馬衛(wèi)紅， 龔才偉， 陳啟青， 楊志艷， 羅德彪， 劉永懷， 彭慶波， 趙福瓊*

(1. 惠水縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州惠水550600； 2. 黔南州養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中心，貴州都勻558000)

大腸桿菌(又稱(chēng)大腸埃希氏菌)是1種典型的革蘭氏陰性桿菌[1]。該菌一般分為致病性和非致病性(或條件致病性)，在環(huán)境中廣泛存在，常作為環(huán)境、食品、飲水污染的指標(biāo)細(xì)菌[2，3]。多年來(lái)，抗菌藥物在畜禽養(yǎng)殖中普遍使用，存在使用不規(guī)范、不合理甚至濫用的現(xiàn)象[4]。一方面促使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，從而加大抗菌藥的使用量，對(duì)生活環(huán)境造成嚴(yán)重污染；另一方面，動(dòng)物產(chǎn)品中抗菌藥物殘留，對(duì)公共衛(wèi)生安全帶來(lái)嚴(yán)重隱患[5]。筆者通過(guò)對(duì)貴州省惠水縣雞場(chǎng)及獸藥店抗菌藥物的使用和銷(xiāo)售情況進(jìn)行調(diào)研，根據(jù)調(diào)研結(jié)果選擇部分常用的抗菌藥物進(jìn)行大腸桿菌耐藥情況檢測(cè)，為雞場(chǎng)規(guī)范合理使用抗菌藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源2021年5—12月，從全縣11個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)(街道)的16個(gè)雞場(chǎng)隨機(jī)無(wú)菌采集雞口咽和泄殖腔雙棉拭子，每場(chǎng)5份，共80份，24 h內(nèi)進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定。

1.2 主要試劑麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、抗生素藥敏紙片(均購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司)；Hifiscript cDNA Synthesis Kit(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)、核酸提取試劑盒(西安天隆科技有限公司)、Gold ViewⅠ型核酸染色劑(北京索萊寶科技有限公司)、瓊脂糖(蘭杰柯有限公司)。

1.3 主要儀器電子天平(型號(hào)：JA2003，上海上平儀器公司)、相稱(chēng)顯微鏡(型號(hào)：ZYX300E，上海兆儀光電科技有限公司)、恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)：PR-BYX9082，上海普瑞賽斯儀器有限公司)、PCR儀(型號(hào)：StepOnePlus，賽默飛世爾科技公司)、全自動(dòng)核酸提取儀(型號(hào)：NP968-C，西安天隆科技有限公司)、雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀(型號(hào)：DYY-6C，北京六一生物科技有限公司)、藍(lán)光切膠儀(型號(hào)：BL-18，蘭杰柯有限公司)。

1.4 細(xì)菌分離培養(yǎng)將采集的雞口咽和泄殖腔雙棉拭子樣品分別浸入無(wú)菌生理鹽水1 mL，洗脫液采用平板劃線(xiàn)法接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀(guān)察菌落生長(zhǎng)情況。挑取典型菌落(粉紅色、圓形、光滑)進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀(guān)察細(xì)菌形態(tài)。將典型菌落采用平板劃線(xiàn)法分別接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀(guān)察菌落形態(tài)。再?gòu)柠溈祫P瓊脂培養(yǎng)基上將典型菌落接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃純化培養(yǎng)24 h。

1.5 細(xì)菌PCR鑒定參考相關(guān)文獻(xiàn)[6]，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成細(xì)菌16S rDNA通用引物。27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(Tm：54.2 ℃)；1492R：5’-GGTTAACCTTACGACTT-3’(Tm：48.6 ℃)；預(yù)擴(kuò)增片段約1 400 bp。以各分離菌純培養(yǎng)物為模板進(jìn)行PCR鑒定。反應(yīng)體系50 μL：Mix 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，DNA模板5 μL，無(wú)菌水補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性50 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共31個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。 擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的大腸桿菌基因序列進(jìn)行同源性(BLAST)比對(duì)。

1.6 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)按照《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的技術(shù)要求》(WS/T 639—2018)，將純化培養(yǎng)的單個(gè)菌落接種于1.5 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，用滅菌棉簽蘸取菌液均勻涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，待培養(yǎng)基表面水分吸干后，用眼科鑷取8種藥敏紙片緊貼于培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，測(cè)量抑菌圈直徑。判定敏感(S)、中敏(I)、耐藥(R)情況(見(jiàn)表1)。

表1 大腸桿菌耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 分離細(xì)菌特征麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)菌落為粉紅色、圓形、濕潤(rùn)、表面光滑、半透明、邊緣整齊(見(jiàn)圖1)；伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)菌落為紫黑色、有金屬光澤(見(jiàn)圖2)；普通瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)菌落為白色、圓形(見(jiàn)圖3)。挑取典型菌落，經(jīng)革蘭氏染色，油鏡(×1 000)下觀(guān)察為革蘭氏陰性、兩端鈍圓的小桿菌(見(jiàn)圖4)。

圖1 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基菌落 圖2 伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基菌落 圖3 普通瓊脂培養(yǎng)基菌落

圖4 菌體形態(tài)(×1 000)

2.2 細(xì)菌PCR鑒定結(jié)果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約1 400 bp，經(jīng)測(cè)序?yàn)? 446 bp，與預(yù)期片段基本相符(見(jiàn)圖5)?；蛐蛄蠦LAST比對(duì)，分離菌與大腸桿菌的同源性為99.58%，鑒定為大腸桿菌。

2.3 細(xì)菌耐藥情況從16個(gè)雞場(chǎng)共分離到66株大腸桿菌，對(duì)阿莫西林耐藥率最高，其次分別為復(fù)方新諾明、氨芐西林、奧格門(mén)汀，且耐藥雞場(chǎng)數(shù)較多；對(duì)鏈霉素、慶大霉素、頭孢克洛、多西環(huán)素耐藥率相對(duì)較低，耐藥雞場(chǎng)數(shù)也較少。其中多個(gè)雞場(chǎng)出現(xiàn)多重耐藥情況(見(jiàn)表2、表3)。

M：DL 2 000 DNA Marker； 1～7：分離菌株(部分)； -：陰性對(duì)照?qǐng)D5 分離菌16S rDNA PCR擴(kuò)增

表2 大腸桿菌耐藥情況

表3 各雞場(chǎng)耐藥情況

3 結(jié)論

本次從惠水縣16個(gè)雞場(chǎng)分離的66株大腸桿菌耐藥較普遍，對(duì)阿莫西林、復(fù)方新諾明、氨芐西林、奧格門(mén)汀耐藥率較高，對(duì)鏈霉素、慶大霉素、頭孢克洛、多西環(huán)素耐藥率較低，多個(gè)雞場(chǎng)存在多重耐藥現(xiàn)象。

4 討論

近年來(lái)，抗菌藥物濫用導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥已引起我國(guó)及國(guó)際社會(huì)的廣泛關(guān)注[7]。據(jù)報(bào)道，我國(guó)2013年抗生素總使用量達(dá)到10萬(wàn)t，其中獸用抗生素占總量的52%[8]。抗生素在畜牧、水產(chǎn)等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用，然而濫用或不規(guī)范使用容易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥[9]，同時(shí)也對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染。本試驗(yàn)從惠水縣雞場(chǎng)分離的66株大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)的阿莫西林、氨芐西林，以及奧格門(mén)汀(阿莫西林與克拉維酸復(fù)合制劑)、磺胺類(lèi)的復(fù)方新諾明耐藥率較高。與全國(guó)耐藥細(xì)菌監(jiān)測(cè)網(wǎng)2014—2019年細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)報(bào)告相比[10]，惠水縣分離菌株對(duì)氨芐西林的耐藥率(81.82%)比全國(guó)2019年(83.06%)略低，慶大霉素的耐藥率(36.36%)比全國(guó)2019年(37.3%)略低。檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明惠水縣雞場(chǎng)大腸桿菌的耐藥較普遍，但各個(gè)雞場(chǎng)耐藥情況差異較大，可能與不同的飼養(yǎng)管理有關(guān)。養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果科學(xué)選擇抗菌藥物種類(lèi)，嚴(yán)格控制用量，科學(xué)制定給藥方案，避免在養(yǎng)殖過(guò)程中盲目濫用抗菌藥。