李 敏，呂佳玳，劉月月，李俐睿，周瀟瀟，李桂黎，岳建國(guó)，黃 勇*

（1.四川省成都市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130）

本試驗(yàn)選用國(guó)內(nèi)具有代表性的兩個(gè)IBV疫苗株H120 和4∕91 和課題組 分離的GVI-1 分離株ZQX 作為研究對(duì)象，先選取在抵抗IBV 感染中發(fā)揮重要作用的固有免疫相關(guān)基因（TLR3、TLR7、MDA5、IFN-β、IL-6）為目的基因，設(shè)計(jì)引物，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立檢測(cè)目的基因表達(dá)的熒光定量RT-PCR 方法，然后用兩種常用的疫苗株H120和4∕91 分別免疫雞，2 周后使用ZQX 攻毒，觀察臨床癥狀，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率、死亡率，并采用熒光定量RT-PCR 方法測(cè)定不同疫苗免疫組在不同時(shí)間的固有免疫相關(guān)基因的表達(dá)倍數(shù)。從固有免疫角度對(duì)兩個(gè)疫苗株的免疫機(jī)理進(jìn)行分析，為明確IBV 的免疫機(jī)理和GVI-1 型毒株的致病機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 SPF雞胚及IBV毒株 本試驗(yàn)所用SPF雞胚購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，并在實(shí)驗(yàn)室自行孵化。4∕91疫苗購(gòu)自Intervet公司，H120 疫苗購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所，攻毒所用毒株ck∕CH∕YNSL∕160501（NCBI登錄號(hào)：MN096598，以下簡(jiǎn)稱ZQX）從四川省一家養(yǎng)殖場(chǎng)分離。采用Reed-Muench 法測(cè)定分離株ZQX 和疫苗株H120、4∕91 的雞胚半數(shù)感染量（EID50）［1］，結(jié)果分別為105.28∕0.1 mL、106.80∕0.1 mL、106.32∕0.1 mL。

1.2 主要試劑 總RNA 提取試劑盒（Trizol），PrimeScript RT-PCR Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒（SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ）、PMD19-T載體、限制性內(nèi)切酶、Premix Taq，購(gòu)自大連寶生物有限公司；PBS緩沖液；DNA Marker-L，購(gòu)自生工生物工程（股份）有限公司。

1.3 構(gòu)建熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)參考文獻(xiàn)［2］的結(jié)果，直接選擇ACTB 作為內(nèi)參基因，內(nèi)參基因ACTB 的引物參考已發(fā)表的文獻(xiàn)，根據(jù)NCBI 上已發(fā)表的目的基因TLR3、TLR7、MDA5、IFN-β、IL-6 的核苷酸序列，利用Oligo7.0軟件設(shè)計(jì)并優(yōu)化引物，使擴(kuò)增的目的片段保持在100～200 bp 之間，用于目的片段的擴(kuò)增及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。所有引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具體信息見表1。

表1 熒光定量引物信息

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建 參照文獻(xiàn)［3］方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒用ddH2O進(jìn)行10倍倍比稀釋，在LightCycler?96 SW 熒光定量PCR 儀上進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，采用10 μL體系（上、下游引物各1.0 μL，0.8 μL 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒和7.2 μL 雙蒸水）。引物與模板兩兩組合，反應(yīng)程序設(shè)定為：預(yù)變性95 ℃30 s，變性95 ℃5 s，退火52～57 ℃30 s，延伸72 ℃20 s，40個(gè)循環(huán)。確定線性回歸，并根據(jù)循環(huán)閾值（Ct 值）繪制含有插入物的質(zhì)粒DNA 拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值，將Ct 值轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)，構(gòu)建內(nèi)參基因及目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 免疫和攻毒方案 1 日齡SPF 雞48 只，隨機(jī)分為4組，每組12只，分別飼養(yǎng)在4個(gè)相互隔離的區(qū)域。在10 日齡時(shí)對(duì)雞群免疫，24 日齡時(shí)對(duì)雞群攻毒。具體方案為：A組、B組不免疫（用PBS緩沖液代替），10日齡時(shí)對(duì)C 組、D 組雞分別進(jìn)行H120和4∕91免疫，免疫劑量為105EID50∕0.1 mL，免疫方式為點(diǎn)眼和滴鼻；24日齡時(shí)分別對(duì)B、C、D組雞接種ZQX 株，劑量為104EID50∕0.1 mL；A 組作為空白對(duì)照組接種PBS，劑量為0.1 mL∕只，接種方式為點(diǎn)眼和滴鼻。每組雞自由采食，隔離飼養(yǎng)。攻毒后持續(xù)觀察并記錄各組雞的臨床癥狀、發(fā)病率、死亡率及組織剖檢變化。

1.4.2 固有免疫相關(guān)基因mRNA 表達(dá)差異的測(cè)定 分別在攻毒后1、3、5、7 d 每組隨機(jī)剖殺3 只雞，觀察記錄組織病變，無(wú)菌采集雞的氣管（不包括喉頭）于液氮中保存?zhèn)溆?。將氣管剖開，用手術(shù)刀片刮取氣管黏膜，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，于-70 ℃保存?zhèn)溆?。以cDNA 為模板，采用已構(gòu)建好的PCR 方法檢測(cè)各個(gè)樣品中內(nèi)參基因ACTB及目的基因TLR3、TLR7、MDA5、IFN-β、IL-6的表達(dá)量，隨后計(jì)算B、C、D組各個(gè)目的基因相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)倍數(shù)，使用2-△△Ct法計(jì)算表達(dá)比率，△△Ct＝（試驗(yàn)組目的基因的Ct值-試驗(yàn)組內(nèi)參基因的Ct 值）-（對(duì)照組目的基因的Ct 值-對(duì)照組內(nèi)參基因的Ct 值）。最后用GraphPad Prism 8軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 本試驗(yàn)共建立了6個(gè)RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，將10倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒在LightCycler?96 SW熒光定量PCR儀上進(jìn)行Real-time PCR 反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)樣品進(jìn)行編輯并分析，依次添加需要分析的選項(xiàng)，軟件自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。內(nèi)參基因ACTB 的熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝-3.504LgX+2.93（X為起始模板的量，Y為Ct 值）；目的基因TLR3 的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝-3.314LgX+3.92；TLR7 的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝-3.289LgX+2.36；MDA5 的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝-3.508 1LgX+2.14；IFN-β的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝-3.115 7LgX+3.67；IL-6 的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝-3.497 51LgX+1.75。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.2.1 臨床表現(xiàn) 攻毒后B、C、D 組雞相繼出現(xiàn)呼吸癥狀，表現(xiàn)為：打噴嚏、呼吸困難、氣管啰音，且羽毛蓬松、精神沉郁、采食量下降，全程無(wú)雞只死亡。A 組無(wú)臨床癥狀，B 組攻毒對(duì)照組發(fā)病率為66.7%，C 組和D 組的發(fā)病率分別為25%、33.33%，說(shuō)明疫苗株H120 和4∕91 對(duì)分離株ZQX均有一定的保護(hù)作用，能夠明顯降低雞傳支的發(fā)病率。

2.2.2 剖檢病變 剖檢結(jié)果表明，ZQX引起的最普遍病變?yōu)闅夤艹鲅?、有黏液，其次為盲腸扁桃體出血、腎臟腫大及腸道出血，但是腎臟病變不是特別明顯。疫苗株H120和4∕91對(duì)ZQX都具有一定的保護(hù)作用，兩者差異不明顯，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

表2 剖檢病變統(tǒng)計(jì)

2.3 固有炎癥因子IFN-β mRNA表達(dá)水平的測(cè)定 IFN-β mRNA在攻毒后不同時(shí)間點(diǎn)氣管黏膜中的表達(dá)情況如圖1所示。A組為空白對(duì)照組，B組為攻毒組，C、D 組分別為H120、4∕91 免疫攻毒組。攻毒后免疫組C 組的IFN-β mRNA 表達(dá)水平在第1 d 和第5 d 出現(xiàn)了顯著上調(diào)，D 組僅在第5 d 出現(xiàn)了上調(diào)；免疫組C、D 組的IL-6 mRNA 表達(dá)水平在第1 d顯著上調(diào)，且C組上調(diào)水平高于D組，C、D 組在第3 d 也出現(xiàn)了上調(diào)，其余時(shí)間點(diǎn)及其他組的轉(zhuǎn)錄水平則都趨于穩(wěn)定。

圖1 ZQX攻毒后氣管中炎癥因子IFN-β mRNA的表達(dá)情況

2.4 固有免疫相關(guān)基因mRNA 表達(dá)水平的測(cè)定 TLR3、TLR7、MDA5的mRNA水平在攻毒后不同時(shí)間點(diǎn)氣管黏膜中的表達(dá)情況如圖2 所示。A組為空白對(duì)照組，B組為攻毒組，C、D組分別為H120、4∕91 免疫攻毒組。攻毒后，C、D 免疫組TLR3 的mRNA 表達(dá)水平在第3 d 顯著上調(diào)，且C組的上調(diào)水平顯著高于D組，其他時(shí)間點(diǎn)都趨于穩(wěn)定；B 組攻毒組TLR7 mRNA 的表達(dá)水平在第5 d出現(xiàn)了顯著上調(diào)，免疫組中只有C組在攻毒后第3 d 出現(xiàn)了顯著上調(diào)，其余時(shí)間點(diǎn)及其他組的轉(zhuǎn)錄水平則都趨于穩(wěn)定甚至顯著下調(diào)；對(duì)于MDA5 mRNA的表達(dá)水平，C組在第1 d就出現(xiàn)了顯著上調(diào)，D 組到第3 d 才出現(xiàn)了這種顯著性上調(diào)，而后在第5、7 d 免疫組與感染組都呈現(xiàn)出不同程度的顯著下調(diào)，TLR7也出現(xiàn)了相同的狀況。

圖2 ZQX攻毒后氣管中TLR3、TLR7、MDA5 mRNA的表達(dá)情況

3 討論

疫苗免疫是防控雞傳支（IB）的主要策略，但I(xiàn)BV 毒株的變異常降低疫苗的有效性和保護(hù)性［4］。IBV 疫苗的免疫和保護(hù)機(jī)制非常復(fù)雜［5］。GVI-1型分離株ZQX 是近幾年流行的IBV 新毒株［6］，致病性不強(qiáng)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的解剖病變與H120 免疫攻毒組和4∕91免疫攻毒組相比差異不明顯，因此進(jìn)一步通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)其5個(gè)目的基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。

比較不同組間炎癥因子mRNA 的表達(dá)水平，可以發(fā)現(xiàn)免疫組的表達(dá)量在前期均高于空白對(duì)照組和攻毒組，但是對(duì)比攻毒組其上調(diào)趨勢(shì)隨著時(shí)間的推移逐漸減緩，逐步與機(jī)體本身炎癥因子的表達(dá)水平持平，這可能是因?yàn)槊庖呓M前期通過(guò)上調(diào)抗病毒天然免疫通路對(duì)病毒進(jìn)行清除，導(dǎo)致了下游干擾素與白介素因子的一部分上調(diào)。

綜合比較H120免疫攻毒組和4∕91免疫攻毒組各個(gè)目的基因表達(dá)高峰出現(xiàn)的時(shí)間，發(fā)現(xiàn)H120免疫攻毒組中基因的表達(dá)高峰幾乎都在4∕91 免疫攻毒組之前，也就是說(shuō)H120 疫苗株發(fā)揮作用的時(shí)間早于4∕91疫苗株。由于H120免疫株是由IBV Mass 型的H株傳120獲得的，故其對(duì)機(jī)體的適應(yīng)性更高，在相同情況下的復(fù)制能力比4∕91更強(qiáng)，對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用也更迅速。

4 結(jié)論

H120 和4∕91 疫苗對(duì)ZQX 株能提供一定程度的臨床保護(hù)。H120 疫苗攻毒組，在攻毒后1 d MDA5 mRNA 的表達(dá)水平達(dá)到高峰，攻毒后3 d TLR3、TLR7 mRNA的表達(dá)水平達(dá)到高峰；4∕91疫苗攻毒組，在攻毒后7 d TLR3、TLR7 mRNA的表達(dá)水平達(dá)到高峰，在攻毒后3 d MDA5 mRNA 的表達(dá)水平較高。H120 疫苗攻毒組，在攻毒后1 d IFN-β mRNA、IL-6 mRNA 的表達(dá)水平達(dá)到高峰；4∕91疫苗攻毒組，IFN-β mRNA的表達(dá)水平在攻毒后5 d 達(dá)到高峰，IL-6 mRNA 的表達(dá)水平在攻毒后1 d 達(dá)到高峰?？梢奌120 免疫組感染ZQX 后固有免疫相關(guān)基因的表達(dá)比4∕91 免疫組更為快速。

本研究探討了H120免疫攻毒組和4∕91免疫攻毒組中5 個(gè)固有免疫相關(guān)基因在攻毒后1、3、5、7 d 的表達(dá)差異，得到了各個(gè)基因的表達(dá)動(dòng)態(tài)，有利于在免疫學(xué)水平上闡明機(jī)體抵抗病毒感染的原因，為以后IBV 的天然免疫研究提供一定的參考。