林昊燁，陳淑儀，徐 麟，李 暄，王丙云，陳志勝，劉璨穎，陳勝鋒

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528200）

脊髓損傷（SCI）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，常發(fā)生于寵物身上，可能引發(fā)截癱、大小便失禁等［1］。髓鞘的完整性對(duì)于維持神經(jīng)元功能至關(guān)重要，而SCI 時(shí)脊髓軸突發(fā)生急性脫髓鞘甚至神經(jīng)纖維斷裂是導(dǎo)致神經(jīng)功能缺失的重要原因。盡管神經(jīng)纖維很難再生，但髓鞘可促進(jìn)軸突末梢的延長以及重建突觸聯(lián)系，因此在SCI治療中，促進(jìn)髓鞘的修復(fù)進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)功能的改善是SCI治療的重要環(huán)節(jié)［2-3］。

犬脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADMSCs）具有較強(qiáng)分化能力，能分泌多種細(xì)胞因子和炎性趨化因子［4］。研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）分離于犬的皮下脂肪組織，具有自我更新潛力，可顯著增加脊髓組織髓鞘含量，但機(jī)制尚不清楚。髓鞘由膠質(zhì)細(xì)胞和施萬細(xì)胞組成，且有證據(jù)顯示SCI 時(shí)施萬細(xì)胞參與髓鞘的修復(fù)［5-6］。因此，本試驗(yàn)以RSC96細(xì)胞（一種大鼠施萬細(xì)胞的細(xì)胞系）為對(duì)象，模擬SCI 時(shí)脊髓組織低氧缺糖的微環(huán)境，制備低氧缺糖RSC96 細(xì)胞模型，通過離體試驗(yàn)研究ADMSCs 對(duì)低氧缺糖RSC96 細(xì)胞增殖、遷移及相關(guān)基因表達(dá)的影響，旨在探究MSC 促進(jìn)髓鞘修復(fù)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 RSC96細(xì)胞株（來源于大鼠施萬細(xì)胞的細(xì)胞系）購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑及耗材 CCK-8 試劑盒，RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒，TB Green PCR Master Mix，96孔qPCR反應(yīng)試劑盒及qPCR封板膜；6孔及24孔Transwell 共培養(yǎng)板；細(xì)胞劃痕插件（500 μm 劃痕區(qū)域）。

1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱；低氧培養(yǎng)箱；正置熒光顯微鏡；離心機(jī)；熒光定量PCR 儀（LightCycler480）。

1.4 方法

1.4.1 RSC96 細(xì)胞培養(yǎng) 取出凍存RSC96 細(xì)胞，37 ℃水浴速溶，1 000 r∕min 離心5 min，棄去凍存液，加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以1×106cell 密度接種于培養(yǎng)皿。在37℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3d換液，取P3代細(xì)胞做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 犬ADMSCs 培養(yǎng) 本實(shí)驗(yàn)室已建立犬ADMSCs 原代細(xì)胞的分離及鑒定方法，取出凍存的3～6 代犬ADMSCs 細(xì)胞，37 ℃水浴鍋速溶，1000r∕min離心5 min，棄去凍存液，加入培養(yǎng)基，以1×106cell的密度接種于培養(yǎng)皿。在37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d 換液，取P3 代細(xì)胞做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 RSC96 細(xì)胞低氧缺糖模型的建立 取對(duì)數(shù)生長期RSC96細(xì)胞以1×105cell∕孔分別接種到5個(gè)24 孔板中，每板設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。其中1 板作為空白對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)，另4 板作不同造模時(shí)長的低氧缺糖模型組細(xì)胞板，待細(xì)胞長至60%～70%，棄去完全培養(yǎng)基，PBS 洗滌1～2 次，除去多余完全培養(yǎng)基。每孔加入1 mL DMEM 無糖培養(yǎng)基，在37 ℃3% O2和5% CO2低氧培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)造模6、8、10、12 h，用CCK-8 分別檢測5 板細(xì)胞活性及鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。5板細(xì)胞皆棄去舊液，每孔加入含10%CCK-8 的DMEM 200 μL，37 ℃暗室孵育30 min，隨后轉(zhuǎn)移到96 孔板，測定OD 值。低氧缺糖模型組細(xì)胞增殖抑制率為50%左右，代表模型建立成功。細(xì)胞增殖抑制率＝（空白對(duì)照組-低氧缺糖模型組）∕空白對(duì)照組×100%。

1.4.4 犬ADMSCs 對(duì)低氧缺糖模型RSC96 細(xì)胞增殖的影響 設(shè)空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、MSC共培養(yǎng)組及空白培養(yǎng)基組，空白對(duì)照組為常規(guī)培養(yǎng)的處于對(duì)數(shù)生長期的RSC96 細(xì)胞，其余三組為制備的低氧缺糖模型RSC96 細(xì)胞，造模時(shí)間為10 h。造模后模型對(duì)照組添加RSC96 完全培養(yǎng)基1 mL；MSC 共培養(yǎng)組復(fù)孔帶Transwell 小室，小室上層以1×105cell∕孔接種犬ADMSCs細(xì)胞并加入500 μL干細(xì)胞培養(yǎng)基，小室下層加入500 μL RSC96完全培養(yǎng)基；空白培養(yǎng)基組添加500 μL干細(xì)胞培養(yǎng)基及500 μL RSC96 完全培養(yǎng)基。24 h后使用CCK-8法檢測各組間OD值。

1.4.5 犬ADMSCs 對(duì)低氧缺糖模型RSC96 細(xì)胞遷移的影響 設(shè)置空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、MSC 共培養(yǎng)組和空白培養(yǎng)基組，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，每孔安裝1個(gè)細(xì)胞劃痕插件，保證插件緊貼培養(yǎng)板底，在插件兩室接種1×104cell∕孔，待細(xì)胞鋪滿后移除劃痕插件。3個(gè)實(shí)驗(yàn)組按照前述方法進(jìn)行共培養(yǎng)及細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整，除空白對(duì)照組外3組均進(jìn)行低氧缺糖造模。分別在造模后0、12、24 h 拍照并計(jì)算遷移率。遷移率＝（0 h 劃痕面積-目標(biāo)時(shí)間段劃痕面積）∕0 h劃痕面積×100%。

1.4.6 犬ADMSCs 對(duì)低氧缺糖模型RSC96 細(xì)胞增殖遷移相關(guān)基因表達(dá)的影響 取對(duì)數(shù)生長期RSC96細(xì)胞以5×105cell的密度接種到6孔板，分3組且每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，按照前述方法分組及處理。按照說明書提取各組細(xì)胞的RNA，在紫外分光光度計(jì)下檢測A260∕A280 數(shù)值，將所提取合格樣品的RNA 按照說明書方法反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-30 ℃保存。

在NCBI Primer-blast得到NGF、NT-3、Nrg-1和GAPDH（內(nèi)參）基因的PCR引物序列（表1），并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。配置qPCR 反應(yīng)體系，運(yùn)行qPCR 反應(yīng)程序，得到各基因相應(yīng)Ct 值后，采用相對(duì)定量法2-△△Ct計(jì)算各基因mRNA表達(dá)水平。

表1 PCR引物序列表

1.4.7 數(shù)據(jù)分析 使用ImageJ 計(jì)算細(xì)胞遷移面積大小；采用IBM SPSS Statistics 20統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05 為差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RSC96 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 正常組RSC96 細(xì)胞貼壁生長，形態(tài)為不規(guī)則神經(jīng)元狀，細(xì)胞折光性良好，生長速度較快。低氧缺糖造模后RSC96細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞折光性變差，細(xì)胞扁平偽足延長，細(xì)胞顆粒變性，生長速度減緩。

2.2 犬ADMSCs對(duì)低氧缺糖模型RSC96細(xì)胞增殖的影響 由圖1 可知，0 h 時(shí)空白對(duì)照組OD 值均顯著高于其余三組（P＜0.05）；24 h后MSC共培養(yǎng)組OD值顯著高于空白培養(yǎng)基組與模型對(duì)照組（P＜0.05）。

圖1 犬ADMSCs對(duì)低氧缺糖模型RSC96細(xì)胞增殖的影響

2.3 犬ADMSCs 對(duì)低氧缺糖模型RSC96 細(xì)胞遷移的影響 由表2 可知，0 h 時(shí)4 組間劃痕面積無顯著差異（P＞0.05）；12 h 時(shí)MSC 共培養(yǎng)組與空白對(duì)照組的劃痕面積顯著小于另外兩組（P＜0.05）；24 h時(shí)空白培養(yǎng)基組的劃痕面積顯著大于空白對(duì)照組（P＜0.05），空白培養(yǎng)基組的劃痕面積顯著小于模型對(duì)照組（P＜0.05）。

表2 犬ADMSCs對(duì)低氧缺糖模型RSC96細(xì)胞遷移的影響

2.4 犬ADMSCs對(duì)低氧缺糖模型RSC96細(xì)胞增殖、遷移相關(guān)基因表達(dá)的影響 如圖2所示，各處理組NGF 和NT-3的mRNA 表達(dá)水平，MSC共培養(yǎng)組顯著高于空白培養(yǎng)基組（P＜0.05），而與模型對(duì)照組的顯著性不差異（P＞0.05）。Nrg-1 的mRNA 表達(dá)水平，MSC 共培養(yǎng)組顯著高于其余三組（P＜0.05）。

圖2 各組間RSC96細(xì)胞增殖、遷移相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，MSC 可促進(jìn)低氧缺糖RSC96 細(xì)胞的增殖，提高細(xì)胞的遷移率和細(xì)胞增殖（NGF、NT-3）、遷移（Nrg-1）相關(guān)基因mRNA的表達(dá)量。提示MSC 治療SCI 可能通過增強(qiáng)SC 活性來促進(jìn)損傷修復(fù)。

為揭示MSC 促進(jìn)RSC96 細(xì)胞增殖及遷移的分子機(jī)制，本試驗(yàn)檢測了NGF、NT-3、Nrg-1 等基因的表達(dá)水平。NGF 是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，對(duì)神經(jīng)元存活及促進(jìn)軸突生長具有重要作用［7］。NT-3 基因可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，促進(jìn)其他細(xì)胞向神經(jīng)元的分化等。本試驗(yàn)中NT-3基因表達(dá)量的增加可能有助于提升髓鞘含量和軸突再生，從而改善動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)功能。Nrg-1基因在SCI后，可以通過酪氨酸激酶受體信號(hào)傳導(dǎo)至OPC，部分OPC轉(zhuǎn)化為功能性SC，從而自發(fā)性修復(fù)脊柱功能性髓鞘［8］。

MSC是位于中胚層的一種未分化細(xì)胞，具有多分化潛能，大量研究表明，MSC對(duì)SCI的修復(fù)具有積極作用，但其機(jī)制目前尚存爭議。將MSC移植至受損脊髓組織后，可促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子和成纖維生長因子等，從而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)［9］。

綜上所述，本次共培養(yǎng)離體試驗(yàn)探究了MSC修復(fù)髓鞘損傷的分子機(jī)制，初步證明MSC對(duì)受損髓鞘的修復(fù)主要是通過改善損傷環(huán)境，促進(jìn)施萬細(xì)胞的增殖和遷移來實(shí)現(xiàn)的。