se（IV）表觀及結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 掃描電鏡分析

在相同放大倍數(shù)下，由圖1a、b可知，用檸檬酸處理淀粉后，酯化淀粉顆粒呈團(tuán)塊狀，表面有局部腐蝕、裂縫和小的重疊層，這些可能是由酯化反應(yīng)引起的，與高粱淀粉中用酸處理報(bào)道結(jié)果一致。在檸檬酸淀粉顆粒樣品中能夠看到環(huán)形顆粒狀，是因?yàn)樵谒崛芤褐蓄w粒腫脹，然后在淀粉芯有組織區(qū)域塌陷并可能與檸檬酸作用有關(guān)，導(dǎo)致顆粒形態(tài)改變。圖中框內(nèi)為由于檸檬酸作用淀粉顆粒之間的交聯(lián)處。而圖1c、d中MBRS4·Se（IV）淀粉顆粒完全塌陷并形成各種不規(guī)則形式碎片化，框內(nèi)淀粉顆粒破碎并且表面粗糙呈多孔的蜂窩狀，這與Gu Yangeng等研究一致，由于硒化反應(yīng)過(guò)程中HNO與亞硒酸鈉反應(yīng)生成HSeO，HSeO電離產(chǎn)生Se與MB-RS4發(fā)生反應(yīng)，改變了范德華力和分子間相互作用，造成顆粒破碎，分子質(zhì)量變小。

圖1 MB-RS4、MB-RS4·Se（IV）掃描電鏡圖Fig.1 SEM images of MB-RS4 and MB-RS4·Se (IV)

2.1.2 紫外光譜分析

如圖2所示，NaSeO在225 nm有一個(gè)強(qiáng)的特征吸收峰，通過(guò)檸檬酸處理綠豆淀粉得到MB-RS4，然后再對(duì)MB-RS4進(jìn)行硒化處理得到MB-RS4·Se（IV）。在紫外吸收光譜（190～400 nm）發(fā)生明顯改變，MB-RS4最大吸收峰所對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)為220 nm，最大吸光度為0.677，并在272 nm處產(chǎn)生肩峰，為酯化反應(yīng)產(chǎn)生的酯基發(fā)生電子躍遷造成。MB-RS4·Se（IV）紫外掃描最大吸收峰對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)=248 nm，最大吸光度為1.223，明顯不同于MB-RS4和NaSeO，但呈現(xiàn)相似峰形，Se與MB-RS4發(fā)生相互作用導(dǎo)致結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，Se核外有空軌道，可接受MB-RS4酯基的孤對(duì)電子形成配位鍵，影響C＝O的電子躍遷，同時(shí)Se的d軌道電子受到配位體的影響發(fā)生躍遷，導(dǎo)致紅移和增色效應(yīng)。

圖2 MB-RS4、MB-RS4·Se（IV）紫外光譜圖Fig.2 UV spectra of MB-RS4 and MB-RS4·Se (IV)

2.1.3 傅里葉變換紅外光譜分析

由圖3可知，在3 438.15 cm和2 932.45 cm處為O—H的伸縮振動(dòng)峰和亞甲基的C—H伸縮振動(dòng)峰，是典型的糖類(lèi)物質(zhì)的伸縮振動(dòng)峰。1 000～1 200 cm處為C—O—C和C—O—H的特征峰，說(shuō)明兩種樣品中有吡喃糖苷的存在。MB-RS4在1 745.23 cm和1 644.21 cm處分別為C＝O和—CO—的伸縮振動(dòng)特征峰，說(shuō)明MB-RS4中存在酯化糖醛酸，1 000～800 cm波數(shù)范圍內(nèi)的峰為樣品中的和-構(gòu)型。

圖3 MB-RS4、MB-RS4·Se（IV）紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of MB-RS4 and MB-RS4·Se (IV)

MB-RS4·Se（IV）在1 745.23 cm處特征峰發(fā)生紅移，說(shuō)明酯化糖醛酸參與了硒化反應(yīng)。1 000～800 cm波數(shù)范圍內(nèi)的峰在硒化后峰減少，說(shuō)明構(gòu)型發(fā)生了變化。MB-RS4·Se（IV）在787.88、730.88、654.75 cm處出現(xiàn)新振動(dòng)峰。787.88 cm處為Se＝O伸縮拉伸振動(dòng)峰，說(shuō)明反應(yīng)體系中亞硒酸與酯基發(fā)生取代反應(yīng)。730.88 cm為C—C(Se)伸縮振動(dòng)峰，是由于在反應(yīng)過(guò)程中糖環(huán)發(fā)生斷裂形成不飽和鍵，游離Se在C＝C上發(fā)生順式取代造成。654.75 cm為Se—O—C的伸縮振動(dòng)峰，是由于亞硒酸與C6上的羥基發(fā)生脫水反應(yīng)形成。

2.1.4 X射線衍射圖譜分析

李良玉、Kaur等研究發(fā)現(xiàn)綠豆淀粉X射線衍射圖呈現(xiàn)C型結(jié)晶尖峰特征，結(jié)晶度較高。從圖4可以看出，MB-RS4的結(jié)晶結(jié)構(gòu)被破壞，趨于一條彌散曲線，直觀看結(jié)晶度不高，2在18.38°左右，為V型結(jié)晶峰。說(shuō)明檸檬酸處理后的MB-RS4淀粉顆粒輕度破壞，仍然存在部分結(jié)晶區(qū)；但是在MB-RS4·Se（IV）的衍射圖中發(fā)現(xiàn)，MB-RS4·Se（IV）曲線呈現(xiàn)彌散狀態(tài)，結(jié)晶結(jié)構(gòu)被完全破壞，這與掃描電鏡結(jié)果一致。

圖4 MB-RS4、MB-RS4·Se（IV）X射線衍射圖Fig.4 X-ray diffraction patterns of MB-RS4 and MB-RS4·Se (IV)

2.1.5 分子質(zhì)量及分布

由圖5可以看出，MB-RS4中出現(xiàn)2 個(gè)組分峰，MBRS4·Se（IV）中只有1 個(gè)組分峰（17 min后為容器或溶劑中的小分子雜質(zhì)峰，故17 min后出現(xiàn)的峰不做分析）。在MB-RS4的圖譜中可以看出第1個(gè)峰出現(xiàn)的保留時(shí)間在7.643 min，峰面積占比48.49%，分子質(zhì)量為6.8×10Da；第2個(gè)峰出現(xiàn)的保留時(shí)間在16.403 min，峰面積占比33.74%，分子質(zhì)量為4.869×10Da。從圖5B可以看出，峰出現(xiàn)的保留時(shí)間在16.090 min，峰面積占比24.61%，分子質(zhì)量為8.012×10Da；由圖5可以看出，MB-RS4中6.8×10Da分子質(zhì)量占比較大，而MBRS4·Se（IV）則是以8.012×10Da分子質(zhì)量占比較大。Tan等利用凝膠色譜對(duì)綠豆淀粉分子質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果表示綠豆淀粉分子質(zhì)量的分布范圍在1.82×10Da和1.54×10Da之間。經(jīng)由檸檬酸處理的綠豆淀粉發(fā)生酯化和脫水反應(yīng)，將兩個(gè)或兩個(gè)以上的淀粉分子聚合，呈現(xiàn)穩(wěn)定的多維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，聚合后形成大分子的MB-RS4，分子質(zhì)量顯著增加。而在硒化過(guò)程中由于添加的硝酸和生成的亞硒酸又作用于MB-RS4，使MB-RS4分子鏈發(fā)生斷裂，導(dǎo)致硒化后分子質(zhì)量顯著降低。

圖5 MB-RS4（A）、MB-RS4·Se（IV）（B）凝膠滲透色譜圖Fig.5 Gel permeation chromatograms of MB-RS4 (B) and MB-RS4·Se (IV) (B)

由圖6 可以看出，M B-RS4 中存在獨(dú)立的兩個(gè)組分，分子質(zhì)量分別在3.91×10～1.26×10Da和3.62×10～0.29×10Da的范圍內(nèi)。大分子質(zhì)量段先出峰，小分子質(zhì)量段后出峰，其中大分子質(zhì)量物質(zhì)在兩種組分中占比較大，且呈現(xiàn)正態(tài)分布，而小分子質(zhì)量組分則呈現(xiàn)偏正態(tài)分布；MB-RS4·Se（IV）中只存在一個(gè)組分，分子質(zhì)量分布在9.04×10～0.2×10Da范圍內(nèi)，為小分子質(zhì)量組分，硒化后的小分子質(zhì)量段呈現(xiàn)正態(tài)分布，分布較均勻。MB-RS4中存在大量的酯化、交聯(lián)后形成的大分子物質(zhì)，所以MB-RS4中大分子質(zhì)量段所占比例較大。而在MB-RS4·Se（IV）中由于發(fā)生了硒化反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程中酯基和糖苷鍵的斷裂導(dǎo)致大分子質(zhì)量組分轉(zhuǎn)化為小分子質(zhì)量組分，致使小分子質(zhì)量段比例增加。

圖6 MB-RS4與MB-RS4·Se（IV）相對(duì)分子質(zhì)量分析圖Fig.6 Relative molecular mass analysis of MB-RS4 and MB-RS4·Se (IV)

從表3 可以看出，MB-RS4 的數(shù)均分子質(zhì)量m=2.26×10Da，重均分子質(zhì)量m=1.88×10Da，分散系數(shù)為8.3×10；MB-RS4·Se（IV）的m=1.3×10Da，m=1.20×10Da，分散系數(shù)為9.22。由以上可以看出，MB-RS4的分散系數(shù)較大，分子質(zhì)量分布范圍較廣，而硒化改性后分散系數(shù)顯著降低，說(shuō)明改性后體系更加均一，組成更簡(jiǎn)單。

表3 MB-RS4與MB-RS4·Se（IV）相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果Table 3 Relative molecular mass of MB-RS4 and MB-RS4·Se (IV)

2.1.6 NMR分析

MB-RS4·Se（IV）、MB-RS4 1H-NMR譜圖見(jiàn)圖7。圖8中顯示化學(xué)位移出現(xiàn)在4.98和1.35，一般情況下，化學(xué)位移大于5.00表現(xiàn)為糖類(lèi)化合物的構(gòu)型，化學(xué)位移小于5.00表現(xiàn)為糖類(lèi)化合物的-構(gòu)型。MB-RS4的異頭氫化學(xué)位移出現(xiàn)在4.98，說(shuō)明MB-RS4為-構(gòu)型。C譜中，MB-RS4位于61.45處的信號(hào)峰歸屬于糖環(huán)中的C6信號(hào)峰，72.66處的信號(hào)峰歸屬于C2、C3，位于82.09處信號(hào)峰屬于C4的信號(hào)峰，C4的強(qiáng)度與V型結(jié)構(gòu)相關(guān)。MB-RS4中82.09中峰強(qiáng)度較大，說(shuō)明MB-RS4主要以V型晶譜存在。同時(shí)，MB-RS4中102.00處出現(xiàn)一個(gè)單峰，可能來(lái)自相同范圍信號(hào)強(qiáng)度的V型復(fù)合物的信號(hào)峰，這些現(xiàn)象共同驗(yàn)證了MB-RS4的X射線衍射圖譜中18.38°處的峰為V型結(jié)晶峰。173.65處信號(hào)峰為MBRS4中檸檬酸酐與淀粉共振的碳酯峰。

圖7 MB-RS4·Se（IV）、MB-RS4 1H-NMR譜圖Fig.7 1H-NMR spectra of MB-RS4·Se (IV) and MB-RS4

圖8 MB-RS4·Se（IV）、MB-RS4 13C-NMR譜圖Fig.8 13C-NMR spectra of MB-RS4·Se (IV) and MB-RS4

硒化改性后NMR氫譜中MB-RS4·Se（IV）的異頭氫化學(xué)位移出現(xiàn)在5.01，硒化后化學(xué)位移大于5.00，說(shuō)明硒化導(dǎo)致構(gòu)型轉(zhuǎn)變?yōu)闃?gòu)型。C譜中，180.59處為糖醛酸的典型信號(hào)峰。位于102.00處C1峰發(fā)生裂分出現(xiàn)104.24信號(hào)峰，可能是由于糖環(huán)在C1處由于Se的取代造成裂分并出現(xiàn)-異位形式的典型信號(hào)峰，硒化過(guò)程中1-4糖苷鍵斷裂可能是造成糖環(huán)上C1羥基發(fā)生翻轉(zhuǎn)造成構(gòu)型改變的主要原因，位于82.09處C4的信號(hào)峰消失也驗(yàn)證了MB-RS4·Se（IV）中1,4-糖苷鍵發(fā)生斷裂，1,4-糖苷鍵斷裂后造成V型結(jié)晶區(qū)消失。NMR氫譜和碳譜中均表現(xiàn)出構(gòu)型翻轉(zhuǎn)與V型結(jié)晶區(qū)消失現(xiàn)象與紅外譜圖和X射線衍射圖譜一致。位于MB-RS4·Se（IV）中C2/C3化學(xué)位移未發(fā)生較大改變和裂分，說(shuō)明反應(yīng)未發(fā)生在糖環(huán)的C2和C3。MB-RS4·Se（IV）中C6信號(hào)峰位移至70.93處，說(shuō)明在C6位處發(fā)生了取代反應(yīng)，直接驗(yàn)證了紅外光譜中亞硒酸與C6上的羥基反應(yīng)生成Se—O—C，Yuan Bo、Lee等研究發(fā)現(xiàn)，硒化多糖位于62.93和62.41的C6均發(fā)生了硒化取代，與本研究結(jié)果一致。

2.2 MB-RS4、MB-RS4·Se（IV）體外酶活抑制及動(dòng)力學(xué)分析

2.2.1 對(duì)-葡萄糖苷酶和-淀粉酶抑制作用

-淀粉酶抑制劑和-葡萄糖苷酶抑制劑可以有效降低小腸內(nèi)葡萄糖或果糖釋放速率，從而延緩餐后血糖快速升高。圖9為MB-RS4、MB-RS4·Se（IV）對(duì)-葡萄糖苷酶和-淀粉酶的抑制作用曲線，以阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照。MB-RS4對(duì)-葡萄糖苷酶抑制作用隨質(zhì)量濃度增加呈現(xiàn)負(fù)抑制率，不表現(xiàn)抑制作用。但對(duì)-淀粉酶具有顯著的抑制活性，低于MB-RS4·Se（IV）和陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖。其中MB-RS4和MB-RS4·Se（IV）的IC值分別為4.992 mg/mL和2.684 mg/mL。隨著質(zhì)量濃度升高，MBRS4·Se（IV）對(duì)-葡萄糖苷酶和-淀粉酶抑制作用升高后穩(wěn)定，且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)。硒化后的MB-RS4在同等濃度下對(duì)-葡萄糖苷酶表現(xiàn)顯著抑制活性。以上數(shù)據(jù)表明，硒化改性使得對(duì)-葡萄糖苷酶無(wú)抑制作用的MB-RS4具有-葡萄糖苷酶抑制作用，同時(shí)MB-RS4·Se（IV）對(duì)-淀粉酶的抑制作用明顯高于MB-RS4。MB-RS4·Se（IV）對(duì)-葡萄糖苷酶表現(xiàn)為抑制作用可能由于MB-RS4·Se（IV）中硒元素的引入。MB-RS4·Se（IV）對(duì)-淀粉酶抑制作用升高可能與MB-RS4·Se（IV）分子質(zhì)量的降低有關(guān)，分子質(zhì)量降低利于與酶的活性位點(diǎn)結(jié)合，導(dǎo)致抑制作用升高，這與MB-RS4·Se（IV）分子質(zhì)量降低吻合。因此，需要通過(guò)抑制動(dòng)力學(xué)分析研究其對(duì)-葡萄糖苷酶和-淀粉酶的抑制類(lèi)型。

圖9 MB-RS4、MB-RS4·Se（IV）對(duì)α-葡萄糖苷酶（a）和α-淀粉酶（b）的抑制作用Fig.9 Inhibitory effect of MB-RS4 and MB-RS4·Se (IV) on α-glucosidase (a) and α-amylase (b)

2.2.2 對(duì)-葡萄糖苷酶和-淀粉酶抑制動(dòng)力學(xué)分析

根據(jù)Lineweaver-Burk曲線分析MB-RS4和MBRS4·Se（IV）對(duì)-葡萄糖苷酶和-淀粉酶的抑制類(lèi)型。從圖10a中MB-RS4·Se（IV）對(duì)-葡萄糖苷酶的酶促反應(yīng)速率與不同質(zhì)量濃度底物的雙倒數(shù)圖可知，隨著MBRS4·Se（IV）質(zhì)量濃度的增加，逐漸增大，逐漸減小，各質(zhì)量濃度MB-RS4·Se（IV）的酶促反應(yīng)速率擬合直線相交于第2象限。以上現(xiàn)象說(shuō)明MB-RS4·Se（IV）對(duì)-葡萄糖苷酶為競(jìng)爭(zhēng)抑制，MB-RS4·Se（IV）既可以通過(guò)與游離的-葡萄糖苷酶結(jié)合，也可通過(guò)與酶-底物復(fù)合物結(jié)合影響酶促反應(yīng)的進(jìn)行。圖10b、c為MB-RS4和MB-RS4·Se（IV）對(duì)-淀粉酶的速率與底物質(zhì)量濃度的雙倒數(shù)圖，隨著MB-RS4和MBRS4·Se（IV）濃度的增加，逐漸減小，也隨之減小，各濃度MB-RS4和MB-RS4·Se（IV）的酶促反應(yīng)速率擬合直線相交于第3象限。說(shuō)明MB-RS4和MB-RS4·Se（IV）對(duì)-淀粉酶為混合型反競(jìng)爭(zhēng)性抑制，MB-RS4和MB-RS4·Se（IV）只能通過(guò)與酶-底物復(fù)合物的結(jié)合抑制酶促反應(yīng)。

圖10 MB-RS4·Se（IV）抑制α-葡萄糖苷酶（a）、MB-RS4抑制α-淀粉酶（b）、MB-RS4·Se（IV）抑制α-淀粉酶（c）的Lineweaver-Burk曲線圖Fig.10 Lineweaver-Burk plots for α-glucosidase inhibition by MB-RS4·Se(IV) (a),and α-amylase inhibition by MB-RS4 (b) and MB-RS4·Se (IV) (c)

通過(guò)對(duì)比上圖截距所反映的隨樣品質(zhì)量濃度增加程度與抑制曲線發(fā)現(xiàn)，各質(zhì)量濃度間截距的增長(zhǎng)幅度與抑制曲線增長(zhǎng)趨勢(shì)基本吻合。同時(shí)由擬合的斜率與截距和各質(zhì)量濃度MB-RS4、MB-RS4·Se（IV）的線性相關(guān)圖發(fā)現(xiàn)其具有良好的線性關(guān)系，以上現(xiàn)象說(shuō)明，MB-RS4和MB-RS4·Se（IV）結(jié)合在-葡萄糖苷酶、-淀粉酶和酶-底物復(fù)合物的單一抑制位點(diǎn)或單一類(lèi)型的抑制位點(diǎn)上。

3 結(jié)論

對(duì)MB-RS4·Se（IV）結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征及并研究其酶活抑制動(dòng)力學(xué)，實(shí)驗(yàn)表明：MB-RS4·Se（IV）呈碎片化，表面粗糙，顆粒變小，出現(xiàn)Se＝O、C—C(Se)、Se—O—C等官能團(tuán)，紫外特征峰出現(xiàn)紅移和增色效應(yīng)，結(jié)晶結(jié)構(gòu)完全消失，相對(duì)分子質(zhì)量大幅度減小，NMR顯示MBRS4·Se（IV）構(gòu)型翻轉(zhuǎn)并在C6上發(fā)生了取代反應(yīng)。MB-RS4·Se（IV）對(duì)-葡萄糖苷酶表現(xiàn)抑制作用，對(duì)-淀粉酶抑制作用顯著增加。通過(guò)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)分析得到MB-RS4·Se（IV）對(duì)-葡萄糖苷酶的抑制類(lèi)型為競(jìng)爭(zhēng)性抑制，對(duì)-淀粉酶的抑制類(lèi)型為混合型反競(jìng)爭(zhēng)性抑制。MB-RS4·Se（IV）可添加在降糖藥物和功能性食品中，為減緩血糖升高協(xié)同微量元素強(qiáng)化提供新方向。