肖 園，呂艷麗,2*，孫艷爭,2*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院，北京 100193； 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

犬呼吸道冠狀病毒(canine respiratory coronavirus，CRCoV)首次發(fā)現(xiàn)于2003年英國的某家大型流浪動物中心，CRCoV與犬腸道冠狀病毒(canine coronavirus，CCoV，屬于α冠狀病毒屬)的同源性低(在穩(wěn)定的聚合酶基因上的核苷酸相似性僅為69%，而在可變區(qū)的氨基酸序列相似性僅為21%)，但與牛冠狀病毒同源性很高(90%以上)，因此被歸類于β冠狀病毒屬。CRCoV主要侵害犬的呼吸道，尤其是咽扁桃體和氣管。單獨感染通常只引起輕度的呼吸道癥狀，如噴嚏、鼻流分泌物和干咳等。免疫力強的犬也可能表現(xiàn)為無呼吸道癥狀。該病的潛伏期為6～10 d，感染后6 d可通過口咽途徑排毒。迄今為止，尚無針對CRCoV感染的特異性療法及針對該病毒的疫苗。

CRCoV在全球范圍內(nèi)多個國家和地區(qū)廣泛流行，但國內(nèi)的流行性研究報道較少。臨床上，CRCoV還可與其他呼吸道病原體發(fā)生混合感染，這可能對犬類造成較為嚴重的健康威脅。本研究對CRCoV進行流行病學(xué)、致病特點等方面的調(diào)查，以期對CRCoV有更為深入的了解，從而有利于對犬傳染性呼吸道疾病進行防治，保障動物健康。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2015年12月—2017年3月，于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院收集的487份犬咽鼻拭子。

病毒基因組DNA/RNA快速提取試劑盒II購自北京艾德萊生物科技有限公司。AMV reverse transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑購自Promega公司(USA)。2×Taq PCR MasterMix試劑購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司。瓊脂糖購自 Biowest(西班牙)。Goldview核酸染料購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司。PCR引物及PCR產(chǎn)物序列測定由三博生物工程技術(shù)有限公司完成。采用PrimerPremier 5.0軟件設(shè)計引物。

1.2 試驗方法

1.2.1 CRCoV RT-PCR檢測方法的建立和臨床樣本的檢測 ①引物：選擇Erles 等檢測CRCoV所使用的巢式引物，經(jīng)生物學(xué)軟件Primer評估合格后進行合成。擴增序列位于基因，引物序列及擴增片段長度見表1。②核酸提取及PCR擴增：按照RNA提取試劑盒說明提取鼻咽拭子樣本中的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑進行RNA反轉(zhuǎn)錄，然后利用巢式PCR檢測方法對CRCoV目的片段進行特異性擴增。擴增分為兩步，第一步以反轉(zhuǎn)錄獲得的DNA為模板，使用外圍引物(CRCoV NO-up, CRCoV NO-down)進行CRCoV特異性PCR擴增；第二步以上述PCR產(chǎn)物為模板，用內(nèi)圍引物(CRCoV NI-up, CRCoV NI-down)進行CRCoV特異性PCR擴增。③凝膠電泳及成像：將PCR擴增產(chǎn)物加入1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，利用SIM成像系統(tǒng)進行觀察，保存圖像并記錄試驗結(jié)果。將陽性擴增產(chǎn)物送至三博生物工程技術(shù)有限公司進行進行序列測定和分析，并將測序鑒定結(jié)果為CRCoV陽性的樣本于-20 ℃保存，作為陽性質(zhì)控。

表1 CRCoV檢測用PCR引物Table 1 PCR primer for detecting CRCoV

此CRCoV巢式PCR方法驗證成功后，收集有或無臨床癥狀的臨床樣本進行CRCoV檢測并記錄檢測結(jié)果，用于后續(xù)分析。

1.2.2 犬腺病毒II型、犬副流感病毒和犬瘟熱病毒PCR/RT-PCR檢測 采用本實驗室已經(jīng)建立的犬腺病毒II型(canine adenovirus type 2，CAV-2)、犬副流感病毒(canine parainfluenza virus，CPIV)和犬瘟熱病毒(canine distemper virus，CDV)的PCR/RT-PCR檢測方法對部分樣本進行檢測，所用引物見表2。陽性質(zhì)控品為碩騰衛(wèi)佳伍疫苗。CPIV、CAV-2和CDV的檢測用引物序列及擴增片段長度見表2。

表2 CPIV、CAV-2、CDV檢測用PCR引物Table 2 PCR primer for detecting CPIV, CAV-2, CDV

1.2.3 統(tǒng)計分析 利用Microsoft Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)錄入、整理和分析。本試驗中涉及的分類資料間的差異性情況通過卡方檢驗進行比較，通過回歸統(tǒng)計對CRCoV感染率與年齡的關(guān)系進行分析。<0.05表示差異顯著，<0.01差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 驗證CRCoV檢測方法的特異性及穩(wěn)定性

對臨床樣本進行CRCoV盲測，部分樣品擴增后電泳得到了預(yù)期大小的目的條帶，圖1為盲測的CRCoV陽性樣本電泳圖。

1. CRCoV第一輪擴增結(jié)果；2. CRCoV第二輪結(jié)果；N.陰性對照；M. DNA相對分子質(zhì)量標準1. CRCoV first round; 2. CRCoV second round; N. Negative control; M. DNA molecular weight marker圖1 CRCoV陽性樣本PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR results of CRCoV-positive samples

將3個不同時間內(nèi)獲得的CRCoV陽性擴增產(chǎn)物進行核苷酸測序，測序結(jié)果在Nucleotide BLAST上比對，發(fā)現(xiàn)第一輪和第二輪擴增條帶的核苷酸序列與已知的CRCoV毒株及牛冠狀病毒毒株的符合率均在96%以上，而與CCoV毒株的符合率均低于50%。這與國外研究結(jié)論相同，可表明該CRCoV的檢測方法特異性高。對碩騰衛(wèi)佳伍疫苗(含CPIV、CAV-2、CDV)及臨床中獲得的CCoV陽性糞便樣本進行CRCoV RT-PCR檢測，結(jié)果為陰性，說明CRCoV可被特異檢出。

用所設(shè)計的PCR方法對5個CRCoV陽性樣本各進行3次重復(fù)性試驗，均擴增出相應(yīng)目的條帶，無其他雜帶，說明該引物和該方法穩(wěn)定性良好，可長期使用。

2.2 CRCoV、CPIV、CAV-2、CDV檢出情況

對所有487份樣品進行CRCoV巢式RT-PCR檢測，其中有104份檢出陽性，陽性率為21.36%；對2016年6月―2017年3月的321份樣品進行CPIV RT-PCR檢測，其中50份檢出陽性，陽性率15.58%；對2016年11月―2017年3月的156份樣品進行CDV RT-PCR檢測，其中22份檢出陽性，陽性率14.10%；對2016年11月―2017年3月的156份樣品進行CAV-2 PCR檢測，其中4份檢出陽性，陽性率2.56%(表3)。

表3 CRCoV、CPIV、CAV-2、CDV檢出情況Table 3 The detection of CRCoV, CPIV, CAV-2, CDV

CRCoV、CPIV混合感染的樣本數(shù)為11，CRCoV、CAV-2混合感染的樣本數(shù)為0，CRCoV、CDV混合感染的樣本數(shù)為6。CRCoV與CPIV、CAV-2、CDV的混合感染率分別為3.43%(11/321)、0%(0/156)和3.85%(6/156)。

2.3 CRCoV流行趨勢

2015年12月—2017年3月病毒檢出情況見圖2。整體而言，CRCoV在2015年末和2016年初的檢出率較高，隨著氣候變暖，檢出率逐漸下降(除7月份的檢出率較高)，在2016年11月氣候轉(zhuǎn)冷時又有上升趨勢。

圖2 2015年12月―2017年3月各月份CRCoV檢出率Fig.2 Positive rate of CRCoV from December 2015 to March 2017

2.4 CRCoV感染與犬年齡的相關(guān)性

在所有已檢測CRCoV的樣本中，有454份有年齡記錄，年齡跨度為1月齡～15歲，感染犬的年齡跨度為2月齡～12歲。犬的體況和免疫力隨年齡增長有一定變化規(guī)律，根據(jù)這種變化規(guī)律進行年齡段劃分，每個分段均有CRCoV陽性犬分布。各年齡段犬感染CRCoV的情況見表4?；貧w統(tǒng)計結(jié)果顯示，犬的年齡與CRCoV感染之間無顯著性趨勢；卡方檢驗各年齡段間檢出率無顯著差異(>0.05)。

表4 各年齡段犬CRCoV檢出情況Table 4 The detection of CRCoV in dogs of different ages

2.5 CRCoV感染犬的呼吸道癥狀

在呼吸道癥狀記錄完整的455例樣本中，有96例檢出CRCoV陽性。在這些CRCoV陽性犬中，無呼吸道癥狀的有31例，占所有無呼吸道癥狀犬(455例樣本中無呼吸道癥狀的有114例)的27.19%(31/114)；呈現(xiàn)輕度呼吸道癥狀(鼻液、咳嗽)的有59例，占所有輕度呼吸道癥狀犬的19.73%(59/299)；呈現(xiàn)中至重度呼吸道癥狀(肺炎)的有6例，占所有中至重度呼吸道癥狀犬的14.29%(6/42)(表5)。

表5 CRCoV感染犬的呼吸道癥狀嚴重程度分布情況Table 5 Severity distribution of respiratory symptoms in CRCoV-infected dogs

2016年11月—2017年3月，對156例樣本進行了CRCoV、CPIV、CDV和CAV-2檢測。在這156例中，呼吸道癥狀記錄完整的有146例。在呈現(xiàn)無呼吸道癥狀的39只犬中，有8例為CRCoV陽性，此8例中有1例混合感染CPIV，混合感染率12.50%(1/8)；在呈現(xiàn)輕度呼吸道癥狀的97只犬中，有17例為CRCoV陽性，此17例中有5例混合感染CPIV，2例混合感染CDV，混合感染率41.18%(7/17)；在呈現(xiàn)中至重度呼吸道癥狀的10只犬中，有2例為CRCoV陽性，此2例均混合感染CDV，混合感染率100.00%(2/2)(表6)。發(fā)生呼吸道病毒(CPIV、CDV、CAV-2)混合感染的CRCoV感染犬的無呼吸道癥狀發(fā)生率、輕度呼吸道癥狀發(fā)生率以及中至重度呼吸道癥狀的發(fā)生率分別為10.00%(1/10)、70.00%(7/10)和20.00%(2/10)(表6)。

表6 2016年11月—2017年3月CRCoV感染犬的呼吸道癥狀嚴重程度分布情況及混合感染情況Table 6 Distribution of respiratory symptom severity and mixed infection in CRCoV-infected dogs from November 2016 to March 2017

3 討 論

3.1 CRCoV流行病學(xué)概況

一般來說，與人類一樣，犬呼吸道疾病在冬春季更易流行，尤其是在北方地區(qū)。如圖2所示，CRCoV檢出率的整體趨勢大致符合上述規(guī)律，但氣候炎熱的2016年7月份的檢出率比冬季的檢出率還高，這與部分地區(qū)人流感夏季暴發(fā)的情況相似，可能是室內(nèi)空調(diào)使用過度導(dǎo)致，也可能和夏季氣溫高、體能消耗大，犬發(fā)生應(yīng)激相關(guān)。

各年齡段犬的CRCoV的感染率與年齡并無的線性關(guān)系(=0.020 2<1)，且卡方檢驗結(jié)果(=0.870 8>0.05)也表明各年齡段犬的CRCoV感染率并無差異。雖然國外文獻中提到2～8歲犬由于頻繁與外界其他犬接觸而呈現(xiàn)較高的CRCoV血清抗體陽性率，但病毒陽性率與血清抗體陽性率是兩個不同概念。

據(jù)德國某文獻報道，在2011年7月—2012年7月，CRCoV與CPIV、CDV、CAV-2、支氣管敗血波氏桿菌的混合感染率分別為1.32%(2/151)、0%(0/151)、0%(0/151)、2.65%(4/151)。經(jīng)卡方檢驗比較，本試驗中CRCoV與CPIV、CDV、CAV-2的混合感染率與該文獻所報道的感染率無顯著差異(>0.05)，即北京地區(qū)CRCoV與CPIV、CDV、CAV-2的混合感染率和德國基本相同。

3.2 CRCoV感染犬的癥狀及CRCoV感染犬混合感染其他呼吸道病毒的癥狀分析

為研究CRCoV的致病力強弱，將CRCoV感染犬的癥狀分為三類進行分析。從表6來看，呈中至重度呼吸道癥狀的CRCoV感染犬有100.00%混合感染了其他呼吸道病毒，且這2例犬均混合感染了致病力強的CDV，故不能說明CRCoV致病力強。而呈無呼吸道癥狀和輕度呼吸道癥狀的CRCoV感染犬的混合感染率相對較低，分別為12.50%(1/8)和41.18%(7/17)，且所有CRCoV感染犬有93.75%(90/96)表現(xiàn)無呼吸道癥狀及輕度呼吸道癥狀，無呼吸道癥狀的CRCoV感染犬占所有無呼吸道癥狀犬的比例較高(27.19%，表5)，這說明CRCoV單一感染多表現(xiàn)為無呼吸道癥狀或輕度呼吸道癥狀，CRCoV對呼吸系統(tǒng)的致病力較弱。

從表6來看，CRCoV感染混合感染其他呼吸道病毒(CPIV/CDV/CAV-2)的患犬共10只，多表現(xiàn)輕度呼吸道癥狀(70.00%)，其次是中至重度呼吸道癥狀(20.00%)，較少表現(xiàn)為無呼吸道癥狀(10.00%)。

4 結(jié) 論

北京地區(qū)CRCoV的分子流行率較高，在冬春季節(jié)更易流行，且各年齡段犬的檢出率差異不顯著。該病毒與CPIV、CAV-2、CDV的混合感染率較低。該病毒的致病力較弱，感染犬通常無呼吸道癥狀或表現(xiàn)輕度呼吸道癥狀。