馬強(qiáng) 羅莉?qū)?肖蕾 曹振卿 馬振華 馬兵奇

（1.甘肅省家畜繁育改良管理站，甘肅蘭州 733000；2.甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅蘭州 730046；3.蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司，甘肅蘭州 730046）

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一種急性接觸性傳染病[1]。全世界均有分布，宿主范圍廣，主要以偶蹄動(dòng)物的口、鼻、蹄及乳頭等部位發(fā)生水皰、潰瘍、爛斑等為特征。該病毒血清型較多，危害巨大，可快速傳播，致病性和感染性極強(qiáng)，感染發(fā)病率可達(dá)100%，可導(dǎo)致病畜生產(chǎn)能力下降，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。威脅國(guó)內(nèi)的主要是O 型、A型、亞洲I 型，為法定上報(bào)的一類(lèi)動(dòng)物疾病[2-5]。口蹄疫防控主要依靠注射疫苗，刺激畜體產(chǎn)生抗體，從而抵抗口蹄疫病毒的侵襲。但實(shí)際免疫中，很多疫苗無(wú)法起到保護(hù)作用，尤其是免疫后期家畜更容易發(fā)病，病毒傳染性也更強(qiáng)，給養(yǎng)殖戶造成巨大損失。市面上二價(jià)、三價(jià)口蹄疫疫苗層出不群，免疫保護(hù)期各不相同。其中三價(jià)苗相傳具有副作用小、免疫保護(hù)期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，但由于三價(jià)苗抗原純化工藝復(fù)雜，免疫程序制定不合理，多次免疫純化的滅活疫苗會(huì)對(duì)機(jī)體免疫應(yīng)答造成一定的干擾，養(yǎng)殖戶對(duì)三價(jià)苗免疫效果評(píng)價(jià)褒貶不一。本試驗(yàn)選擇市面銷(xiāo)量較廣的金宇保靈生物藥品有限公司三價(jià)滅活疫苗對(duì)各個(gè)發(fā)育階段的牛免疫注射，定期檢測(cè)免疫抗體水平，通過(guò)免疫抗體陽(yáng)性率評(píng)判三價(jià)苗免疫效果與免疫保護(hù)期，改進(jìn)免疫程序，不僅具有重大臨床價(jià)值，而且能為制定?？谔阋咭呙缦嚓P(guān)免疫技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 牛群檢測(cè)樣本

2020—2022 年實(shí)驗(yàn)組抽取30 個(gè)甘肅地區(qū)萬(wàn)頭以上牛場(chǎng)進(jìn)行疫苗注射接種（A 型-O 型-亞I 口蹄疫O型、亞洲I 型、A 型三價(jià)滅活疫苗購(gòu)自金宇保靈生物藥品有限公司），注射時(shí)間在疫苗有效期內(nèi)。在每個(gè)場(chǎng)隨機(jī)選取6 月齡內(nèi)犢牛30 頭（公母各15 頭），育成公牛30 頭、空懷母牛30 頭、頭胎妊娠母牛30 頭、哺乳母牛（指二胎及二胎以上帶犢母牛）30 頭。

1.1.2 試劑盒

購(gòu)自蘭州中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，改進(jìn)型口蹄疫A 型、O 型、亞I 抗體體液相阻斷檢測(cè)試劑盒（LB-ELISA）各50 盒。

1.1.3 試驗(yàn)儀器

96 孔ELISA 板、U 型96 孔抗原抗體反應(yīng)板、封板膜、移液槍、洗板機(jī)、恒溫箱、離心機(jī)、酶標(biāo)儀等均由甘肅省佳源畜牧生物有限公司實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 接種疫苗并提取血清

所有牛注射疫苗前采血檢測(cè)抗體效價(jià)，同一時(shí)間注射疫苗，注射后分別在第1、2、4、6 月采血分離血清（4500r/min 離心5min），并送至實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)抗體。

1.2.2 樣品的準(zhǔn)備

樣品血清稀釋20 倍后加樣，每次取樣后更換槍頭，準(zhǔn)確記錄板上每孔樣品的位置，樣品混合均勻后添加到包被板上。

1.2.3 檢測(cè)步驟

（1）排板：取出包被板，每塊板可檢測(cè)樣品92份，設(shè)陽(yáng)性對(duì)照4 孔、陰性對(duì)照2 孔。

（2）加樣：樣品孔每孔加入50μL 稀釋后的樣品，陰陽(yáng)對(duì)照孔每孔加入50μL 陰陽(yáng)對(duì)照，再向以上各孔中加入50μL 酶結(jié)合物，振蕩混勻；37℃條件下溫育30min。

（3）洗滌：撕去封板膜，將包被板子置于洗板機(jī)上，設(shè)置洗板程序洗滌5 次。洗滌完畢后取下包被板，拍干殘留水分。

（6）顯色：兩種顯色液等比混勻后各孔加100μL，放入37℃恒溫箱避光溫育15min。

（7）終止：各孔加50μL 終止液停止反應(yīng)。

（8）讀數(shù)：酶標(biāo)儀450nm 讀取OD 值。

（9）判定：病毒抗原OD 值＞1，且抗體效價(jià)1024±1，陰性效價(jià)＜1∶8 判定試驗(yàn)有效；取陽(yáng)性對(duì)照孔中間兩孔OD 值除以4 為臨界值，樣品孔OD 值與臨界值對(duì)比數(shù)值大小，找出臨界值在每列樣品孔OD值中具體位置，從而判定抗體所對(duì)應(yīng)效價(jià)，若效價(jià)＞128∶1 為抗體陽(yáng)性，＜128∶1 為抗體陰性。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

OD 值用SPSS 行t 檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 注射疫苗前各牛場(chǎng)口蹄疫抗體陽(yáng)性率

受條件限制，相同發(fā)育階段的牛來(lái)自不同牛場(chǎng)。此次共檢測(cè)血清22500 份，由表1 可知，整體亞1 型抗體陽(yáng)性率（80.79±0.54）%、A 型抗體陽(yáng)性率（79.86±0.05）%、O 型抗體（78.47±0.32）%，抗體陽(yáng)性率較高；犢?？贵w陽(yáng)性率明顯低于其他階段的牛，可能由于犢牛免疫工作不及時(shí)造成。

表1 注射疫苗前各牛場(chǎng)口蹄疫免疫抗體陽(yáng)性率

2.2 不同生長(zhǎng)期各場(chǎng)區(qū)免疫抗體陽(yáng)性率

由表2 可知，注射疫苗后育成公牛、空懷母牛、頭胎妊娠母牛3 種抗體變化規(guī)律相似，頭胎妊娠母?？贵w峰值略低于育成公牛與空懷母牛；A 型抗體在免疫后第2 個(gè)月抗體陽(yáng)性率達(dá)到峰值，亞1 型、O 型在第4 個(gè)月抗體陽(yáng)性率達(dá)到峰值，第6 個(gè)月時(shí)A 型抗體檢出率低于亞1 型、O 型，說(shuō)明A 型抗體免疫應(yīng)答快，抗體濃度衰減也快。各階段牛在注射疫苗1 個(gè)月后逐漸產(chǎn)生抗體，6 個(gè)月后抗體陽(yáng)性檢出率相比注射前水平更低，可見(jiàn)該疫苗免疫保護(hù)期不足6 個(gè)月。

表2 不同生長(zhǎng)期內(nèi)各場(chǎng)區(qū)免疫抗體陽(yáng)性率

注射疫苗前犢牛抗體陽(yáng)性率明顯低于其他各階段牛，說(shuō)明犢牛免疫能力弱，在注射疫苗前主要靠乳汁中的母源抗體，且大多犢牛為首次免疫，注射疫苗后抗體陽(yáng)性率峰值為60%上下浮動(dòng)，明顯低于其他發(fā)育階段牛；而哺乳母?？贵w陽(yáng)性率峰值未達(dá)100%，且免疫后1～6 月內(nèi)抗體水平低于育成公牛、空懷母牛、頭胎妊娠母牛，說(shuō)明哺乳會(huì)影響免疫應(yīng)答中口蹄疫抗體產(chǎn)生；注射口蹄疫三價(jià)苗后同一發(fā)展階段牛A 型抗體陽(yáng)性檢出率高于亞Ⅰ型、O 型，說(shuō)明注射三價(jià)苗時(shí)口蹄疫A 型抗原最容易刺激牛免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生抗體。

3 結(jié)論

牛注射口蹄疫A 型-O 型-亞I 三價(jià)苗1 個(gè)月后逐漸產(chǎn)生抗體，A 型抗體陽(yáng)性率在第2 個(gè)月達(dá)到峰值，亞1 型、O 型在第4 個(gè)月抗體水平達(dá)到峰值，注射疫苗后犢牛抗體陽(yáng)性率明顯低于其他發(fā)育階段牛，哺乳導(dǎo)致母牛抗體水平偏低但在保護(hù)范圍之內(nèi)，注射口蹄疫三價(jià)苗后A 型抗原最容易刺激牛免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生抗體。

注射金宇保靈生物藥品有限公司?？谔阋呷齼r(jià)苗牛免疫抗體陽(yáng)性率較高，該疫苗對(duì)牛群的保護(hù)力較好，口蹄疫抗體陽(yáng)性檢出率為亞1 型（80.79±0.54）%、A 型（79.86±0.05）%、O 型（78.47±0.32）%，免疫水平較高。但犢牛抗體陽(yáng)性率明顯低于其他階段的牛，需加強(qiáng)犢牛免疫措施、改進(jìn)犢牛免疫程序，疫苗接種間隔建議不超過(guò)6 個(gè)月。