吳立婷，劉半紅,2，田 源,3，王 娟，包紅朵，周 艷，龐茂達，王 冉，張 輝*

(1.江蘇省農業(yè)科學院農產品質量安全與營養(yǎng)研究所，江蘇省食品質量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，南京 210014； 2.陜西科技大學食品與生物工程學院，西安 710021;3.江蘇大學食品與生物工程學院,鎮(zhèn)江 212013； 4.西北農林科技大學，楊凌 712100)

產氣莢膜梭菌(，)是一種革蘭陽性厭氧菌，通常存在于人和動物的腸道中，是一種重要的人畜共患病原菌。生肉及其制品在加工過程中可能會被污染而引起人的氣性壞疽、食物中毒、胃腸紊亂、肝腎損害等疾病。該菌可分泌多種毒素，目前，已報道有17種以上，根據(jù)其分泌的主要致病毒素(α、β、ε、ι)不同可分成A、B、C、D、E共5個類型。其中，A型可分泌α毒素，B型可分泌α、β和ε 3種毒素，C型可分泌α和β2種毒素，D型可分泌α和ε2種毒素，E型可分泌α和ι2種毒素。A型是引起雞壞死性腸炎(necrotic enteritis，NE)的主要病原菌, 然而細菌耐藥及抗生素殘留問題日益突出，抗生素作為生長促進劑(antimicrobial growth promoters，AGP)被限制、禁止，從而導致全球范圍內雞NE的發(fā)病率顯著上升。雞感染后，會出現(xiàn)腸道黏膜慢性損傷，采食量降低、體重下降、腹瀉等癥狀，料重比升高，產蛋量下降，甚至死亡，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。因此，亟需有效的防控細菌性疾病手段和途徑。

噬菌體是一類能夠感染細菌、支原體、螺旋體、放線菌以及藍細菌等的病毒，亦稱為細菌病毒。其廣泛存在于水體、土壤，具有繁殖速度快且容易分離等特點，成為潛在的防控細菌性疾病的候選。噬菌體高度特異，不影響其他菌群；高效且無需反復多次給藥；安全無副作用，不會出現(xiàn)抗生素治療常見的過敏反應和繼發(fā)感染，同時不會殘留在機體內，污染環(huán)境等優(yōu)勢，目前，已廣泛用于食品、醫(yī)療及農業(yè)領域。本研究針對禽養(yǎng)殖行業(yè)和加工環(huán)境中持續(xù)存在且難以解決的污染進行了噬菌體的分離鑒定并明晰其作用特性，以期能夠用于養(yǎng)殖領域。

1 材料與方法

1.1 Cp菌種來源

菌株CMCC64722及43株不同地區(qū)養(yǎng)殖場禽源分離株(表1)均由江蘇省食品質量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地保存和鑒定。通過厭氧肉湯培養(yǎng)基(含皰肉牛肉粒、石蠟油)，40 ℃ 厭氧培養(yǎng)18～24 h。

1.2 Cp噬菌體分離鑒定

針對山東地區(qū)某養(yǎng)殖場肉雞腸道組織樣品，以CMCC 64722為宿主菌進行噬菌體分離。將采集到的病死雞腸道組織勻漿后，用0.1%緩沖蛋白胨水懸浮，靜置過夜，取上清液，5 000×離心20 min，再收集上清液，用0.22 μm微孔濾器過濾。取上述濾液1 mL加入5 mL LB培養(yǎng)液，再加入1 mL對數(shù)期 (OD=0.6) 宿主菌懸液，室溫靜置20 min，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，過濾后得到噬菌體原液。通過點滴法進行驗證：取100 μL宿主菌懸液與0.6% LB混勻后傾注在LB底層平板上，晾干，滴加噬菌體原液5 μL，同時滴加等量LB培養(yǎng)液作為陰性對照，室溫放置5 min，干燥后，37 ℃厭氧培養(yǎng)12 h，觀察噬菌斑。

1.3 Cp噬菌體電鏡形態(tài)觀察

取純化后的噬菌體懸液7 μL(>10PFU·mL)滴至銅網(wǎng)上吸附30 min，使用2%磷鎢酸(phosphotungstic acid，PTA)負染10 min，室溫干燥后，用透射電子顯微鏡觀察并拍攝噬菌體的形態(tài)，同時測量頭部直徑、尾部長度。

1.4 Cp噬菌體外體抗菌活性

分別取1 mL對數(shù)生長期的宿主菌CMCC 64722與1 mL 10PFU·mL的噬菌體懸液混勻，靜置孵育20 min，加入5 mL 厭氧肉干湯，OD調至0.3左右，設置細菌CMCC 64722對照組，于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6 h讀取OD值。

1.5 Cp噬菌體裂解譜

取凍存的43株分離株，挑取單菌落于5 mL厭氧肉湯中，37 ℃厭氧培養(yǎng)。分別取400 μL菌懸液與0.6% LB混勻后傾注在LB底層平板上，待吸收干燥后，滴加10 μL噬菌體裂解液，待吸收后，于37 ℃厭氧培養(yǎng)過夜，次日觀察細菌和噬菌斑的生長情況。對各細菌的裂解情況進行統(tǒng)計，分析裂解譜。

1.6 Cp噬菌體一步生長曲線

將噬菌體和宿主菌按照感染復數(shù)為10的比例混合，將混合物置于37 ℃ 培養(yǎng)箱孵育15 min，使噬菌體與宿主菌充分吸附，將混合物以10 000×離心2 min，去除上清，將沉淀用厭氧肉湯液體重懸并加至10 mL厭氧肉湯液中，37 ℃、200 r·min搖床振蕩培養(yǎng)。每隔10 min取上清，直至120 min，利用雙層平板法測定噬菌體效價，重復3次。以時間為橫坐標，噬菌體效價的對數(shù)值為縱坐標繪制一步生長曲線，并計算爆發(fā)量。爆發(fā)量=爆發(fā)末期噬菌體數(shù)目/感染初期宿主菌數(shù)目。

1.7 Cp噬菌體最佳感染復數(shù)(MOI)

取對數(shù)期宿主菌，按MOI 1 000、100、10、1、0.1、0.01、0.001加入噬菌體，37 ℃、150 r·min振蕩培養(yǎng)5 h，10 000×、4 ℃離心10 min，取上清，測定各組噬菌體效價。重復3次，各試驗組中效價最高的感染復數(shù)即為最佳感染復數(shù)。

1.8 Cp噬菌體pH及熱穩(wěn)定性

使用濃鹽酸或氫氧化鈉溶液將PBS緩沖液調整至pH為2～13，取100 μL噬菌體滴加到900 μL不同pH的PBS緩沖液中，37 ℃ 孵育培養(yǎng)2 h后，利用雙層平板法測定不同pH條件作用的噬菌體效價。

取噬菌體液(1×10PFU·mL)置于溫度為30、40、50、60和70 ℃ 的水浴鍋內，孵育培養(yǎng)，并于30和60 min分別取樣100 μL，利用雙層平板法測定其效價。

1.9 Cp噬菌體全基因組測序及生物信息學分析

參照 High Pure Viral DNA Kit 說明書步驟提取噬菌體基因組。采用全基因組鳥槍法(whole genome shotgun，WGS)策略，構建不同插入片段的文庫，利用第二代測序技術(nextGeneration sequencing，NGS)，基于Illumina NovaSeq測序平臺，對這些文庫進行末端(paired-end，PE)測序。使用ABSS(http://www.bcgsc.ca/platform/software/abyss)和GapCloser(https://sourceforge.net/projects/soapdenovo2/files/GapCloser/)軟件拼接全基因組序列，RAST在線數(shù)據(jù)庫(https://rast.nmpdr.org/)注釋全基因組序列，所有的開放閱讀框使用BLASTp (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在線比對確定基因功能。采用MEGA20.0 軟件中neighbor-joining方法對噬菌體進行進化分析。

1.10 Cp噬菌體模擬環(huán)境減菌應用

將超凈工作臺 (840 cm×700 cm×540 cm) 紫外線殺菌1 h后進行環(huán)境模擬噴灑噬菌體，采用5 mL無菌噴霧小瓶，在超凈工作臺內設置5個檢測點，編號為A、B、C、D、E (分別位于工作臺四角及中心)，每個檢測點分別放置3個無蓋的含有D-環(huán)絲氨酸的LB固體平板。在距離臺面40 cm的高度，均勻噴灑細菌及噬菌體；其中，對照組中僅噴灑5 mL CMCC64722(1×10CFU·mL)宿主菌，而試驗組噴灑5 mL宿主菌，于5 min后，再次噴灑5 mL噬菌體SD72 (1×10PFU·mL)。在噴灑后，室溫作用0.5、1、2 h，利用雙層平板法將0.6% LB傾注于LB(含D-環(huán)絲氨酸)底層平板上，加蓋取出平板，并置于37 ℃ 厭氧箱過夜培養(yǎng)，檢測菌落數(shù)量，重復試驗3次。

2 結 果

2.1 Cp噬菌體分離與鑒定分析

以CMCC 64722為宿主菌，從雞養(yǎng)殖場中的病死雞體內分離到1株噬菌體vB_CpeS_SD72(簡稱SD72)，經(jīng)純化后觀察到清晰的噬菌斑，直徑約0.5 mm，呈透明、針尖、無暈圈(圖1)。透射電鏡觀察顯示(圖2)，該噬菌體具有典型的二十面體頭部結構，直徑約(50±1)nm，尾部長度約(150±1)nm。根據(jù)國際病毒分類委員會(ICTV)第九次報告的病毒分類系統(tǒng)，噬菌體SD72在分類上可能屬于尾病毒目()長尾病毒科()。

圖1 vB_CpeS_SD72 噬菌斑形態(tài)Fig.1 Plaques of phage vB_CpeS_SD72

圖2 噬菌體vB_CpeS_SD72 電鏡圖Fig.2 Transmission electron microscopy of phage vB_CpeS_SD72

2.2 Cp噬菌體裂解活性及裂解譜分析

由圖3可知，SD72噬菌體體外裂解效果良好，在作用的前2.5 h有一定抑菌效果，此后至6 h其OD值降至0.2，與宿主菌對照呈顯著性差異且菌液顯著澄清。

圖3 噬菌體vB_CpeS_SD72體外抗菌活性Fig.3 In vitro antibacterial activity of phage vB_CpeS_SD72

由表1可知，噬菌體SD72對43株不同組織來源的A型呈現(xiàn)不同的裂解效果，對36株菌能夠被SD72完全裂解，形成清晰且透亮的噬菌斑，裂解率為83.72%。

表1 噬菌體vB_CpeS_SD72宿主譜測定Table 1 Results of phage vB_CpeS_SD72 host spectrum determination

(續(xù)表1 Continued)

2.3 Cp噬菌體一步生長曲線

由圖4可知，噬菌體SD72的潛伏期為20 min，噬菌體持續(xù)增加，此階段為噬菌體胞外吸附和感染階段，在20～100 min 時，噬菌體通過其特有的裂解系統(tǒng)裂解宿主菌，導致大量的子代噬菌體釋放，噬菌體的效價呈指數(shù)增加，是噬菌體的裂解期。100～120 min，噬菌體效價趨于平穩(wěn)，此階段噬菌體完成了噬菌體的裂解周期，釋放的噬菌體量達到了最高值，爆發(fā)生長量為28.5 PFU·cell。

圖4 噬菌體vB_CpeS_SD72的一步生長曲線Fig.4 One-step growth curve of phage vB_CpeS_SD72

2.4 Cp噬菌體MOI測定結果分析

當感染復數(shù)為0.01時，噬菌體SD72釋放的子代噬菌體數(shù)量最多，高達1.02×10PFU·mL，其效價為所有感染復數(shù)中最高值，是噬菌體SD72的最佳感染復數(shù)(圖5)。

圖5 噬菌體vB_CpeS_SD72 MOIFig.5 MOI of phage vB_CpeS_SD72

2.5 Cp噬菌體pH及熱穩(wěn)定性分析

噬菌體SD72在pH 3～12的條件下無顯著性變化(圖6)，能夠維持較高活力，表明對pH的耐受范圍較廣，其在pH為8左右時侵染能力仍不受影響，pH分別為3和12時，效價均可維持在90%以上，具有較強的酸堿適應能力。

圖6 噬菌體vB_CpeS_SD72 pH穩(wěn)定性Fig.6 pH stability of phage vB_CpeS_SD72

噬菌體SD72置于不同溫度(30、40、50、60、70 ℃)下60 min后測定噬菌體的效價變化(圖7)。結果表明，噬菌體vB_CpeS_SD72的生物學活性在30～50 ℃的溫度比較穩(wěn)定，當溫度升高至50 ℃以上時噬菌體的效價有下降趨勢，但仍能夠大量存活，70 ℃水浴處理1 h后，噬菌體SD72效價降低至0, 完全失活。表明該噬菌體在一定溫度(30～50 ℃)下可保持良好的熱穩(wěn)定性，能夠耐受高溫環(huán)境，易于保存。

圖7 噬菌體vB_CpeS_SD72 熱穩(wěn)定性Fig.7 The thermal stability curve of vB_CpeS_SD72

2.6 Cp噬菌體全基因組分析

全基因組測序結果分析表明(圖8)，vB_CpeS_SD72基因組為線性雙鏈DNA，全長41 590 bp，GC含量為28.46 %，平均基因長度為645 bp，未檢測到耐藥基因、毒力基因及tRNA。vB_CpeS_SD72共注釋得到59個開放閱讀框 (open reading frame，ORF)，其中，33個ORF與數(shù)據(jù)庫中已公開的功能蛋白有較高相似性(表2)，其他26個ORF注釋為功能未知的假定蛋白。此外，在基因組中未發(fā)現(xiàn)編碼阻遏蛋白、整合酶等與溶源性相關的序列或基因。從基因組結構上分析，預測包裝模塊：末端酶小亞基 (ORF58，terminase small subunit)、尾部蛋白(ORF34，tail component protein)、原頭蛋白酶(ORF53，the prohead protease)、主要衣殼蛋白(ORF44、ORF55，major capsid protein)，該噬菌體基因組中未發(fā)現(xiàn)末端酶大亞基序列。預測 ORF28穿孔素(holin)是關于裂解細菌的蛋白，導致細胞質膜電位的崩潰和膜的通透性改變。預測ORF12(single-stranded DNA-binding protein)、ORF1、ORF59(DNA-invertase)ORF2(site-specific recombinase)是參與噬菌體復制與調節(jié)的蛋白，包括DNA 結合酶、DNA轉化酶、重組酶。為探究噬菌體SD72與其他噬菌體的進化關系，選擇ORF58末端酶小亞基蛋白進行系統(tǒng)進化樹的構建。從基于小亞基終止酶構建的系統(tǒng)進化樹可以看出(圖9)，噬菌體SD72與phage vB CpeS-CP51在同一分支，親緣關系較近，后者在分類上也同樣屬于長尾噬菌體科。綜上所述，噬菌體SD72在分類上應歸屬有尾噬菌體目長尾噬菌體科。

表2 噬菌體vB_CpeS_SD72 ORF功能分析Table 2 ORFs function analysis of phage vB_CpeS_SD72

掃描文章首頁OSID碼可查看彩圖The color picture can be found by scanning the OSID code on the front page of the article圖8 噬菌體vB_CpeS_SD72全基因組結構示意圖Fig.8 Schematic diagram of the whole genome structure of phagevB_CpeS_SD72

圖9 基于噬菌體末端酶小亞基蛋白序列的系統(tǒng)進化樹Fig.9 Phylogenetic tree of phagesterminase small subunit

2.7 Cp噬菌體環(huán)境消減應用效果分析

與細菌對照組CMCC64722相比(圖10)，在噴灑噬菌體SD72作用0.5 h后，細菌CMCC64722數(shù)即從900 CFU(檢測點平均值)降至14.8 CFU(檢測點平均值)，抑菌效率可達98.36%，能有效抑制細菌生長，起到一定的滅菌作用。噬菌體SD72作用1和2 h后，存活的CMCC64722的數(shù)量接近于0，抑菌效率為99.60%。由此可知，0.5 h內SD72可快速高效抑菌，在1～2 h內能達到幾乎清除的效果。

圖10 噬菌體vB_CpeS_SD72的噴霧滅菌時間分析Fig.10 Bactericidal efficiency of phage vB_CpeS_SD72 spraying based on time

3 討 論

隨著新冠疫情影響趨緩，經(jīng)濟逐步復蘇，美國農業(yè)部(USDA，https://www.ers.usda. gov /data-products/livestock-and-meat-international-trade-data/)報告分析稱，全球經(jīng)濟復蘇將推動雞肉需求溫和增長，2021年，全球雞肉產量達到創(chuàng)紀錄的1.021億t，美國雞肉零售量和年產量位居肉類產品最高，而中國緊隨其后成為全球第二大雞肉消費國。為了滿足全球人口動物性食品需求的增量，在規(guī)模化食用動物養(yǎng)殖中會添加預防劑量的抗生素以提升生產量，但隨之引發(fā)了腸道菌耐藥性加劇，部分人畜共患病原菌已出現(xiàn)嚴重的多重耐藥性。在歐美國家，由于抗生素的限制性使用，引起的NE發(fā)病率呈上升趨勢(10%～50%)，在我國禁抗時代的到來，的感染也將會給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成經(jīng)濟損失。

噬菌體來源于環(huán)境，能夠特異性對抗細菌且不影響正常菌群，從而受到研究人員及藥品研發(fā)企業(yè)的高度關注。應用噬菌體控制可以在養(yǎng)殖過程中也可以在屠宰加工環(huán)節(jié)。目前，針對噬菌體的相關研究較少，在國際報道中，Seal等從肉雞內臟和家禽糞便中分離獲得噬菌體ΦCP39O和ΦCP26F，兩種噬菌體均有直徑57 nm的對稱頭部，100 nm的非收縮尾，具有尾病毒目成員的特征。俄羅斯聯(lián)邦莫斯科地區(qū)分離到1株強毒短尾噬菌體ΦCPV1及2株短尾噬菌體，即ΦCPV4和ΦZP2，與美國東南部分離出噬菌體ΦCP7R密切相關。Bae等從養(yǎng)雞場的糞便樣本中分離出噬菌體4CJ22，降低了肉雞腸道中載菌量。Morales等從一個廢物處理廠的原始污水中分離出噬菌體ΦCP24R，并對A型具有裂解活性。Volozhantsev等從禽養(yǎng)殖場污水、糞便和肉雞腸道內容物中分離出烈性噬菌體CPV1，為雙鏈DNA，基因組為 16 747 bp，包含22個開放閱讀框。在國內，僅有于旭磊從養(yǎng)殖場污水、糞便等分離純化 2株具有高裂解率噬菌體CPYS4和CPYS48。

本研究分離獲得1株源于禽腸道的新型烈性噬菌體，該噬菌體屬于長尾病毒科，潛伏期短，爆發(fā)量大，在pH為3～12的環(huán)境下具有良好的活力，從而能夠適應腸道環(huán)境提升其應用潛力；此外，其對溫度也能夠有良好的耐受特性，在50 ℃ 仍能夠維持高效價。噬菌體SD72的潛伏期為20 min，在100～120 min，噬菌體效價趨于平穩(wěn)，在制備噬菌體制劑時具有一定的時間優(yōu)勢。噬菌體具有相對較廣的裂解范圍，裂解率高達83.72%，表明SD72是1株強裂解性噬菌體。由此可見，噬菌體SD72作為一種有效、穩(wěn)定和特異的生物抑菌劑，在預防治療感染方面有著較為廣闊的應用前景和研究意義。

基因組分析表明，SD72呈線性雙鏈DNA，基因組全長約為41 590 bp，與大多數(shù)噬菌體基因組相比較大。SD72與vB CpeS-CP51噬菌體全基因組相似性為98.22%， ORF49預測為假定噬菌體蛋白，與vB CpeS-CP51相似性高達79.1%，相關研究針對vB CpeS-CP51進行裂解酶表達，其抑菌效果顯著。ORF26預測SD72基因組中包含溶菌酶功能蛋白，與phage phiSM101噬菌體具有一定的相似性。預測 ORF28 (holin)穿孔素是關于裂解細菌的蛋白，因此SD72 被鑒定為一株烈性噬菌體，不具備溶原特性，具有安全性，可以作為一種生物制劑在多領域中應用。

由于是以產孢子的形式存活于自然環(huán)境中，不易被殺滅，因此對畜禽養(yǎng)殖及食品生產加工環(huán)境構成一定威脅。先前已有將噬菌體以噴霧的方式用于控制養(yǎng)殖環(huán)境中的致病菌的報道。此外，噬菌體因其特異高效等特點被認為是對抗致病菌的重要武器，在食品中應用不影響最終產品的感官特性。例如，單核增生李斯特菌噬菌體P100用于奶酪中并不影響奶酪中的功能性乳酸菌，也不會改變食品特性。國外市售的產品，ListShield(含有單核增生李斯特菌噬菌體的混合物)，應用后不會影響預烤火雞胸肉、熟火腿、博隆尼亞肉和烤牛肉的感官特性(包括味道、視覺和嗅覺)。目前，噬菌體被食品加工廠靶向用于許多病原體，如沙門菌、大腸桿菌O157：H7、志賀菌、產氣莢膜梭菌等。本研究中，SD72以高濃度作用于模擬環(huán)境控制的污染，在室溫作用1～2 h能夠有效抑制，減除率高達99.60%，有效降低在環(huán)境中的污染風險。

4 結 論

本研究分離獲得1株新型的噬菌體vB_CpeS_SD72，該噬菌體潛伏期短，耐酸堿及高溫，具有較寬的裂解譜，在環(huán)境消減的應用中顯示其高效的控制污染潛力，為畜禽健康養(yǎng)殖和降低食品加工環(huán)境中污染風險，保障畜禽肉品安全提供新的抑菌參考策略。