楊 洋，謝黎卿，胡 沛，高麗旭，袁 祥，李 攀，彭遠(yuǎn)義，李能章

(西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，重慶 400715)

多殺性巴氏桿菌是一種革蘭陰性短小桿菌，自1880年巴斯德首次從患病的禽體內(nèi)分離鑒定以來(lái)，發(fā)現(xiàn)該菌能感染幾乎所有家禽、家畜及多種野生動(dòng)物，引起如牛出血性敗血癥、豬肺疫、禽霍亂和兔巴氏桿菌病等多種動(dòng)物疾病，每年給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該菌也可感染人，主要通過(guò)犬貓抓咬的傷口感染，危害健康。多殺性巴氏桿菌可作為共生菌，常定植于動(dòng)物口腔及鼻咽等部位，在各種應(yīng)激或其他病原感染條件下大量增殖，進(jìn)而侵染組織臟器引發(fā)各種疾病。

多殺性巴氏桿菌可分為5種莢膜血清型(A、B、D、E和F)和16種LPS血清型，不同血清型導(dǎo)致的疾病特點(diǎn)及病理變化差異顯著，各血清型間交叉免疫保護(hù)性差。當(dāng)前，商品化多殺性巴氏桿菌疫苗主要針對(duì)的是牛出血性敗血癥、豬肺疫、禽霍亂及兔巴氏桿菌病等單一血清型感染類(lèi)疾病，各疫苗間交叉保護(hù)性弱，缺乏針對(duì)多種血清型的通用型疫苗。目前，針對(duì)多殺性巴氏桿菌交叉免疫保護(hù)性疫苗的研究，主要集中在單一抗原篩選方面。

Homchampa等發(fā)現(xiàn)，基因缺失能增強(qiáng)部分A型多殺性巴氏桿菌菌株的交叉免疫保護(hù)性，Boyce和Adler也發(fā)現(xiàn)，與基因缺失，均可導(dǎo)致B型多殺性巴氏桿菌莢膜缺失，毒力減弱及相關(guān)免疫保護(hù)特性變化。以上研究表明，多殺性巴氏桿菌某些基因的缺失能賦予缺失株交叉免疫保護(hù)特性。莢膜是多殺性巴氏桿菌重要毒力因子，與多殺性巴氏桿菌的宿主特異性、致病性、免疫保護(hù)性及感染導(dǎo)致的發(fā)病類(lèi)型密切相關(guān)。已報(bào)道多個(gè)基因參與調(diào)控多殺性巴氏桿菌莢膜產(chǎn)生，但不同基因調(diào)控的莢膜缺失賦予菌株的免疫特性有很大的差異。目前研究發(fā)現(xiàn)的基因缺失菌株，其交叉免疫保護(hù)性并不強(qiáng)。本研究選擇了與A型多殺性巴氏桿菌莢膜多糖合成有關(guān)的基因，通過(guò)構(gòu)建缺失株及回補(bǔ)株，探討該基因?qū)Χ鄽⑿园褪蠗U菌的莢膜產(chǎn)生、生物膜形成、生長(zhǎng)繁殖及毒力的影響，以及該基因的缺失對(duì)菌株交叉免疫保護(hù)性的影響，以期進(jìn)一步為多殺性巴氏桿菌致病機(jī)制及疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、菌株及質(zhì)粒

雌性昆明小鼠(6～8周齡，體重20～22 g)購(gòu)自恩斯維爾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)及試驗(yàn)方式受西南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)監(jiān)督(Permit Number: IACUC-20200803-01)。牛源A型多殺性巴氏桿菌(PmCQ1、PmCQ2、PmCQ4、PmCQ5)、牛源F型多殺性巴氏桿菌(PmF)、禽源A型多殺性巴氏桿菌(PmQ)及兔源A型多殺性巴氏桿菌(PmR)均由西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離并暫存；牛源B型多殺性巴氏桿菌(PmB，CVCC470)及豬源A型多殺性巴氏桿菌(PmP，CVCC1662)均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所獸醫(yī)微生物菌種保藏中心；DH5α 和BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京博邁德生物技術(shù)有限公司。用于基因缺失的質(zhì)粒pUC19oriKan為實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建保藏，質(zhì)粒pMc-Express由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)曹三杰教授饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑

馬丁氏肉湯培養(yǎng)基、腦心浸液肉湯培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；抗生素(卡那霉素、氨芐青霉素、氯霉素)、Stains all粉末(7423-31-6)、結(jié)晶紫(548-62-9)及吐溫20均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒(DP302-02)及反轉(zhuǎn)錄試劑盒(KR118-02)購(gòu)自天根生物科技有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶(I、I、H I 及d III)購(gòu)自TaKaRa；In-FusionHD Cloning Kit (PT5162-1)購(gòu)自Clontech；弗氏完全及不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司；羊抗鼠IgG-HRP、TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-12p40和IL-17A ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Thermo Scientific公司；0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液、TritonX-100購(gòu)自Solarbio；15 A VG礦物油乳化劑為重慶澳龍生物制品有限公司贈(zèng)送；TMB顯色液(3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺)購(gòu)自Beyotime公司；細(xì)胞RNA提取試劑盒(RE-03111)購(gòu)自福際生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌RNA提取試劑盒(TR214-50)購(gòu)自天漠生物。

1.3 基因缺失株及其回補(bǔ)株的構(gòu)建

本研究選擇野生株P(guān)mCQ2進(jìn)行基因缺失株的構(gòu)建。缺失株構(gòu)建采用同源重組方法，具體方法參考Tatum等的研究。同源重組質(zhì)粒采用實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的多殺性巴氏桿菌基因缺失溫敏型載體pUC19oriKan，通過(guò)溫度篩選陽(yáng)性克隆，最終構(gòu)建無(wú)抗性Marker缺失株。構(gòu)建缺失株及回補(bǔ)株所用引物見(jiàn)表1。取-80 ℃ 保藏的PmCQ2劃線接種馬丁固體平板，37 ℃ 倒置培養(yǎng)24 h，挑取3～4個(gè)菌落接種5 mL馬丁液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r·min震蕩培養(yǎng)8 h，離心收集菌體，提取基因組DNA備用。以基因組DNA為模板，分別以上、下游同源臂5′ARM-F/5′ARM-R和3′ARM-F/3′ARM-R引物擴(kuò)增上、下游同源臂DNA片段。以純化的上、下游同源臂DNA片段為模板，采用5′ARM-F和3′ARM-R引物繼續(xù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取上下游同源臂融合DNA片段，與經(jīng)H I和d III雙酶切線性化的pUC19oriKan載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂布含抗生素的LB平板(Kanamycin, 50 μg·mL)過(guò)夜培養(yǎng)，篩選獲得同源臂融合DNA片段重組載體。重組質(zhì)粒經(jīng)電轉(zhuǎn)PmCQ2后，涂布含100 μg·mLKan馬丁氏肉湯培養(yǎng)基上，PCR初步篩選基因缺失菌株 Δ，進(jìn)而采用qPCR及Western blot 方法，從轉(zhuǎn)錄和蛋白水平檢測(cè) Δ中有無(wú)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，對(duì)驗(yàn)證正確的缺失菌株，連續(xù)在無(wú)抗生素的馬丁肉湯培養(yǎng)基中傳代30次，保證Kan抗性消除和遺傳穩(wěn)定性。構(gòu)建回補(bǔ)株時(shí)以pMc-Express質(zhì)粒為模板，采用引物-F/R擴(kuò)增出基因表達(dá)盒，與H I和d III雙酶切線性化的pUC19oriKan載體連接，獲得重組質(zhì)粒pUC19oriKan-，經(jīng)I和I雙酶切回收骨架載體，獲不含基因的線性載體pUC19oriKan-d備用。以PmCQ2基因組DNA為模板，采用com-F/R引物擴(kuò)增出完整基因片段，純化后連接到pUC19oriKan-d，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，篩選獲得重組質(zhì)粒pUC19oriKan-com，其后電轉(zhuǎn)化 Δ感受態(tài)細(xì)胞，篩選獲回補(bǔ)菌株C-，qPCR及Western blot方法檢測(cè)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。連續(xù)傳代30次保證其遺傳穩(wěn)定性。

表1 基因缺失株和回補(bǔ)株構(gòu)建所需引物Table 1 Primers used for the construction of mutant and complementary strains

1.4 Anti-HyaD多克隆抗體的制備

制備HyaD多克隆抗體，通過(guò)Western blot方法，以此驗(yàn)證基因缺失株及回補(bǔ)株中有無(wú)HyaD表達(dá)。制備方法簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，以PmCQ2基因組DNA為模板，采用wb-F/R引物擴(kuò)增基因缺失部分的一個(gè)片段，擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pET32a(+)，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選獲得的重組質(zhì)粒繼續(xù)轉(zhuǎn)化.BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性克隆按照實(shí)驗(yàn)室前期方法進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和純化。純化的重組蛋白與弗氏完全佐劑按照1∶1比例充分乳化混合，重組蛋白終濃度為0.5 μg·μL。小鼠背部皮下多點(diǎn)免疫(100 μL乳化液·只)，首免后14 d加強(qiáng)免疫1次，重組蛋白免疫量與首免一致，但佐劑為弗氏不完全佐劑；二免后14 d 尾靜脈采血，分離血清備用。

1.5 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

取-80 ℃ 保藏的PmCQ2、Δ、C-分別劃線接種馬丁固體平板，37 ℃ 倒置培養(yǎng)24 h，挑取3～4個(gè)菌落接種5 mL馬丁液體培養(yǎng)基，37 ℃、220 r·min震蕩培養(yǎng)10 h。菌液稀釋平板計(jì)數(shù)后，采用馬丁氏肉湯培養(yǎng)基稀釋各菌株培養(yǎng)液含菌量至2×10CFU·mL，其后按1∶100接種量轉(zhuǎn)接5 mL新鮮馬丁氏肉湯培養(yǎng)基，37 ℃、220 r·min震蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣測(cè)定OD值，取8個(gè)時(shí)間點(diǎn)，繪制生長(zhǎng)曲線。試驗(yàn)每次設(shè)3個(gè)生物重復(fù)，重復(fù)3次。

1.6 莢膜多糖含量測(cè)定

莢膜多糖測(cè)定方法參照Chung等的研究。分別取1 mL PmCQ2、Δ及C-對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)液，13 000 r·min離心10 min，去上清，菌體用PBS 洗滌2次，其后用1 mL PBS重懸菌體，42 ℃處理1 h(處理前后分別取5 μL進(jìn)行平板計(jì)數(shù))，菌懸液13 000 r·min離心10 min，取100 μL上清液，加入900 μL莢膜染色液(0.2 mg·mL的stains all粉末、50%甲酰胺和0.6%冰醋酸)振蕩混勻，同時(shí)配制透明質(zhì)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液樣品(0、0.5、1、2、3、4、5 μg·(100 μL)透明質(zhì)酸分別加入900 μL莢膜染色液)，采用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各菌株細(xì)胞莢膜含量。試驗(yàn)每次設(shè)5個(gè)生物重復(fù)，重復(fù)3次。

1.7 生物膜測(cè)定

生物膜測(cè)定參考Jin等的研究方法。取平板計(jì)數(shù)后的PmCQ2、Δ及C-對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)液，用腦心浸液肉湯(BHI)培養(yǎng)基稀釋至菌含量為1×10CFU·mL，取稀釋菌液至48孔細(xì)胞培養(yǎng)板(400 μL·孔)，陰性對(duì)照為400 μL BHI肉湯培養(yǎng)基，混勻置37 ℃ 恒溫培養(yǎng)48 h。去培養(yǎng)液，PBS(200 μL·孔)輕柔清洗2次，室溫干燥，每孔加入200 μL甲醇室溫固定1 h，PBS輕柔清洗3次，室溫干燥，加入1 %結(jié)晶紫(200 μL·孔)，37 ℃ 染色30 min，PBS輕柔清洗3次，室溫晾干，最后加入33% 冰醋酸溶液(200 μL·孔)，37 ℃ 溶解30 min，采用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。試驗(yàn)每次設(shè)5個(gè)生物重復(fù)，重復(fù)3次。

1.8 半數(shù)致死量(LD50)測(cè)定

取馬丁肉湯培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Δ和C-平板計(jì)數(shù)后，按Δ(1.7×10、1.7×10、1.7×10、1.7×10、1.7×10CFU)和C-(3.4×10、3.4×10、3.4×10、3.4×10、3.4×10CFU)各5個(gè)梯度的菌，分別采用肌肉途徑攻毒小鼠(=10)，連續(xù)觀察1周。當(dāng)小鼠瀕臨死亡時(shí)(精神沉郁、閉眼、食欲斷絕、外界刺激反應(yīng)弱等)，實(shí)施安樂(lè)死，統(tǒng)計(jì)小鼠死亡數(shù)，采用bliss法計(jì)算半數(shù)致死量。

1.9 臟器細(xì)菌定殖和病理分析

分別取2.0×10CFU對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PmCQ2、Δ及C-，左后腿肌肉途徑感染小鼠(=6)。攻毒后8、24 h分別取6只小鼠安樂(lè)死，采集肺、肝和脾稱量、勻漿、稀釋涂馬丁固體平板，檢測(cè)其含菌量。采集小鼠感染24 h肺，多聚甲醛固定后送里來(lái)佳諾生物科技有限公司做病理切片，HE染色分析。

1.10 細(xì)胞感染試驗(yàn)

本細(xì)胞試驗(yàn)主要分析野生株P(guān)mCQ2、Δ及 C-對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的黏附、抗吞噬及促炎能力的差異。方法參照實(shí)驗(yàn)室前期研究。無(wú)菌采集小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液后按照1∶4的比例與0.4%的臺(tái)盼藍(lán)混合，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后鋪于48孔細(xì)胞板(2×10細(xì)胞·孔)，置37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中，貼壁2 h后，去未貼壁細(xì)胞，添加新細(xì)胞培養(yǎng)液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PmCQ2、Δ及 C-經(jīng)馬丁肉湯平板計(jì)數(shù)后，按1 MOI(multiplicity of infection)感染細(xì)胞，感染8 h后，去培養(yǎng)液，PBS清洗3次。每個(gè)菌取一半感染孔，分別加入100 μg·mL環(huán)丙沙星(500 μL·孔)處理30 min(殺死細(xì)胞外的菌，包括黏附菌)，PBS洗滌3次；另一半感染孔不加抗生素處理。其后，所有感染孔，每孔加入500 μL含0.1% TritonX-100的PBS溶液，充分裂解細(xì)胞，釋放出細(xì)胞中被吞噬細(xì)菌。取細(xì)胞裂解液分別進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，測(cè)定各菌黏附的菌數(shù)及被細(xì)胞吞噬的菌數(shù)。試驗(yàn)每次設(shè)5個(gè)生物重復(fù)，重復(fù)3次。

取6孔細(xì)胞板，每孔接種2×10個(gè)巨噬細(xì)胞，貼壁2 h后，分別感染1 MOI對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PmCQ2、Δ及C-，感染8 h后，收集培養(yǎng)液，4 ℃、13 000 r·min離心10 min，取上清液，采用ELISA檢測(cè)試劑盒，分別檢測(cè)上清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12p40和IL-17A等炎性因子。與此同時(shí)，收集各菌感染的巨噬細(xì)胞，提取總RNA，采用qRT-PCR方法，分別測(cè)定各菌感染的巨噬細(xì)胞中-、-1β、-6、-12p40和-17A等基因的轉(zhuǎn)錄情況。

1.11 HyaD調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)分析

為分析HyaD參與調(diào)控其他基因表達(dá)情況，在此調(diào)查了其對(duì)菌株莢膜及生物膜產(chǎn)生、LPS合成及轉(zhuǎn)運(yùn)、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)及保護(hù)性抗原等相關(guān)基因表達(dá)的影響。分別取PmCQ2、Δ及C-菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)液，4 ℃、13 200 r·min離心2 min，收集菌體，采用細(xì)菌RNA提取試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。相關(guān)檢測(cè)基因及引物見(jiàn)表2，qRT-PCR方法檢測(cè)各基因的表達(dá)。試驗(yàn)設(shè)5個(gè)生物重復(fù)。

表2 qRT-PCR檢測(cè)基因所需引物Table 2 Primers required for gene detection by qRT-PCR

1.12 滅活苗的制備

滅活菌苗制備方法參考試驗(yàn)前期研究。取PmCQ2株和Δ株種子液，按 1% 分別接種馬丁肉湯培養(yǎng)基，37 ℃、220 r·min恒溫震蕩培養(yǎng)12 h，對(duì)培養(yǎng)后的PmCQ2株和Δ株菌液，分別進(jìn)行純粹性檢驗(yàn)和活菌計(jì)數(shù)后濃縮，濃縮后分別加入終濃度為0.15% 的甲醛溶液，37 ℃ 靜置滅活24 h，期間每隔3 h適當(dāng)振蕩使其充分滅活，其后，兩種菌各取100 μL處理液，分別涂布于馬丁固體培養(yǎng)基上，于37 ℃ 培養(yǎng)24 h 進(jìn)行滅活檢驗(yàn)。滅活檢驗(yàn)合格后，將菌液和PBS分別與15 A VG礦物油佐劑按照4∶1體積比混合均勻，分別制成滅活菌苗和PBS乳化劑，使PmCQ2株和Δ株終濃度均為5×10CFU·mL。每種滅活苗各取100 μL涂布在馬丁固體平板上，于37 ℃ 培養(yǎng)24 h 進(jìn)行無(wú)活菌檢驗(yàn)。另選取6只小鼠，分別背部皮下接種100 μL滅活苗進(jìn)行疫苗安全性評(píng)價(jià)。檢驗(yàn)合格疫苗4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.13 疫苗交叉保護(hù)性測(cè)定

取雌性昆明小鼠(6～8周齡，體重20～22 g)270只，隨機(jī)分為27組，每組10只。按照表3進(jìn)行疫苗免疫及攻毒分組。其中PmCQ2(1-9)、Δ(1-9)和PBS emulsifier(1-9)各為9個(gè)組。小鼠背部皮下多點(diǎn)注射疫苗，共免疫2次，首免后第14天進(jìn)行加強(qiáng)免疫。首免第21天，分別以3.6×10CFU PmCQ1(LD=3.8×10CFU)、3.2×10CFU PmCQ2 (LD=3.43×10CFU)、4.6×10CFU PmCQ4(LD=2.1×10CFU)、2.9×10CFU PmCQ5 (LD=4.5×10CFU)、1.2×10CFU PmB (LD=5.0×10CFU)、4.4×10CFU PmF(LD=1.0×10CFU)、10 CFU PmQ (LD≈1 CFU)、10 CFU PmP (LD≈1 CFU)、2.2×10CFU PmR (LD=1.0×10CFU)等9株菌肌肉攻毒，攻毒后每天觀察2次，記錄小鼠臨床癥狀，瀕臨死亡實(shí)施安樂(lè)死，記錄小鼠死亡數(shù)量，連續(xù)記錄1周。疫苗保護(hù)率按以下公式計(jì)算：保護(hù)率(%)=(對(duì)照組死亡率-免疫組死亡率)/對(duì)照組死亡率×100。

表3 免疫分組和攻毒設(shè)計(jì)Table 3 Immunization grouping and challenge design

1.14 抗體效價(jià)分析

參照“1.13”小鼠免疫分組，共設(shè)定2個(gè)疫苗免疫組(PmCQ2及Δ)及1個(gè)PBS乳化劑免疫對(duì)照組和1個(gè)未免疫的空白對(duì)照組，每組6只小鼠，免疫方式及劑量參見(jiàn)表3，初免21 d尾靜脈采血，分離血清，ELISA方法檢測(cè)疫苗免疫各組特異性抗體水平(包被抗原分別為PmCQ1、PmCQ2、PmCQ4、PmCQ5、PmB、PmF、PmP、PmQ和PmR全菌蛋白)。

1.15 免疫后攻毒，肺病理變化分析

參照“1.13”小鼠免疫分組，設(shè)定2個(gè)疫苗免疫大組，PmCQ2(1-10)及Δ(1-10)，每種疫苗分為10個(gè)小組，每小組3只小鼠，免疫方式及劑量參見(jiàn)表3，初免第21天，其中9組分別感染PmCQ1、PmCQ2、PmCQ4、PmCQ5、PmB、PmF、PmP、PmQ、PmR等9種菌，感染劑量參照“1.13”，余下1組作未感染組對(duì)照。感染12 h后，所有小鼠實(shí)施安樂(lè)死，取肺組織送里來(lái)佳諾生物科技有限公司制做病理切片，HE染色分析。

1.16 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Graphpad Prism 6軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析處理，檢驗(yàn)分析，>0.05為無(wú)顯著差異；<0.05、<0.01、<0.001、<0.000 1為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 hyaD基因缺失株構(gòu)建及其生物學(xué)特性

基因編碼UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶，根據(jù)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中多殺性巴氏桿菌基因組數(shù)據(jù)分析，基因主要存在于A型和F型多殺性巴氏桿菌，1株B型多殺性巴氏桿菌中發(fā)現(xiàn)存在該基因，D和E型多殺性巴氏桿菌中未發(fā)現(xiàn)。A型多殺性巴氏桿菌中，、、等基因簇參與了莢膜多糖的合成轉(zhuǎn)運(yùn)，但參與的具體作用仍不清楚。本研究選擇了一株已基因組測(cè)序的牛源A型多殺性巴氏桿菌CQ2菌株進(jìn)行基因缺失，其基因全長(zhǎng)2 919 bp，編碼972aa，根據(jù)氨基酸序列，分析預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)域位置，選擇缺失該基因的部分結(jié)構(gòu)域(核酸序列區(qū)段：288～490 bp)。其上、下游同源臂擴(kuò)增引物及缺失株驗(yàn)證引物的設(shè)計(jì)位置如示意圖所示(圖1A)。上、下游同源臂融合連接到載體pUC19oriKan，轉(zhuǎn)化野生株P(guān)mCQ2感受態(tài)細(xì)胞，篩選獲得缺失株Δ，進(jìn)而構(gòu)建含完整基因的回補(bǔ)株質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化Δ感受態(tài)細(xì)胞，篩選獲得基因回補(bǔ)株C-。比較PmCQ2、Δ及C-，采用不同引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從基因水平驗(yàn)證了所構(gòu)建的Δ及C-的準(zhǔn)確性，Δ中缺失了基因的部分片段，回補(bǔ)株中存在完整的基因(圖1B)，其后提取菌株RNA，采用qRT-PCR方法檢測(cè)各菌株中的轉(zhuǎn)錄本情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅Δ中無(wú)轉(zhuǎn)錄本(圖1C)，進(jìn)一步從蛋白水平檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)僅缺失株中無(wú)HyaD蛋白表達(dá)(圖1D)，即從基因水平、轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平等3個(gè)方面驗(yàn)證了所構(gòu)建的Δ及C-的準(zhǔn)確性。體外傳代30次后，Δ及C-遺傳性質(zhì)穩(wěn)定。采用馬丁氏肉湯培養(yǎng)，Δ接種后4～8 h，生長(zhǎng)明顯快于PmCQ2和C-，其后各菌株生長(zhǎng)趨于一致(圖1E)。在馬丁氏肉湯平板上生長(zhǎng)24 h后，Δ的菌落明顯小于PmCQ2的菌落，C-的菌落大小介于二者之間(圖1F)。Δ的生長(zhǎng)菌落雖然變小，但其本身的生長(zhǎng)速度與野生株并無(wú)顯著差異(圖1E)，這可能與其細(xì)胞的莢膜多糖含量有關(guān)，經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，Δ的莢膜多糖含量顯著低于PmCQ2和C-(圖1G)。A型多殺性巴氏桿菌一般具有較厚的莢膜，在液體中不易離心沉降，而Δ因其莢膜多糖產(chǎn)生量降低，細(xì)胞因此變得極易離心和沉降(圖1H)。Petruzzi等發(fā)現(xiàn)，A型多殺性巴氏桿菌的莢膜多糖產(chǎn)生與其生物膜產(chǎn)生趨勢(shì)相反，莢膜多糖會(huì)抑制生物膜形成，莢膜多糖產(chǎn)生降低會(huì)促進(jìn)生物膜的形成。測(cè)定Δ生物膜產(chǎn)生情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生量顯著高于PmCQ2和C-(圖1I)，其莢膜多糖與生物膜的產(chǎn)生也是呈相反趨勢(shì)，與Petruzzi等研究結(jié)果一致。

A. 同源臂擴(kuò)增及缺失株驗(yàn)證引物設(shè)計(jì)示意圖；B. 野生株(PmCQ2)、缺失株(ΔhyaD)及回補(bǔ)株(C-hyaD)的PCR驗(yàn)證，M. DNA marker；泳道1、4、7、10、13. PmCQ2；泳道2、5、8、11、14. ΔhyaD；泳道3、6、9、12、15. C-hyaD；C. hyaD 基因轉(zhuǎn)錄情況檢測(cè)；D. HyaD蛋白表達(dá)情況檢測(cè)；E. 生長(zhǎng)曲線；F. 菌落形態(tài)；G. 莢膜多糖含量測(cè)定；H. 菌體靜置沉降及離心狀態(tài)；I. 生物膜含量測(cè)定。ns. 不顯著(P>0.05)，*. P <0.05，**. P <0.01，***. P <0.001，****. P <0.000 1。下同A. Schematic diagram of primers for homologous arm amplification and mutant verification; B. PCR confirmation of wild type(PmCQ2), mutant(ΔhyaD) and complementary strains(C-hyaD), M. DNA marker; Lane 1,4,7,10,13. PmCQ2 strain; Lane 2,5,8,11,14. hyaD mutant; Lane 3,6,9,12,15. C-hyaD; C. hyaD transcripts detected by qRT-PCR; D. HyaD protein detected by Western blot; E. Growth curve; F. Colony morphology; G. Capsular polysaccharide production; H. The status of bacterial cells sedimentation and centrifugation; I. Biofilm production. ns. No significant difference (P>0.05), *. P <0.05，**. P <0.01，***. P <0.001，****. P <0.000 1. The same as below圖1 hyaD基因缺失株及回補(bǔ)株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性測(cè)定Fig.1 Construction and characterization of hyaD mutant and complementary strain C-hyaD

2.2 hyaD基因缺失致使PmCQ2毒力下調(diào)

為探究基因缺失對(duì)多殺性巴氏桿菌PmCQ2毒力的影響，分別以2.0×10CFU的 PmCQ2、Δ和C-肌肉途徑攻毒小鼠，野生株P(guān)mCQ2感染小鼠在3 d內(nèi)全部死亡，而Δ株感染小鼠 7 d內(nèi)僅死亡1只，而C-感染小鼠在7 d以內(nèi)全部死亡，死亡時(shí)間較PmCQ2滯后(圖2A)。感染后8和24 h，分別測(cè)定各菌株在臟器中的定殖量。感染相同劑量和相同時(shí)間條件下，野生株P(guān)mCQ2在各臟器中的定殖量最高，C-次之，Δ定殖量最低，各菌株間差異顯著，并隨感染時(shí)間延長(zhǎng)各菌株定殖量有所升高(圖2B、2C)，測(cè)定各菌株感染24 h導(dǎo)致的小鼠肺部病理?yè)p傷發(fā)現(xiàn)，Δ引起肺病理?yè)p傷最輕(圖2D～F)。

A.生存曲線;B、C.臟器中細(xì)菌定殖測(cè)定; D～F.PmCQ2、ΔhyaD和C-hyaD感染小鼠肺組織HE染色(400×)A. Survival rates; B,C. Bacterial loads in infected mice organs; D-F. HE staining of lung of mouse infected with PmCQ2, ΔhyaD and C-hyaD, respectively (400×)圖2 PmCQ2、ΔhyaD及C-hyaD致病性比較分析Fig.2 Pathogenicity analysis of wild-type PmCQ2, hyaD mutant and C-hyaD

測(cè)定Δ和C-肌肉感染小鼠的半數(shù)致死量，Δ的LD為2.30×10CFU，約為野生株P(guān)mCQ2半數(shù)致死量(LD=3.43×10CFU)的6 700倍，而C-的LD為1.43×10CFU，約為PmCQ2的4倍(表4)，基因的回補(bǔ)，基本恢復(fù)了Δ菌株相關(guān)毒力，表明Δ毒力降低的確是受到了HyaD調(diào)控。

表4 ΔhyaD和C-hyaD 菌株半數(shù)致死量測(cè)定Table 4 Median lethal dose (LD50) of hyaD mutant and C-hyaD strain CFU

2.3 hyaD基因缺失促進(jìn)細(xì)胞黏附吞噬及相關(guān)炎性因子的產(chǎn)生

前面試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，基因缺失會(huì)導(dǎo)致菌株莢膜含量降低及相關(guān)毒力顯著下降。莢膜能促進(jìn)病原抗細(xì)胞吞噬能力，前期有研究發(fā)現(xiàn)，多殺性巴氏桿菌莢膜的缺失會(huì)促進(jìn)細(xì)菌的細(xì)胞黏附能力，那么Δ感染細(xì)胞的情況如何？本試驗(yàn)選用了小鼠腹腔巨噬細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試。采用同一劑量的PmCQ2、Δ和C-分別感染巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Δ更易黏附于巨噬細(xì)胞表面(圖3A)，并且被吞噬的數(shù)量顯著高于PmCQ2和C-(圖3B)，C-黏附和被吞噬的數(shù)量介于PmCQ2和Δ之間(圖3A、3B)，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)多殺性巴氏桿菌莢膜缺失會(huì)促進(jìn)細(xì)菌的細(xì)胞黏附能力。進(jìn)一步測(cè)定各菌株誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎性因子產(chǎn)生情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生株P(guān)mCQ2和回補(bǔ)株C-比較，在RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白分泌水平，缺失株Δ能顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞-、-1β、-6、-12p40和-17A炎性基因的轉(zhuǎn)錄(圖3C～G)和TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12p40和IL-17A炎性因子的分泌(圖3H～L)，該結(jié)果表明，菌體黏附和被吞噬的越多，宿主細(xì)胞的相關(guān)炎性因子產(chǎn)生越高。有趣的是，PmCQ2與C-誘導(dǎo)炎性基因的轉(zhuǎn)錄本無(wú)顯著差異，然而在其炎性因子分泌水平方面卻差異顯著(圖3C～L)，這可能與轉(zhuǎn)錄本(半衰期短)是一個(gè)短時(shí)間累積結(jié)果，而分泌出的蛋白因子(半衰期長(zhǎng))是一個(gè)較長(zhǎng)時(shí)間累積結(jié)果有關(guān)。

A. 黏附巨噬細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)量測(cè)定；B. 巨噬細(xì)胞吞噬的細(xì)菌數(shù)量測(cè)定；C～G. 感染巨噬細(xì)胞炎癥相關(guān)基因表達(dá)情況；H～L. 感染巨噬細(xì)胞炎性因子分泌情況A. The number of bacteria attached to macrophages; B. The number of bacteria in macrophages; C-G. The expression of inflammatory genes in macrophages infected with 1MOI of PmCQ2, hyaD mutant and C-hyaD, respectively; H-L. Inflammatory factors secretion of macrophages infected with 1MOI of PmCQ2, hyaD mutant and C-hyaD, respectively圖3 巨噬細(xì)胞感染分析Fig.3 In vitro macrophage infection analysis

2.4 hyaD基因缺失對(duì)菌株其他基因表達(dá)的影響

基于Δ相關(guān)生物學(xué)特性變化，選擇分析了與莢膜多糖合成轉(zhuǎn)運(yùn)、生物膜合成、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)、LPS合成轉(zhuǎn)運(yùn)、毒力、保護(hù)性抗原等相關(guān)基因的表達(dá)差異。與PmCQ2和C-相比，Δ莢膜合成相關(guān)的、、、等基因顯著下調(diào)(圖4A～D)，與生物膜合成相關(guān)的、基因表達(dá)顯著上調(diào)(圖4E、F)，與鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的、基因表達(dá)顯著下調(diào)(圖4G、4H)，而與LPS合成與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的、、、基因表達(dá)呈顯著下調(diào)(圖4I～L)，與菌株毒力有關(guān)的0442、4基因表達(dá)也顯著下調(diào)(圖4M、4N)。考慮到多殺性巴氏桿菌外膜蛋白與交叉保護(hù)性密切關(guān)系，分析比較了野生株與缺失株部分外膜蛋白基因的表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺失株中大量外膜蛋白基因如、、、、、、、、、、、、、、、、、2等基因的表達(dá)顯著上調(diào)(圖4O)，包括已證實(shí)具有交叉免疫保護(hù)性的外膜蛋白如OmpH、PlpE等，這預(yù)示著Δ可能具有交叉保護(hù)特性。

A～D. 莢膜合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況；E、F. 生物膜形成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況；G、H. 鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況；I～L. LPS合成、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況；M、N. 毒力相關(guān)基因Pm0442和plp4轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況；O. 外膜蛋白相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況A-D. The expression of capsular synthesis-related genes; E, F. The expression of biofilm formation-related genes; G, H. The expression of iron transportation-related genes; I-L. The expression of LPS synthesis- and transportation-related genes; M, N. The expression of virulence-associated genes Pm0442 and plp4; O. The expression of outer membrane protein genes圖4 hyaD基因缺失調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析Fig.4 ΔhyaD influence other gene expression using qRT-PCR

2.5 hyaD基因缺失促進(jìn)菌株交叉保護(hù)特性

依據(jù)前面試驗(yàn)結(jié)果，基因缺失導(dǎo)致了多殺性巴氏桿菌莢膜多糖含量及外膜蛋白顯著變化，特別是與免疫保護(hù)性相關(guān)的一些蛋白表達(dá)顯著上升，預(yù)示著菌株可能具有了新的免疫保護(hù)特性。為檢測(cè)缺失株的免疫保護(hù)特性，分別制備了野生株P(guān)mCQ2和不同缺失株Δ滅活菌苗，比較二者對(duì)不同血清型和不同動(dòng)物源多殺性巴氏桿菌的免疫保護(hù)性差異。以制備好的PmCQ2株和Δ株滅活疫苗分別免疫小鼠，觀察免疫小鼠精神狀態(tài)、食欲良好，背部皮下無(wú)明顯腫塊。免疫后21 d，尾靜脈采血，分離血清，以不同菌株細(xì)胞全蛋白作為包被抗原，ELISA檢測(cè)各血清中針對(duì)各菌株的特異性抗體水平。Δ株免疫小鼠血清中整體抗體水平(圖5A)均高于PmCQ2株免疫小鼠(圖5B)，抗牛源A型和B型多殺性巴氏桿菌的抗體水平顯著高于抗牛源F型和其他動(dòng)物源多殺性巴氏桿菌的抗體水平(圖5A、5B)，由此可以看出疫苗株與各野生菌株間其交叉免疫抗原量的多少。

A. ΔhyaD株免疫小鼠抗體效價(jià)；B. PmCQ2株免疫小鼠抗體效價(jià)A. Antibody titers of mice immunized with hyaD mutant inactivated vaccine; B. Antibody titers of mice immunized with PmCQ2 inactivated vaccine圖5 免疫小鼠抗體產(chǎn)生情況Fig.5 Antibody generation of immunized mice

免疫小鼠經(jīng)尾靜脈采血后，肌肉途徑分別攻毒不同血清型和不同動(dòng)物源多殺性巴氏桿菌菌株，Δ株滅活疫苗對(duì)牛源A型多殺性巴氏桿菌(PmCQ1、PmCQ2、PmCQ4、PmCQ5)和牛源B型多殺性巴氏桿菌PmB的免疫保護(hù)率達(dá)100%(圖6A～E)，對(duì)牛源F型多殺性巴氏桿菌PmF的保護(hù)率也達(dá)80%(圖6F)，對(duì)豬源A型多殺性巴氏桿菌PmP、禽源A型多殺性巴氏桿菌PmQ和兔源A型多殺性巴氏桿菌PmR的保護(hù)率也分別達(dá)100%、100%和90%(圖6G～I(xiàn))；而PmCQ2株滅活苗除對(duì)牛源A型多殺性巴氏桿菌(PmCQ1、PmCQ2、PmCQ4、PmCQ5)的免疫保護(hù)率達(dá)80%以上(圖6A～D)，對(duì)牛源B型和F型多殺性巴氏桿菌的交叉免疫保護(hù)性弱，低于30%(圖6E、6F)，對(duì)兔源、禽源和豬源多殺性巴氏桿菌無(wú)交叉免疫保護(hù)作用(圖6G～I(xiàn))。以上研究結(jié)果表明，基因缺失調(diào)控了菌株相關(guān)基因表達(dá)的改變，賦予了菌株新的交叉免疫保護(hù)特性。

A～I(xiàn). 小鼠肌肉途徑免疫PmCQ2 和ΔhyaD疫苗，對(duì)照組注射PBS，免疫后第21天， 肌肉途徑分別感染PmCQ1(A)、PmCQ2(B)、PmCQ4(C)、PmCQ5(D)、PmB(E)、PmF(F)、PmP(G)、PmQ (H)和PmR(I)，記錄小鼠存活率，繪制各菌株感染小鼠生存曲線圖A-I. Mice were immunized with inactivated PmCQ2 and inactivated hyaD mutant, and injected with PBS as controls, and then challenged with PmCQ1(A), PmCQ2(B), PmCQ4(C), PmCQ5(D), PmB(E), PmF(F), PmP(G), PmQ(H) and PmR(I) at day 21 after primary immunization, respectively, record the survival mice number for the protective rate calculation圖6 疫苗交叉免疫保護(hù)性測(cè)定Fig.6 Cross-protection of inactivated PmCQ2 and inactivated hyaD mutant

為進(jìn)一步比較Δ株與野生株P(guān)mCQ2滅活苗的免疫保護(hù)效果差異，分析疫苗免疫后感染的肺組織病理?yè)p傷后發(fā)現(xiàn)，Δ株免疫小鼠，在攻毒12 h后肺無(wú)明顯或輕微病理?yè)p傷(圖7)，而未免疫小鼠和野生株P(guān)mCQ2免疫小鼠的肺病理?yè)p傷較為嚴(yán)重，肺泡上皮細(xì)胞不同程度脫落，肺間質(zhì)內(nèi)較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖7)，表明Δ疫苗能顯著減輕毒株感染對(duì)臟器的損傷。PmCQ2滅活苗雖對(duì)野生株P(guān)mCQ2攻擊有100 % 免疫保護(hù)作用，但在受攻擊早期，免疫小鼠臟器還是會(huì)受到一定損傷，這種損傷程度可能與攻毒劑量與個(gè)體的保護(hù)性抗體水平有關(guān)。

小鼠免疫PmCQ2 和ΔhyaD疫苗后第21天，與未免疫小鼠一起，分別感染PmCQ1、PmCQ2、PmCQ4、PmCQ5、PmB、PmF、PmP、PmQ和PmR，感染后12 h，取肺組織HE染色Mice were immunized with inactivated PmCQ2 and inactivated hyaD mutant, and then challenged with PmCQ1, PmCQ2, PmCQ4, PmCQ5, PmB, PmF, PmP, PmQ and PmR at day 21 after primary immunization, the lungs were collected at 12 h post infection for the HE staining圖7 小鼠肺組織病理?yè)p傷分析(400×)Fig.7 Histopathological lesion analysis of mice lung (400×)

3 討 論

多殺性巴氏桿菌能引起多種動(dòng)物疾病，包括禽霍亂、豬萎縮性鼻炎、蹄類(lèi)動(dòng)物出血性敗血癥、牛羊地方性肺炎、兔鼻炎以及人類(lèi)的傷口膿腫和腦膜炎(比較罕見(jiàn))。根據(jù)NCBI基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中多殺性巴氏桿菌及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，在5種莢膜血清型多殺性巴氏桿菌中，A型多殺性巴氏桿菌幾乎能感染所有可感染多殺性巴氏桿菌的動(dòng)物，可導(dǎo)致禽霍亂、肺炎、鼻炎、傷口膿腫等疾病，其臨床分離率最高；其次是B型和F型，B型常見(jiàn)感染豬、牛、羊，主要導(dǎo)致出血性敗血癥，F(xiàn)型常見(jiàn)感染兔和禽，偶有感染豬、牛的臨床株，有時(shí)從貓、狗口腔中也能分離出；D型主要感染豬和兔，E型可感染豬、牛、羊、駱駝等，主要導(dǎo)致動(dòng)物出血性敗血癥，但D型和E型的臨床分離率相對(duì)較低。除按莢膜分型外，多殺性巴氏桿菌根據(jù)其菌體LPS進(jìn)行分型，還可分為16種血清型，由此可以看出多殺性巴氏桿菌血清型的多樣性。不同血清型和不同動(dòng)物來(lái)源的多殺性巴氏桿菌菌株致病性差異較大，相互交叉免疫保護(hù)性弱，這為多殺性巴氏桿菌疫苗的研究帶來(lái)了困難。目前，僅有的幾種多殺性巴氏桿菌商品化疫苗，也僅對(duì)同源血清型毒株感染提供有限的免疫保護(hù)作用。如何有效控制不同血清型和不同動(dòng)物源多殺性巴氏桿菌的感染，抗生素治療似乎是可無(wú)差別針對(duì)不同血清型多殺性巴氏桿菌的，但隨著抗生素的大量使用，出現(xiàn)了越來(lái)越多的耐藥性多殺性巴氏桿菌菌株，這為該病原的防控帶來(lái)了新的問(wèn)題。因此，對(duì)于多殺性巴氏桿菌易感動(dòng)物群體，疫苗預(yù)防仍是有效的主要防控手段。

多殺性巴氏桿菌雖有多種血清型，但基因組比較分析發(fā)現(xiàn)，多殺性巴氏桿菌2 000多個(gè)基因中，各血清型間絕大多數(shù)基因相同或同源性高，PlpB、PlpE、PmCQ2_2 g0128、OmpH、Omp87等交叉保護(hù)性抗原的發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步證實(shí)各血清型菌株間存在交叉免疫保護(hù)性抗原，但通常單一抗原其交叉免疫保護(hù)作用有限。Homchampa等通過(guò)缺失多殺性巴氏桿菌P-1059株(血清型A:3)的基因獲得的缺失株能夠保護(hù)血清型A:1和A:4 菌株的感染，這為多殺性巴氏桿菌疫苗研究展示了新的方向。通過(guò)基因缺失的方式改變細(xì)胞的相應(yīng)基因表達(dá)調(diào)控，促使相關(guān)交叉免疫保護(hù)性抗原的表達(dá)上調(diào)等，可能起到交叉免疫保護(hù)效果，但關(guān)鍵是確定哪些基因缺失能改變菌株免疫保護(hù)特性。本課題組前期研究中，PmCQ2菌株0979及0442基因缺失株均未發(fā)現(xiàn)交叉免疫保護(hù)特性。即便同一基因缺失，不同菌株其交叉保護(hù)特性也可能不同，如多殺性巴氏桿菌X-73株(血清型A:1)的基因缺失株就沒(méi)有交叉保護(hù)特性，本研究中，PmCQ2菌株基因缺失株的交叉保護(hù)作用，不僅體現(xiàn)在針對(duì)同源莢膜A型菌株，還針對(duì)同源莢膜B型和F型菌株及異源A型菌株，這與所報(bào)道的基因缺失株僅針對(duì)同源A型菌株保護(hù)不同，PmCQ2株基因缺失株表現(xiàn)出更強(qiáng)的交叉免疫保護(hù)特性。PmCQ2菌株基因缺失所表現(xiàn)出的交叉免疫保護(hù)特性，是否在其他菌株中同樣存在，這需進(jìn)一步研究，但也可能與基因一樣，基因缺失賦予不同菌株不同的免疫保護(hù)特性。

自然選擇致使菌株具有各自的獨(dú)特性，包括其致病性、生長(zhǎng)繁殖、抗逆性及免疫保護(hù)等，細(xì)胞組成結(jié)構(gòu)的差異與其獨(dú)特性密切相關(guān)。從免疫保護(hù)角度來(lái)看，同一菌株，不同培養(yǎng)條件，其免疫保護(hù)性可能會(huì)出現(xiàn)顯著差異，采用限鐵性培養(yǎng)基培養(yǎng)，多殺性巴氏桿菌菌株的免疫保護(hù)性會(huì)顯著增強(qiáng)，不同培養(yǎng)條件導(dǎo)致的細(xì)胞組成成分表達(dá)差異是其關(guān)鍵原因?；蛉笔?，改變了細(xì)菌原有基因表達(dá)模式，部分性狀會(huì)隨之改變。多殺性巴氏桿菌PmCQ2 菌株基因的缺失，導(dǎo)致了部分莢膜合成轉(zhuǎn)運(yùn)基因及毒力相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，同時(shí)也導(dǎo)致了菌株眾多外膜蛋白基因(、、、、、、、、、、、、、、、、、2等)的表達(dá)顯著上調(diào)，相關(guān)基因表達(dá)的變化，致使菌株在莢膜、毒力、菌落形態(tài)及免疫保護(hù)性等性狀方面發(fā)生了顯著變化。那么莢膜缺失是否與Δ的交叉免疫保護(hù)特性有關(guān)呢？在本研究中，答案是肯定的。但是否缺失了莢膜的菌株都會(huì)表現(xiàn)出交叉保護(hù)特性呢？情況卻未必。莢膜位于細(xì)胞最外層，具有抗逆抗吞噬作用，是病原非常重要的毒力因子，Boyce和Adler發(fā)現(xiàn)，多殺性巴氏桿菌莢膜缺失會(huì)導(dǎo)致菌株毒力顯著下調(diào)，也可賦予菌株較強(qiáng)的免疫保護(hù)特性，但不同基因?qū)е碌那v膜缺失，各菌株卻表現(xiàn)出了不同的免疫保護(hù)特性，與基因缺失均可導(dǎo)致B型多殺性巴氏桿菌的莢膜缺失，但其缺失株免疫保護(hù)特性卻出現(xiàn)顯著差異。基因的缺失導(dǎo)致菌株莢膜缺失，賦予了菌株較強(qiáng)的交叉免疫保護(hù)特性，而同樣是野生株P(guān)mCQ2，其0442基因缺失也導(dǎo)致菌株莢膜的缺失，卻并沒(méi)有賦予菌株交叉保護(hù)特性，同樣，實(shí)驗(yàn)室分離的一株因基因的點(diǎn)突變導(dǎo)致的莢膜天然缺失的多殺性巴氏桿菌PmCQ6株，其交叉保護(hù)性也較弱。由此可以看出，多殺性巴氏桿菌莢膜缺失與菌株免疫保護(hù)特性并無(wú)必然相關(guān)性，同時(shí)，莢膜多糖的大量存在，也可能會(huì)限制相關(guān)保護(hù)性抗原的免疫作用。Δ中如PlpB、PlpE、OmpH和OmpW等與免疫保護(hù)相關(guān)的外膜蛋白表達(dá)上調(diào)及莢膜多糖含量的減少，可能是其具有較強(qiáng)交叉免疫保護(hù)作用的關(guān)鍵。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建牛源A型多殺性巴氏桿菌CQ2株(PmCQ2)莢膜合成基因缺失株Δ和其回補(bǔ)株C-，初步證實(shí)了基因能夠調(diào)控PmCQ2株的莢膜生成、生物膜形成、生長(zhǎng)繁殖及毒力等生物性狀，基因的缺失賦予了菌株較強(qiáng)的交叉免疫保護(hù)特性，為多殺性巴氏桿菌通用型疫苗研究提供了參考依據(jù)。