馬強 羅莉?qū)?肖蕾 曹振卿 馬振華 馬兵奇

（1.甘肅省家畜繁育改良管理站，甘肅蘭州 733000；2.甘肅省動物疫病預防控制中心，甘肅蘭州 730046；3.蘭州生物制品研究所有限責任公司，甘肅蘭州 730046）

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一種急性接觸性傳染病[1]。全世界均有分布，宿主范圍廣，主要以偶蹄動物的口、鼻、蹄及乳頭等部位發(fā)生水皰、潰瘍、爛斑等為特征。該病毒血清型較多，危害巨大，可快速傳播，致病性和感染性極強，感染發(fā)病率可達100%，可導致病畜生產(chǎn)能力下降，對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。威脅國內(nèi)的主要是O 型、A型、亞洲I 型，為法定上報的一類動物疾病[2-5]?？谔阋叻揽刂饕揽孔⑸湟呙纾碳ば篌w產(chǎn)生抗體，從而抵抗口蹄疫病毒的侵襲。但實際免疫中，很多疫苗無法起到保護作用，尤其是免疫后期家畜更容易發(fā)病，病毒傳染性也更強，給養(yǎng)殖戶造成巨大損失。市面上二價、三價口蹄疫疫苗層出不群，免疫保護期各不相同。其中三價苗相傳具有副作用小、免疫保護期長等優(yōu)點，但由于三價苗抗原純化工藝復雜，免疫程序制定不合理，多次免疫純化的滅活疫苗會對機體免疫應(yīng)答造成一定的干擾，養(yǎng)殖戶對三價苗免疫效果評價褒貶不一。本試驗選擇市面銷量較廣的金宇保靈生物藥品有限公司三價滅活疫苗對各個發(fā)育階段的牛免疫注射，定期檢測免疫抗體水平，通過免疫抗體陽性率評判三價苗免疫效果與免疫保護期，改進免疫程序，不僅具有重大臨床價值，而且能為制定牛口蹄疫疫苗相關(guān)免疫技術(shù)標準提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 牛群檢測樣本

2020—2022 年實驗組抽取30 個甘肅地區(qū)萬頭以上牛場進行疫苗注射接種（A 型-O 型-亞I 口蹄疫O型、亞洲I 型、A 型三價滅活疫苗購自金宇保靈生物藥品有限公司），注射時間在疫苗有效期內(nèi)。在每個場隨機選取6 月齡內(nèi)犢牛30 頭（公母各15 頭），育成公牛30 頭、空懷母牛30 頭、頭胎妊娠母牛30 頭、哺乳母牛（指二胎及二胎以上帶犢母牛）30 頭。

1.1.2 試劑盒

購自蘭州中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，改進型口蹄疫A 型、O 型、亞I 抗體體液相阻斷檢測試劑盒（LB-ELISA）各50 盒。

1.1.3 試驗儀器

96 孔ELISA 板、U 型96 孔抗原抗體反應(yīng)板、封板膜、移液槍、洗板機、恒溫箱、離心機、酶標儀等均由甘肅省佳源畜牧生物有限公司實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 接種疫苗并提取血清

所有牛注射疫苗前采血檢測抗體效價，同一時間注射疫苗，注射后分別在第1、2、4、6 月采血分離血清（4500r/min 離心5min），并送至實驗室檢測抗體。

1.2.2 樣品的準備

樣品血清稀釋20 倍后加樣，每次取樣后更換槍頭，準確記錄板上每孔樣品的位置，樣品混合均勻后添加到包被板上。

1.2.3 檢測步驟

（1）排板：取出包被板，每塊板可檢測樣品92份，設(shè)陽性對照4 孔、陰性對照2 孔。

（2）加樣：樣品孔每孔加入50μL 稀釋后的樣品，陰陽對照孔每孔加入50μL 陰陽對照，再向以上各孔中加入50μL 酶結(jié)合物，振蕩混勻；37℃條件下溫育30min。

（3）洗滌：撕去封板膜，將包被板子置于洗板機上，設(shè)置洗板程序洗滌5 次。洗滌完畢后取下包被板，拍干殘留水分。

（6）顯色：兩種顯色液等比混勻后各孔加100μL，放入37℃恒溫箱避光溫育15min。

（7）終止：各孔加50μL 終止液停止反應(yīng)。

（8）讀數(shù)：酶標儀450nm 讀取OD 值。

（9）判定：病毒抗原OD 值＞1，且抗體效價1024±1，陰性效價＜1∶8 判定試驗有效；取陽性對照孔中間兩孔OD 值除以4 為臨界值，樣品孔OD 值與臨界值對比數(shù)值大小，找出臨界值在每列樣品孔OD值中具體位置，從而判定抗體所對應(yīng)效價，若效價＞128∶1 為抗體陽性，＜128∶1 為抗體陰性。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

OD 值用SPSS 行t 檢驗進行分析。

2 結(jié)果

2.1 注射疫苗前各牛場口蹄疫抗體陽性率

受條件限制，相同發(fā)育階段的牛來自不同牛場。此次共檢測血清22500 份，由表1 可知，整體亞1 型抗體陽性率（80.79±0.54）%、A 型抗體陽性率（79.86±0.05）%、O 型抗體（78.47±0.32）%，抗體陽性率較高；犢?？贵w陽性率明顯低于其他階段的牛，可能由于犢牛免疫工作不及時造成。

表1 注射疫苗前各牛場口蹄疫免疫抗體陽性率

2.2 不同生長期各場區(qū)免疫抗體陽性率

由表2 可知，注射疫苗后育成公牛、空懷母牛、頭胎妊娠母牛3 種抗體變化規(guī)律相似，頭胎妊娠母?？贵w峰值略低于育成公牛與空懷母牛；A 型抗體在免疫后第2 個月抗體陽性率達到峰值，亞1 型、O 型在第4 個月抗體陽性率達到峰值，第6 個月時A 型抗體檢出率低于亞1 型、O 型，說明A 型抗體免疫應(yīng)答快，抗體濃度衰減也快。各階段牛在注射疫苗1 個月后逐漸產(chǎn)生抗體，6 個月后抗體陽性檢出率相比注射前水平更低，可見該疫苗免疫保護期不足6 個月。

表2 不同生長期內(nèi)各場區(qū)免疫抗體陽性率

注射疫苗前犢?？贵w陽性率明顯低于其他各階段牛，說明犢牛免疫能力弱，在注射疫苗前主要靠乳汁中的母源抗體，且大多犢牛為首次免疫，注射疫苗后抗體陽性率峰值為60%上下浮動，明顯低于其他發(fā)育階段牛；而哺乳母?？贵w陽性率峰值未達100%，且免疫后1～6 月內(nèi)抗體水平低于育成公牛、空懷母牛、頭胎妊娠母牛，說明哺乳會影響免疫應(yīng)答中口蹄疫抗體產(chǎn)生；注射口蹄疫三價苗后同一發(fā)展階段牛A 型抗體陽性檢出率高于亞Ⅰ型、O 型，說明注射三價苗時口蹄疫A 型抗原最容易刺激牛免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生抗體。

3 結(jié)論

牛注射口蹄疫A 型-O 型-亞I 三價苗1 個月后逐漸產(chǎn)生抗體，A 型抗體陽性率在第2 個月達到峰值，亞1 型、O 型在第4 個月抗體水平達到峰值，注射疫苗后犢?？贵w陽性率明顯低于其他發(fā)育階段牛，哺乳導致母?？贵w水平偏低但在保護范圍之內(nèi)，注射口蹄疫三價苗后A 型抗原最容易刺激牛免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生抗體。

注射金宇保靈生物藥品有限公司?？谔阋呷齼r苗牛免疫抗體陽性率較高，該疫苗對牛群的保護力較好，口蹄疫抗體陽性檢出率為亞1 型（80.79±0.54）%、A 型（79.86±0.05）%、O 型（78.47±0.32）%，免疫水平較高。但犢?？贵w陽性率明顯低于其他階段的牛，需加強犢牛免疫措施、改進犢牛免疫程序，疫苗接種間隔建議不超過6 個月。