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        犬ADMSCs對低氧缺糖模型RSC96細(xì)胞增殖、遷移及相關(guān)基因表達(dá)的影響

        2022-10-29 08:20:06林昊燁陳淑儀王丙云陳志勝劉璨穎陳勝鋒
        四川畜牧獸醫(yī) 2022年9期
        關(guān)鍵詞:髓鞘共培養(yǎng)劃痕

        林昊燁,陳淑儀,徐 麟,李 暄,王丙云,陳志勝,劉璨穎,陳勝鋒

        (佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 佛山 528200)

        脊髓損傷(SCI)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,常發(fā)生于寵物身上,可能引發(fā)截癱、大小便失禁等[1]。髓鞘的完整性對于維持神經(jīng)元功能至關(guān)重要,而SCI 時脊髓軸突發(fā)生急性脫髓鞘甚至神經(jīng)纖維斷裂是導(dǎo)致神經(jīng)功能缺失的重要原因。盡管神經(jīng)纖維很難再生,但髓鞘可促進(jìn)軸突末梢的延長以及重建突觸聯(lián)系,因此在SCI治療中,促進(jìn)髓鞘的修復(fù)進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)功能的改善是SCI治療的重要環(huán)節(jié)[2-3]。

        犬脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADMSCs)具有較強(qiáng)分化能力,能分泌多種細(xì)胞因子和炎性趨化因子[4]。研究表明,間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)分離于犬的皮下脂肪組織,具有自我更新潛力,可顯著增加脊髓組織髓鞘含量,但機(jī)制尚不清楚。髓鞘由膠質(zhì)細(xì)胞和施萬細(xì)胞組成,且有證據(jù)顯示SCI 時施萬細(xì)胞參與髓鞘的修復(fù)[5-6]。因此,本試驗(yàn)以RSC96細(xì)胞(一種大鼠施萬細(xì)胞的細(xì)胞系)為對象,模擬SCI 時脊髓組織低氧缺糖的微環(huán)境,制備低氧缺糖RSC96 細(xì)胞模型,通過離體試驗(yàn)研究ADMSCs 對低氧缺糖RSC96 細(xì)胞增殖、遷移及相關(guān)基因表達(dá)的影響,旨在探究MSC 促進(jìn)髓鞘修復(fù)的分子機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 RSC96細(xì)胞株(來源于大鼠施萬細(xì)胞的細(xì)胞系)購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。

        1.2 主要試劑及耗材 CCK-8 試劑盒,RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒,TB Green PCR Master Mix,96孔qPCR反應(yīng)試劑盒及qPCR封板膜;6孔及24孔Transwell 共培養(yǎng)板;細(xì)胞劃痕插件(500 μm 劃痕區(qū)域)。

        1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱;低氧培養(yǎng)箱;正置熒光顯微鏡;離心機(jī);熒光定量PCR 儀(LightCycler480)。

        1.4 方法

        1.4.1 RSC96 細(xì)胞培養(yǎng) 取出凍存RSC96 細(xì)胞,37 ℃水浴速溶,1 000 r∕min 離心5 min,棄去凍存液,加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,以1×106cell 密度接種于培養(yǎng)皿。在37℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2~3d換液,取P3代細(xì)胞做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

        1.4.2 犬ADMSCs 培養(yǎng) 本實(shí)驗(yàn)室已建立犬ADMSCs 原代細(xì)胞的分離及鑒定方法,取出凍存的3~6 代犬ADMSCs 細(xì)胞,37 ℃水浴鍋速溶,1000r∕min離心5 min,棄去凍存液,加入培養(yǎng)基,以1×106cell的密度接種于培養(yǎng)皿。在37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2~3 d 換液,取P3 代細(xì)胞做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

        1.4.3 RSC96 細(xì)胞低氧缺糖模型的建立 取對數(shù)生長期RSC96細(xì)胞以1×105cell∕孔分別接種到5個24 孔板中,每板設(shè)置6 個復(fù)孔。其中1 板作為空白對照組常規(guī)培養(yǎng),另4 板作不同造模時長的低氧缺糖模型組細(xì)胞板,待細(xì)胞長至60%~70%,棄去完全培養(yǎng)基,PBS 洗滌1~2 次,除去多余完全培養(yǎng)基。每孔加入1 mL DMEM 無糖培養(yǎng)基,在37 ℃3% O2和5% CO2低氧培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)造模6、8、10、12 h,用CCK-8 分別檢測5 板細(xì)胞活性及鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。5板細(xì)胞皆棄去舊液,每孔加入含10%CCK-8 的DMEM 200 μL,37 ℃暗室孵育30 min,隨后轉(zhuǎn)移到96 孔板,測定OD 值。低氧缺糖模型組細(xì)胞增殖抑制率為50%左右,代表模型建立成功。細(xì)胞增殖抑制率=(空白對照組-低氧缺糖模型組)∕空白對照組×100%。

        1.4.4 犬ADMSCs 對低氧缺糖模型RSC96 細(xì)胞增殖的影響 設(shè)空白對照組、模型對照組、MSC共培養(yǎng)組及空白培養(yǎng)基組,空白對照組為常規(guī)培養(yǎng)的處于對數(shù)生長期的RSC96 細(xì)胞,其余三組為制備的低氧缺糖模型RSC96 細(xì)胞,造模時間為10 h。造模后模型對照組添加RSC96 完全培養(yǎng)基1 mL;MSC 共培養(yǎng)組復(fù)孔帶Transwell 小室,小室上層以1×105cell∕孔接種犬ADMSCs細(xì)胞并加入500 μL干細(xì)胞培養(yǎng)基,小室下層加入500 μL RSC96完全培養(yǎng)基;空白培養(yǎng)基組添加500 μL干細(xì)胞培養(yǎng)基及500 μL RSC96 完全培養(yǎng)基。24 h后使用CCK-8法檢測各組間OD值。

        1.4.5 犬ADMSCs 對低氧缺糖模型RSC96 細(xì)胞遷移的影響 設(shè)置空白對照組、模型對照組、MSC 共培養(yǎng)組和空白培養(yǎng)基組,每組設(shè)置3 個復(fù)孔,每孔安裝1個細(xì)胞劃痕插件,保證插件緊貼培養(yǎng)板底,在插件兩室接種1×104cell∕孔,待細(xì)胞鋪滿后移除劃痕插件。3個實(shí)驗(yàn)組按照前述方法進(jìn)行共培養(yǎng)及細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整,除空白對照組外3組均進(jìn)行低氧缺糖造模。分別在造模后0、12、24 h 拍照并計算遷移率。遷移率=(0 h 劃痕面積-目標(biāo)時間段劃痕面積)∕0 h劃痕面積×100%。

        1.4.6 犬ADMSCs 對低氧缺糖模型RSC96 細(xì)胞增殖遷移相關(guān)基因表達(dá)的影響 取對數(shù)生長期RSC96細(xì)胞以5×105cell的密度接種到6孔板,分3組且每組設(shè)3 個復(fù)孔,按照前述方法分組及處理。按照說明書提取各組細(xì)胞的RNA,在紫外分光光度計下檢測A260∕A280 數(shù)值,將所提取合格樣品的RNA 按照說明書方法反轉(zhuǎn)錄為cDNA,-30 ℃保存。

        在NCBI Primer-blast得到NGF、NT-3、Nrg-1和GAPDH(內(nèi)參)基因的PCR引物序列(表1),并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。配置qPCR 反應(yīng)體系,運(yùn)行qPCR 反應(yīng)程序,得到各基因相應(yīng)Ct 值后,采用相對定量法2-△△Ct計算各基因mRNA表達(dá)水平。

        表1 PCR引物序列表

        1.4.7 數(shù)據(jù)分析 使用ImageJ 計算細(xì)胞遷移面積大小;采用IBM SPSS Statistics 20統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),P<0.05 為差異顯著,有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 RSC96 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 正常組RSC96 細(xì)胞貼壁生長,形態(tài)為不規(guī)則神經(jīng)元狀,細(xì)胞折光性良好,生長速度較快。低氧缺糖造模后RSC96細(xì)胞貼壁生長,細(xì)胞折光性變差,細(xì)胞扁平偽足延長,細(xì)胞顆粒變性,生長速度減緩。

        2.2 犬ADMSCs對低氧缺糖模型RSC96細(xì)胞增殖的影響 由圖1 可知,0 h 時空白對照組OD 值均顯著高于其余三組(P<0.05);24 h后MSC共培養(yǎng)組OD值顯著高于空白培養(yǎng)基組與模型對照組(P<0.05)。

        圖1 犬ADMSCs對低氧缺糖模型RSC96細(xì)胞增殖的影響

        2.3 犬ADMSCs 對低氧缺糖模型RSC96 細(xì)胞遷移的影響 由表2 可知,0 h 時4 組間劃痕面積無顯著差異(P>0.05);12 h 時MSC 共培養(yǎng)組與空白對照組的劃痕面積顯著小于另外兩組(P<0.05);24 h時空白培養(yǎng)基組的劃痕面積顯著大于空白對照組(P<0.05),空白培養(yǎng)基組的劃痕面積顯著小于模型對照組(P<0.05)。

        表2 犬ADMSCs對低氧缺糖模型RSC96細(xì)胞遷移的影響

        2.4 犬ADMSCs對低氧缺糖模型RSC96細(xì)胞增殖、遷移相關(guān)基因表達(dá)的影響 如圖2所示,各處理組NGF 和NT-3的mRNA 表達(dá)水平,MSC共培養(yǎng)組顯著高于空白培養(yǎng)基組(P<0.05),而與模型對照組的顯著性不差異(P>0.05)。Nrg-1 的mRNA 表達(dá)水平,MSC 共培養(yǎng)組顯著高于其余三組(P<0.05)。

        圖2 各組間RSC96細(xì)胞增殖、遷移相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平

        3 討論

        本試驗(yàn)結(jié)果表明,MSC 可促進(jìn)低氧缺糖RSC96 細(xì)胞的增殖,提高細(xì)胞的遷移率和細(xì)胞增殖(NGF、NT-3)、遷移(Nrg-1)相關(guān)基因mRNA的表達(dá)量。提示MSC 治療SCI 可能通過增強(qiáng)SC 活性來促進(jìn)損傷修復(fù)。

        為揭示MSC 促進(jìn)RSC96 細(xì)胞增殖及遷移的分子機(jī)制,本試驗(yàn)檢測了NGF、NT-3、Nrg-1 等基因的表達(dá)水平。NGF 是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子,對神經(jīng)元存活及促進(jìn)軸突生長具有重要作用[7]。NT-3 基因可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖,促進(jìn)其他細(xì)胞向神經(jīng)元的分化等。本試驗(yàn)中NT-3基因表達(dá)量的增加可能有助于提升髓鞘含量和軸突再生,從而改善動物的運(yùn)動功能。Nrg-1基因在SCI后,可以通過酪氨酸激酶受體信號傳導(dǎo)至OPC,部分OPC轉(zhuǎn)化為功能性SC,從而自發(fā)性修復(fù)脊柱功能性髓鞘[8]。

        MSC是位于中胚層的一種未分化細(xì)胞,具有多分化潛能,大量研究表明,MSC對SCI的修復(fù)具有積極作用,但其機(jī)制目前尚存爭議。將MSC移植至受損脊髓組織后,可促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子和成纖維生長因子等,從而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)[9]。

        綜上所述,本次共培養(yǎng)離體試驗(yàn)探究了MSC修復(fù)髓鞘損傷的分子機(jī)制,初步證明MSC對受損髓鞘的修復(fù)主要是通過改善損傷環(huán)境,促進(jìn)施萬細(xì)胞的增殖和遷移來實(shí)現(xiàn)的。

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