李紅葉，郭月萍

急性腦梗死是臨床上常見的腦血管疾病，顱內動脈血栓形成或血栓栓塞引起腦組織缺血缺氧損傷是造成神經功能損害的直接原因，疾病的致殘率較高、救治難度大。盡管近些年溶栓、介入等再灌注治療手段發(fā)展迅速、急性腦梗死的治療效果明顯提高，但仍有部分患者無法獲得良好的預后、遺留不同程度的神經功能缺損并影響日常生活[1]。目前的研究[2-4]認為，與急性腦梗死患者神經功能損害相關的環(huán)節(jié)包括炎癥反應、氧化應激、內質網(wǎng)應激、細胞凋亡及自噬等。尋找參與上述環(huán)節(jié)的關鍵分子不僅有助于闡明急性腦梗死后神經損傷的分子機制，也有助于發(fā)現(xiàn)評估急性腦梗死病情及預后的分子指標。

微小RNA(miR)是近年來表觀遺傳學研究的熱點，能夠在轉錄后水平調控多種基因表達并參與炎癥、氧化應激、凋亡等環(huán)節(jié)的調控。孫瑛等[5]的研究表明，大鼠缺血再灌的腦組織中miR-221表達減少，尾靜脈注射miR-221激動劑能夠減輕腦缺血再灌注損傷并抑制炎癥反應、細胞凋亡，表明miR-221可能在急性腦梗死的發(fā)生發(fā)展過程中起保護作用?；诖?，本研究將外周血miR-221表達用于急性腦梗死患者的病情評估，具體分析了外周血miR-221與急性腦梗死病情嚴重程度的相關性及對90 d預后的預測價值。

1 對象與方法

1.1 對象 選擇2017年5月至2019年5月我院收治的108例急性腦梗死患者作為腦梗死組，入組標準：(1)符合急性腦梗死的診斷標準[6]；(2)發(fā)病時間≤72 h；(3)臨床資料及隨訪資料完整。排除標準：(1)合并腦出血；(2)既往有腦梗死、腦出血、腦外傷病史；(3)合并惡性腫瘤、自身免疫性疾病。另取同期體檢的120名健康者作為對照組。腦梗死組中男性67例，女性41例；年齡41～64歲，平均(52.18±10.24)歲；對照組中男性70人，女性50人；年齡40～60歲，平均(50.19±11.75)歲。兩組間一般資料的比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 外周血miR-221表達的檢測 采用北京博凌科為公司的試劑盒進行檢測。腦梗死組患者入院后采集外周靜脈血3 ml，對照組受試者體檢時采用外周靜脈血3 ml。采用全血miR提取試劑盒分離外周血中的miR。采用miRNA反轉錄試劑盒將外周血中的miR反轉錄為cDNA。采用miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒配置反應體系如下：cDNA樣本1 μl、qPCR Mix 10 μl、10 μmol/L上下游引物各0.4 μl、去離子水補足至20 μl；在熒光定量PCR儀上按照二步法進行反應：94 ℃預變性2～3 min，94 ℃ 15 s、60 ℃ 40 s重復40個循環(huán)，生成循環(huán)曲線及循環(huán)閾值(Ct)，根據(jù)Ct值、以U6為內參，計算miR-221的表達水平。

1.2.2 腦梗死病情嚴重程度的評價 根據(jù)入院時NIHSS評分評價神經缺損程度，NIHSS評分0～15分為輕中度、≥16分為重度；根據(jù)入院后影像學檢查所見梗死灶直徑評價腦梗死面積，直徑>4 cm為大面積梗死、≤4 cm為中小面積梗死。

1.2.3 90 d預后的評價 腦梗死組患者出院后90 d時進行門診復診，根據(jù)mRS評分評價患者的預后，mRS≤2分為預后良好、mRS>2分為預后不良。

1.2.4 預后相關因素的收集 根據(jù)腦梗死組患者的病歷資料，收集以下信息：性別、年齡、高血壓病、冠心病、糖尿病、心房顫動(房顫)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)、隨機血糖、同型半胱氨酸(Hcy)、超敏C反應蛋白(hs-CRP)、發(fā)病到入院時間、腦梗死直徑。TC、LDLC、HDLC、隨機血糖、Hcy、hs-CRP采用全自動生化分析儀測定，腦梗死直徑根據(jù)影像學檢查結果進行測量，其他資料根據(jù)病史進行判斷。

2 結 果

2.1 腦梗死組與對照組外周血miR-221表達水平的比較 見表1。腦梗死組患者外周血miR-221的表達水平明顯低于對照組(P<0.05)。

表1 腦梗死組與對照組外周血miR-221表達水平的比較

2.2 腦梗死組中不同病情嚴重程度患者外周血miR-221表達水平的比較 見表2、圖1。與腦梗死組中輕中度神經功能缺損患者比較，重度神經功能缺損患者外周血miR-221的表達水平明顯降低(P<0.05)；與腦梗死組中中小面積梗死患者比較，大面積梗死患者外周血miR-221的表達水平明顯降低(P<0.05)。經Pearson檢驗，腦梗死組患者外周血miR-221的表達水平與NIHSS評分及梗死面積具有負相關關系，相關系數(shù)分別為-0.700和-0.718(均P<0.001)。

圖1 腦梗死組患者外周血miR-221的表達水平與NIHSS評分及梗死面積的相關性

表2 腦梗死組中不同病情嚴重程度患者外周血miR-221表達水平的比較

2.3 腦梗死組中預后良好患者與預后不良患者外周血miR-221表達水平及臨床特征的比較 見表3。根據(jù)90 d mRS評分，腦梗死組108例患者中共46例預后不良，發(fā)生率為42.59%。腦梗死組中預后良好患者與預后不良患者比較，性別、年齡、高血壓病、冠心病、糖尿病、房顫、腦梗死直徑、TC、LDLC、HDLC、隨機血糖差異無統(tǒng)計學意義。與腦梗死組中預后良好患者比較，預后不良患者外周血miR-221的表達水平明顯降低，入院時NIHSS評分、Hcy水平、hs-CRP水平明顯升高，發(fā)病到入院時間明顯延長，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

表3 腦梗死組中預后良好患者與預后不良患者miR-221及臨床特征的比較[例(%)，±s]

表3 腦梗死組中預后良好患者與預后不良患者miR-221及臨床特征的比較[例(%)，±s]

因素預后良好患者(n=62)預后不良患者(n=46)χ2/t值P值男性36(58.06)31(67.39)0.9750.323年齡(歲)51.39±10.0953.25±11.030.9100.365高血壓病30(48.39)26(56.52)0.7000.403冠心病2(3.23)3(6.52)0.6500.420糖尿病15(24.19)14(30.43)0.6320.427房顫4(6.45)5(10.87)0.6750.411發(fā)病到入院時間(h)24.24±6.5132.19±7.855.746<0.001入院時NIHSS評分(分)4.77±0.938.18±1.8312.648<0.001腦梗死直徑(cm)3.73±0.894.21±0.942.7060.008TC(mmol/L)4.39±0.924.67±1.041.4790.142LDLC(mmol/L)3.09±0.623.24±0.821.0830.281HDLC(mmol/L)1.15±0.311.04±0.371.6780.096隨機血糖(mmol/L)7.14±1.218.03±1.553.3510.001Hcy(μmol/L)11.48±2.9516.05±3.417.447<0.001hs-CRP(mg/L)6.11±1.748.29±1.816.329<0.001miR-2210.75±0.250.51±0.175.616<0.001

2.4 腦梗死組患者預后不良影響因素的Logistics回歸分析 見表4。以腦梗死組患者預后為應變量，以單因素分析有統(tǒng)計學差異的miR-221、入院時NIHSS評分、腦梗死直徑、隨機血糖、Hcy、hs-CRP、發(fā)病到入院時間作為自變量進行Logistics回歸分析顯示，miR-221、入院時NIHSS評分、腦梗死直徑、Hcy是腦梗死組患者預后不良的影響因素(均P<0.05)。

表4 腦梗死組患者預后不良影響因素的logistics回歸分析

2.5 外周血miR-221預測腦梗死組患者預后不良的ROC曲線分析 見圖2。繪制外周血miR-221預測腦梗死組患者預后不良的ROC曲線，曲線下面積為0.7923(P<0.0001)。根據(jù)約登指數(shù)最大值確定miR-221預測腦梗死組患者預后不良的最佳截點為0.60，該最佳截點預測預后不良的靈敏度和特異性分別為67.74%和71.74%。

圖2 外周血miR-221預測腦梗死組患者預后不良的ROC曲線

3 討 論

miR-221是具有心腦血管保護作用的miR，國內孫瑛等[5]的實驗研究已經證實miR-221在大鼠缺血再灌的腦組織中表達減少，使用miR-221激動劑能夠減輕腦缺血再灌注損傷；Peng等[7]的研究證實缺血性腦卒中患者外周血miR-221的表達減少，并且在離體培養(yǎng)的內皮細胞中、miR-221能夠增強內皮功能；Zhou等[8]的研究證實miR-221能夠減輕心肌梗死大鼠的心肌損傷及重構。本研究對急性腦梗死患者外周血miR-221表達的分析結果與Peng等[7]的研究一致，即腦梗死組外周血miR-221的表達水平明顯降低。結合miR-221在腦梗死及心肌梗死中的保護作用，本研究進一步分析了miR-221表達與腦梗死病情的關系，通過神經功能缺損程度及腦梗死面積判斷病情嚴重程度并分析miR-221的差異可知，重度神經功能缺損、大面積梗死患者外周血miR-221的表達水平明顯降低，表明miR-221表達越低、急性腦梗死患者的神經缺損越重且腦梗死面積越大，與miR-221在動物及細胞實驗中介導的心腦血管保護作用吻合。心肌梗死相關的臨床研究[9]表明，miR-221對心肌梗死患者的預后具有預測價值，而miR-221與腦梗死預后的關系尚不明確。根據(jù)目前的基礎研究，miR-221的生物學作用包括抗炎、抗氧化、抗凋亡等。急性腦梗死的相關研究[10-12]表明，炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡是與神經功能損害密切相關的因素，神經功能損害的加劇會影響遠期預后、使致殘率增加。國內多項關于急性腦梗死患者預后的研究均以出院后90 d作為評估預后的時間點，有研究[13-15]結果顯示，急性腦梗死患者90 d預后不良的發(fā)生率分別為36.48%、51.43%、41.41%。本研究也對急性腦梗死患者的90 d預后進行了評價，108例患者中共46例為預后不良，發(fā)生率為42.59%，與上述研究結果相似。進一步比較預后良好與預后不良患者入院時miR-221表達的差異可知，預后不良患者外周血中miR-221的表達水平明顯低于預后良好患者，表明miR-221表達降低不僅與急性腦梗死的發(fā)生及病情的加重有關，還可能是造成90 d預后不良的因素之一。急性腦梗死患者的預后受到多因素、多環(huán)節(jié)的影響，miR-221表達減少可能通過調控炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡來影響預后，同時其他因素也可能影響預后。國內外多項關于急性腦梗死預后影響因素的研究[13-17]發(fā)現(xiàn)，入院時NIHSS評分增加、大面積腦梗死、中性粒細胞與淋巴細胞比值(NLR)增加、高Hcy血癥是急性腦梗死預后不良的獨立危險因素。本研究采用單因素分析及Logistic回歸分析的方法對急性腦梗死預后不良的影響因素進行了探究，同時對急性腦梗死患者的臨床特征及miR-221的表達水平進行了分析，結果顯示，miR-221、入院時NIHSS評分、腦梗死直徑、Hcy是腦梗死組患者預后不良的影響因素，入院時NIHSS評分、腦梗死直徑、Hcy與預后不良相關的結果與既往國內外學者的研究吻合，miR-221與預后不良相關的結果與miR-221介導的心腦血管保護作用吻合。最后，本研究還通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)入院時miR-221表達對預后不良具有預測價值，預測的最佳截點為0.60。

綜上所述，外周血miR-221表達減少與急性腦梗死病情加重、90 d預后不良有關，miR-221表達對90 d預后具有預測價值，未來miR-221有望成為評價急性腦梗死病情及預后的標志分子，也有望作為急性腦梗死新的治療靶點。