李前勇，張芝金，羅怡茜，郭靈君，張德志，張余蓬，朱 瑞

（1.西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，重慶 榮昌 402460；2.重慶市獸醫(yī)工程技術(shù)研究中心，重慶 榮昌 402460；3.重慶市肉牛工程技術(shù)研究中心，重慶 榮昌 402460）

酒糟（DG）是利用谷類進(jìn)行釀酒發(fā)酵、蒸餾處理后的副產(chǎn)物，白酒、啤酒的釀造及燃料乙醇的生產(chǎn)均可產(chǎn)生酒糟［1］。我國白酒釀造歷史悠久，啤酒等各類酒精飲料產(chǎn)業(yè)興旺發(fā)達(dá)，也是世界上第三大燃料乙醇的生產(chǎn)和消費(fèi)國［2］，每年可產(chǎn)出各類酒糟1 億噸以上［3］。因酒糟中各類營養(yǎng)物質(zhì)較為豐富，用于動(dòng)物飼料比較普遍。然而，酒糟中不僅含有可利用的營養(yǎng)素，還含有乙醇、乙酸、甲醛等對(duì)動(dòng)物健康有一定傷害的物質(zhì)，可能引發(fā)的動(dòng)物酒糟中毒［4-5］。

鑒于此，本研究采用氣相色譜、高效液相色譜技術(shù)測定了國產(chǎn)濕酒糟（白酒糟、啤酒糟）中乙醇、乙酸、乳酸、甲醛等9種物質(zhì)的含量，分析其存儲(chǔ)過程中的變動(dòng)規(guī)律，并針對(duì)酒糟中乙醇、甲醛等含量較高的物質(zhì)開展拮抗物質(zhì)的體外篩選，以期獲得國產(chǎn)酒糟中常見毒性成分的具體含量數(shù)據(jù)，為預(yù)防畜禽生產(chǎn)中濕酒糟引發(fā)的動(dòng)物中毒提供參考。

1 材料與方法

1.1 酒糟樣品的采集 隨機(jī)采集川渝地區(qū)大酒廠、小酒廠鮮高梁型白酒糟（高粱渣占95%左右，糠殼及發(fā)酵菌殘?bào)w等占5%）及啤酒廠新鮮啤酒糟各35 kg，置于潔凈塑料袋內(nèi)運(yùn)回。隨機(jī)采取每種類型酒廠的酒糟10份，200 g/份，置潔凈采樣袋內(nèi)，做好標(biāo)記后-80 ℃保存?zhèn)溆?。另外，隨機(jī)采取每種類型酒廠的酒糟15份，2000g/份，置潔凈小型塑料桶內(nèi)，隨機(jī)分為三組，5 份/組，按照酒糟的塑料袋存儲(chǔ)法，將酒糟裝入干凈的專用塑料袋內(nèi)，壓實(shí)后密封，1、2、3 組分別于室溫下避光保存7、15、30 d，勿使樣品霉敗；再于各保存時(shí)間點(diǎn)按150 g/份隨機(jī)采樣10份，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器及藥品 氣相色譜儀（GC-6280），高效液相色譜分析儀（Agilent-1100），0.45 μm 濾膜（HVLP-1450），超純水系統(tǒng)（Mili-Q），電子天平（Secura125-1CN），無菌均質(zhì)器（Scientz-IIL），超聲振蕩器（KQ5200B）；磷酸（GR 級(jí)），甲醇（色譜純）、乙醇（色譜純）、戊醇（色譜純）、正丙醇（色譜純）、異戊醇（色譜純）、異丁醇（分析純）、甲醛（分析純）、乳酸（分析純）、乙酸（分析純），碳酸氫鈉（分析純）、氧化鎂（分析純）、氧化鈣（分析純）、膨潤土、腐植酸鈉（精制）、蒙脫石（K-10）、分子篩（ZSM-5）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酒糟中甲醇、乙醇、戊醇、正丙醇、異戊醇、異丁醇、甲醛含量的測定 精確稱取酒糟樣品10 g，加超純水15 mL，然后均質(zhì)粉碎，振蕩混勻后置冰水溶液中60% P（P＝400 W）超聲提取1 h；再定容至20 mL，密封，4 ℃下冷浸過夜萃取，最后10 000 r/min 離心10 min，取上清過0.45 μm 濾膜，留濾液待測。

樣品中甲醇、乙醇等7 種成分均采用GC-6280 氣相色譜儀檢測，檢測器為FID，色譜柱為DB-FFAP（30 m×0.25 mm，膜厚0.25 μm）。升溫程序?yàn)椋撼跏贾鶞?5 ℃保持8 min；8～12 min，以5 ℃/min 升至60 ℃；12～20.5 min，以20 ℃/min升溫至230 ℃；保持2 min。進(jìn)樣口溫度為230 ℃，檢測器溫度為250 ℃；載氣為高純氮?dú)?，流量?.0 mL/min；進(jìn)樣口分流比為15∶1，進(jìn)樣體積為1 μL。

取甲醇、乙醇、正丙醇、異戊醇、異丁醇標(biāo)準(zhǔn)品，均用超純水稀釋、定容至2.5、5、10、25、50、100 μg/mL 濃度，戊醇標(biāo)準(zhǔn)品稀釋、定容至3、6、12、30、60 μg/mL 濃度，甲醛標(biāo)準(zhǔn)品稀釋、定容至0.012、0.06、0.12、0.24、0.3、0.6 μg/mL 濃度，上機(jī)檢測，以峰面積為橫坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)測定液濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，運(yùn)用Excel 中的Linest 函數(shù)計(jì)算其斜率、截距、相關(guān)系數(shù)、截距標(biāo)準(zhǔn)誤，并 利用公式“檢測限（LOD）＝3.3 δ/S，定量限（LOQ）＝10δ/S”計(jì)算各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的LOD、LOQ。參照文獻(xiàn)［6］進(jìn)行甲醇、乙醇、正丙醇、戊醇、異戊醇、異丁醇、甲醛的精密度、回收率試驗(yàn)。將樣品組分測得的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，計(jì)算出待測液中相應(yīng)組分的濃度。

1.3.2 酒糟中乙酸、乳酸含量的測定 精確稱取酒糟樣品10 g，均質(zhì)機(jī)搗碎，轉(zhuǎn)移至20 mL 容量瓶內(nèi)，加入超純水15 mL，室溫避光60% P（P＝400 W）超聲提取30 min；取出，用超純水定容至20 mL，混勻，然后取上清液過0.45 μm濾膜，留濾液待測。

樣品中乙酸、乳酸均采用Agilent-1100 高效液相色譜分析儀檢測，方法參照文獻(xiàn)［7］。色譜柱為TSKgel ODS-100V（4.6 mm×250 mm×5.0 μm），流動(dòng)相為0.1%磷酸水溶液，流速為1 mL/min；紫外檢測器，檢測波長為210 nm；柱溫為40 ℃，進(jìn)樣體積20μL。

取乙酸、乳酸標(biāo)準(zhǔn)品，均精確配制4、20、32、40、64、80 μg/mL 濃度梯度，上機(jī)檢測，以峰面積為橫坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)測定液濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按“1.3.1”方法計(jì)算相關(guān)系數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的LOD、LOQ。參照文獻(xiàn)［8］進(jìn)行乙酸、乳酸測定的精密度、回收率試驗(yàn)。將樣品組分測得的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，計(jì)算出待測液中乙酸、乳酸的濃度。

1.3.3 酒糟中主要毒性成分體外拮抗物質(zhì)的篩選 取儲(chǔ)存7 d 未發(fā)霉符合質(zhì)量要求的白酒糟（濕，小廠）隨機(jī)分為18 組，第1～17 組為試驗(yàn)組，第18 組為對(duì)照組（500 g/組）。試驗(yàn)組分別在酒糟中加入1.5%碳酸氫鈉、3%膨潤土，0.5%、1%、1.5%氧化鎂，1%、3%、5%腐植酸鈉，1%、3%、5%氧化鈣，1%、3%、5%蒙脫石，1%、3%、5%分子篩，混勻后室溫作用2 h，再采集酒糟試樣（30 g/份，每個(gè)添加比例組10 個(gè)重復(fù)），置潔凈樣品袋內(nèi)，同時(shí)采集對(duì)照組樣品，-80 ℃下保存?zhèn)溆谩Ｒ勒铡?.3.1”和“1.3.2”方法測定樣品中乙醇、乙酸、乳酸、甲醛四種毒性成分的含量。

1.3.4 酒糟中水分的測定 精確稱取白酒糟、啤酒糟樣品各10份，50 g/份，采用GB 5009.3-2016《食品中水分的測定》方法測定樣品中的水分含量。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016軟件整理，計(jì)算平均值xˉ和標(biāo)準(zhǔn)偏差SD，數(shù)據(jù)以xˉ±SD表示；用SPSS 19.0 軟件的單因素方差分析、LSD 多重比較法分析試驗(yàn)組間及組內(nèi)不同物質(zhì)間平均含量的差異，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間、線性方程、相關(guān)系數(shù) 由圖1～圖3可知，9種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均得到良好的分離，且峰形較好；表1 顯示，各種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)均大于0.998，表明9種物質(zhì)在相應(yīng)的檢測方法下有良好的線性關(guān)系，可以很好地對(duì)6 種醇、甲醛、2 種酸進(jìn)行定量檢測；檢測限和定量限均能滿足試驗(yàn)要求。

表1 9種物質(zhì)的保留時(shí)間、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢測限和定量限

圖1 6種醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的氣相色譜圖

圖2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)甲醛的氣相色譜圖

圖3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)乙酸、乳酸的HPLC圖

2.2 精密度、回收率試驗(yàn) 試驗(yàn)測得9種物質(zhì)的RSD（相對(duì)偏差）范圍為0.17%～0.48%，表明試驗(yàn)所用方法有良好的精密度。

取小酒廠鮮白酒糟，分別測定甲醇等9 種物質(zhì)的本底值，再在樣品中添加2 個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行回收率試驗(yàn)，結(jié)果見表2。由表2 可知，9 種物質(zhì)兩種不同添加量的回收率在93%～102.5%之間，表明試驗(yàn)所用方法的回收率高，符合要求。

表2 9種物質(zhì)回收率的測定

2.3 鮮酒糟中9 種成分的含量 參試酒糟樣品中水分的測定結(jié)果：大廠白酒糟為67.34%±5.71%，小廠白酒糟為71.61%±7.83%，啤酒糟為83.75%±6.72%。該結(jié)果用于后續(xù)試驗(yàn)計(jì)算干酒糟各測定物質(zhì)的含量。由表3 可知，幾種鮮酒糟中9種物質(zhì)的含量各不相同，大廠的白酒糟、啤酒糟中乳酸＞乙酸＞乙醇＞甲醛（P＜0.05），甲醇和異戊醇含量均最低，正丙醇、異丁醇、戊醇均未檢出；小廠白酒糟中乳酸＞乙醇＞乙酸（P＜0.05），甲醛、異戊醇、正丙醇含量兩兩間無顯著差異（P＞0.05），但三者含量均顯著低于乙酸（P＜0.05），戊醇、甲醇含量最低（P＜0.05），異丁醇未檢出。同種物質(zhì)在不同類型酒糟中的含量也不同，甲醇以啤酒糟中含量最高（P＜0.05），乙醇為小酒廠酒糟＞大酒廠酒糟＞啤酒糟（P＜0.05），正丙醇、戊醇以小廠白酒糟的含量最高（P＜0.05），其余未檢出；異戊醇為小廠白酒糟＞大廠白酒糟＞啤酒糟（P＜0.05），甲醛為白酒糟＞啤酒糟（P＜0.05），乙酸為大廠白酒糟＞小廠白酒糟＞啤酒糟（P＜0.01），大廠白酒糟的乳酸顯著高于其他兩種類型酒糟（P＜0.05）。所有酒糟中乙酸、乳酸、乙醇、甲醛的含量相對(duì)較高，乙醇含量范圍為299.64～11 667.45 mg/kg·DM，乙酸含量范圍為1.80～7.11 g/kg·DM，乳酸含量為25.41～92.90 g/kg·DM，甲醛含量為9.64～18.79 mg/kg·DM。

表3 鮮酒糟樣品中9種物質(zhì)的含量

2.4 儲(chǔ)存酒糟中8 種物質(zhì)含量的變化規(guī)律 三類酒糟中同一種物質(zhì)在不同存儲(chǔ)時(shí)間的含量變化見圖4～圖11。由圖可知，酒糟中甲醇含量隨著儲(chǔ)存時(shí)間延長呈現(xiàn)顯著的增加，以啤酒糟最為明顯，儲(chǔ)存30 d 達(dá)到26.78±1.93 mg/kg·DM；大廠白酒糟和啤酒糟中的乙醇含量隨儲(chǔ)存時(shí)間延長呈現(xiàn)顯著的增加，儲(chǔ)存30d分別達(dá)到5331.53±138.48、7 362.26±93.99 mg/kg·DM，但小廠白酒糟中的乙醇含量在儲(chǔ)存15 d后有顯著下降；啤酒糟中正丙醇含量隨儲(chǔ)存時(shí)間延長顯著增加，小廠白酒糟只是在儲(chǔ)存7 d 時(shí)有顯著增加；小廠白酒糟中的戊醇含量在存儲(chǔ)15 d后呈現(xiàn)顯著下降；大廠白酒糟和啤酒糟中的異戊醇含量在儲(chǔ)存7、15 d 時(shí)顯著增加，小廠白酒糟的異戊醇含量在儲(chǔ)存7 d 及以后顯著增加。

圖4 儲(chǔ)存酒糟中甲醇的含量變化

圖5 儲(chǔ)存酒糟中的乙醇含量變化

圖6 儲(chǔ)存酒糟中正丙醇的含量變化

圖7 儲(chǔ)存酒糟中異戊醇的含量變化

圖8 儲(chǔ)存酒糟中戊醇的含量變化

圖9 儲(chǔ)存酒糟中甲醛的含量變化

圖10 儲(chǔ)存酒糟中乙酸的含量變化

圖11 儲(chǔ)存酒糟中乳酸的含量變化

小廠白酒糟和啤酒糟中的甲醛含量隨儲(chǔ)存時(shí)間延長而增加，以啤酒糟儲(chǔ)存15d時(shí)達(dá)到最高值（208.62±5.87 mg/kg·DM），大廠白酒糟在儲(chǔ)存7、15d時(shí)甲醛含量顯著降低。大廠白酒糟和啤酒糟中的乙酸含量隨儲(chǔ)存時(shí)間延長而增加，以大廠白酒糟儲(chǔ)存15d時(shí)達(dá)到最高值（12.73±0.13g/kg·DM），小廠白酒糟中的乙酸含量隨儲(chǔ)存時(shí)間延長而降低。三種類型酒糟中的乳酸含量均隨儲(chǔ)存時(shí)間延長而出現(xiàn)顯著下降，以啤酒糟儲(chǔ)存30 d 時(shí)含量最低（1.98±0.42 g/kg·DM）。

2.5 酒糟中主要毒性成分體外拮抗物質(zhì)的篩選 本試驗(yàn)以酒糟中乙醇、乙酸、乳酸、甲醛四種主要毒性成分為檢測對(duì)象，研究了碳酸氫鈉、膨潤土、氧化鎂等7種物質(zhì)對(duì)其體外拮抗的作用（表4）。結(jié)果顯示，與對(duì)照組中的乙醇含量比較，酒糟經(jīng)7種物質(zhì)不同濃度處理后乙醇含量均極顯著降低（P＜0.01），其中，用1%蒙脫石和1%氧化鈣處理后乙醇的檢出量最低，其次是0.5%、1%氧化鎂，而1.5%碳酸氫鈉、5%氧化鈣和1%、3%分子篩的作用最差。除5%氧化鈣外，酒糟經(jīng)7種物質(zhì)不同濃度處理后乙酸含量均顯著降低（P＜0.05），其中，用1.5%碳酸氫鈉和1%、5%蒙脫石以及1.5%氧化鎂處理后乙酸的檢出量最低，其次是3%膨潤土、3%蒙脫石和0.5%、1%氧化鎂、1%腐植酸鈉，3%、5%氧化鈣的作用最差。除3%蒙脫石、1%和5%分子篩外，用7 種物質(zhì)其他濃度處理后的酒糟，其乳酸含量均極顯著降低（P＜0.01），其中，用1.5%氧化鎂處理后乳酸的檢出量最低，其次是1%氧化鎂和3%、5%氧化鈣，1%、5%的分子篩和3%、5%蒙脫石的作用最弱。用不同濃度氧化鎂、氧化鈣、蒙脫石、分子篩處理后的酒糟，其甲醛含量均極顯著降低（P＜0.01），其中，3%、5%分子篩和3%、5%氧化鈣處理后甲醛的檢出量最低，其次為1%、1.5%氧化鎂、1%氧化鈣及1%分子篩，各濃度腐植酸鈉、1.5%碳酸氫鈉及3%膨潤土的作用最弱。

表4 不同濃度的7種物質(zhì)對(duì)酒糟中4種主要毒性成分的處理效果

3 討論

本試驗(yàn)基于我國白酒、啤酒的現(xiàn)行生產(chǎn)工藝，以獸醫(yī)內(nèi)科教材記載的酒糟中的主要毒性成分為依據(jù)，檢測和分析了鮮濕高粱型白酒糟、儲(chǔ)存高粱型白酒糟及啤酒糟中9 種成分的含量。結(jié)果表明，鮮啤酒糟、不同類型酒廠的白酒糟中9 種成分的含量各不相同，但所有酒糟中乙醇、乙酸、乳酸、甲醛的含量相對(duì)較高，異戊醇在三種酒糟中均能很好的檢出；儲(chǔ)存試驗(yàn)期內(nèi)，啤酒糟、大廠白酒糟中的乙醇、乙酸含量隨儲(chǔ)存時(shí)間延長而顯著增加，小廠白酒糟則呈現(xiàn)顯著下降；三種酒糟中的乳酸含量均隨儲(chǔ)存時(shí)間延長而出現(xiàn)顯著下降；啤酒糟和小廠白酒糟中的甲醛含量隨儲(chǔ)存時(shí)間延長而增加，大廠白酒糟在儲(chǔ)存15 d 后顯著降低。需要說明的是，我國幅員遼闊，各地釀造白酒的原料、工藝等差別較大，本試驗(yàn)所得結(jié)果并不能完全反映各地酒糟中已測成分的含量，還需作進(jìn)一步的研究。

Thokozani 等［9］研究指出，常人若每天攝入乙醇69.9～373.4 mL，則有發(fā)生乙醇中毒的高風(fēng)險(xiǎn)；而當(dāng)意外攝入4.74 mg的甲醇，則會(huì)造成人的中毒死亡［10］。動(dòng)物鮮酒糟可引起以乙酸中毒為主的癥狀；長期大量攝入乳酸，可降低胃腸道內(nèi)容物的酸度，影響微生物區(qū)系，降低消化機(jī)能和鈣的吸收。在酒糟中加入1%～1.5%碳酸氫鈉或0.1%～1%生石灰，是目前預(yù)防動(dòng)物酒糟中毒的常見策略［10］，但尚未相關(guān)的試驗(yàn)報(bào)道。膨潤土是一種極性吸附劑，依靠其靜電引力和熱運(yùn)動(dòng)的平衡作用可實(shí)現(xiàn)物理吸附作用，通過水合作用、離子和分子的相互作用及共價(jià)鍵和氫鍵結(jié)合等還可實(shí)現(xiàn)化學(xué)吸附作用［11］。氧化鎂為堿性氧化物，有吸附作用，作為反芻動(dòng)物飼料的無機(jī)鎂源，近年來以飼料添加劑的形式廣泛應(yīng)用于奶牛飼養(yǎng)中［12］。提純的腐植酸鈉呈堿性（pH值在8～11之間），有較強(qiáng)的吸附和螯合作用，在畜牧獸醫(yī)上主要用于動(dòng)物的飼料添加劑，發(fā)揮增進(jìn)食欲、提高抗病力、促進(jìn)生長等作用［13］。蒙脫石的主要成分為硅鋁酸鹽，表面有大量微孔，有強(qiáng)力的吸附作用，具備吸附重金屬、霉菌毒素、病原菌、細(xì)菌毒素和維護(hù)胃腸道黏膜及防治腹瀉等功效，已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)中［14］。分子篩具有豐富的孔道結(jié)構(gòu)、良好的穩(wěn)定性及極好的選擇性吸附作用，在環(huán)境保護(hù)、食品及化妝品加工、精細(xì)化工等方面應(yīng)用廣泛［15］。氧化鈣為堿性氧化物，用其處理反芻動(dòng)物粗飼料，可促進(jìn)粗飼料細(xì)胞壁水解，提高消化率［16］。

本試驗(yàn)選擇上述具有吸附、中和酒糟中酸類、醇類作用的物質(zhì)，研究其體外拮抗酒糟中主要毒性成分的效果，結(jié)果顯示：對(duì)乙醇拮抗作用最強(qiáng)的是1%蒙脫石和1%氧化鈣，對(duì)乙酸拮抗作用最強(qiáng)的是1.5%碳酸氫鈉和1%、5%蒙脫石以及1.5%氧化鎂，對(duì)乳酸拮抗作用最強(qiáng)的是1.5%氧化鎂，對(duì)甲醛拮抗作用最強(qiáng)的有3%、5%分子篩和3%、5%氧化鈣?？偟膩砜矗瑢?duì)4種毒性成分綜合拮抗作用最好的是1%氧化鎂，而1%氧化鈣、1%蒙脫石也可發(fā)揮一定的拮抗作用。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)來自川渝地區(qū)大、小白酒廠的高粱型白酒糟、啤酒糟中乙醇等9 種物質(zhì)進(jìn)行了測定分析，結(jié)果得出乙醇、乙酸、乳酸、甲醛的檢出量較高，按干物質(zhì)計(jì)算，乙酸、乳酸及乙醇含量可達(dá)克級(jí)水平；儲(chǔ)存30 d 內(nèi)，啤酒糟中的乙醇、乙酸、甲醛含量均呈顯著上升，大酒廠酒糟中的乙醇、乙酸含量呈顯著上升，而小酒廠鮮糟中的乙醇、乙酸、甲醛含量隨儲(chǔ)存時(shí)間延長而顯著下降，三類酒糟中的乳酸含量均在儲(chǔ)存過程中顯著下降，但均高于其他幾種物質(zhì)的含量。在對(duì)酒糟主要毒性成分體外拮抗物質(zhì)的篩選中，以1%氧化鎂效果最好，考慮動(dòng)物攝入鎂過多的風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)合試驗(yàn)中0.5%～1%氧化鎂均可有效降低酒糟中乙醇、乙酸、乳酸、甲醛檢出量的結(jié)果，建議生產(chǎn)中選擇適當(dāng)?shù)难趸V濃度。