魯立剛， 王二耀， 施巧婷， 楚秋霞， 朱肖亭， 徐照學*

(1.畢節(jié)市畜牧獸醫(yī)科學研究所，貴州 畢節(jié) 551700；2.河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，鄭州 450008)

胚胎移植技術(shù)自1890年創(chuàng)立至今，經(jīng)歷了130余年的發(fā)展與完善，已成為現(xiàn)代畜牧業(yè)尤其是高價值低繁殖力畜種繁育中不可或缺的技術(shù)手段。牛是單胎大家畜，其繁殖周期較長，繁殖力較低，用超數(shù)排卵與胚胎移植(MOET)相結(jié)合的技術(shù)進行擴繁效果好，且技術(shù)成熟。因此牛的胚胎移植技術(shù)在實際生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用。據(jù)國際胚胎移植協(xié)會統(tǒng)計，2018年世界范圍內(nèi)共利用外源促性腺激素超排供體母牛76 076萬頭，獲得可用胚胎469 967萬枚，頭均6.2枚/次[1]。

和牛(Wagyu)原產(chǎn)于日本，是世界公認的良種肉牛品種，肉質(zhì)特點為肌肉紋理細微，大理石花紋明顯，口感細嫩、風味獨特，是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高檔雪花牛肉的理想品種[2-3]。據(jù)統(tǒng)計，日本和牛飼養(yǎng)量高達180萬頭，能滿足1億人對雪花牛肉的消費需求。由于日本政府全面禁止和牛遺傳物質(zhì)(包括活牛、精液和胚胎)出口，目前國內(nèi)飼養(yǎng)的純種和牛存欄數(shù)量極其有限，且以和牛作為供體進行超數(shù)排卵并進行胚胎移植的研究報道較為鮮見。僅見石曉兵等[4]研究了夏季青年和牛胚胎移植效果分析，趙善江等[5]研究了澳洲和牛超數(shù)排卵與體內(nèi)胚胎生產(chǎn)的影響因素。另有畢江華等[6]、隋鶴鳴等[7]、趙明禮等[8]分別從超數(shù)排卵次數(shù)對和牛體內(nèi)胚胎生產(chǎn)的影響，不同F(xiàn)SH劑量對和牛胚胎移植后代超數(shù)排卵效果的影響，以及超排前卵巢上的有腔卵泡數(shù)量多少對青年和牛體內(nèi)胚胎生產(chǎn)效率的影響方面進行了研究。為此，2019年3—6月，筆者訪學期間有幸參與了導師團隊在安徽宿州草源牧業(yè)開展的以和牛作供體、荷斯坦奶牛作受體的和牛超數(shù)排卵及胚胎移植試驗。本試驗通過非手術(shù)法取胚并進行鮮胚移植，以觀察和牛超數(shù)排卵及胚胎移植效果，以期為以后的科研提供借鑒與參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供體牛選擇 試驗選取安徽宿州草源牧業(yè)飼養(yǎng)的健康狀況良好、無生殖系統(tǒng)疾病、無傳染性疾病，且發(fā)情周期正常、膘情適中的經(jīng)產(chǎn)和牛8頭作為供體牛(試驗過程中淘汰1頭，實際7頭可用)。

1.1.2 受體牛選擇 試驗選取安徽宿州草源牧業(yè)飼養(yǎng)的具有完整的繁殖周期、體格發(fā)育正常、體況良好、體質(zhì)健康的青年荷斯坦母?；蚪?jīng)產(chǎn)(1～2胎)荷斯坦母牛60頭作為受體牛。

1.1.3 試驗藥品及器械 主要藥品：垂體促卵泡素(FSH)，加拿大進口，規(guī)格：400 mg/瓶(20 mL稀釋)；氯前列烯醇(PG)，上海市計劃生育科學研究所生產(chǎn)，規(guī)格：0.2 mg/支(2 mL)；2%鹽酸普魯卡因，山東方明藥業(yè)生產(chǎn)，規(guī)格：40 mg(2 mL)。MEM，Gibco公司生產(chǎn)，規(guī)格：9.73 g；保存液(Holding)，美國ICP公司生產(chǎn)，規(guī)格：50 mL；促黃體素釋放激素(A3)，寧波三生生物科技公司生產(chǎn)，規(guī)格：25 μg。主要器械：法國IMV卡蘇式胚胎移植槍(適用于直徑3 mm外套，帶藍環(huán))、法國IMV直徑3 mm的輸胚槍無菌硬外套、IMV輸胚移植軟外套、體視顯微鏡、B超妊娠診斷儀、一次性塑料注射器(5 mL、10 mL、20 mL、100 mL)、一次性長臂手套、乳膠手套等。

1.2 方 法

1.2.1 供體牛超數(shù)排卵處理方案 供體牛超數(shù)排卵采用PG+FSH方案，即：3月10日對供體牛按2支/頭劑量肌肉注射PG，間隔10 d(3月21日)后再按2支/頭劑量肌肉注射PG。再間隔11 d后連續(xù)4 d(即4月2、3、4、5日)按3 mL、2.5 mL、2 mL、1 mL每天2次(早上7：00、晚上19:00)減量肌肉注射FSH，并在4月4日晚上和4月5日早上按照2支/頭劑量肌肉注射PG。4月6日晚上進行第1次人工授精(記為0天)，4月7日中午進行第2次人工授精(2次人工授精使用同一頭種公牛的精液)，并同時按25 μg/頭的劑量注射促排3號。4月13日(配種后第7天)沖胚。

1.2.2 受體牛同期發(fā)情處理方案 受體牛同期發(fā)情采用PG法，即：3月21日早上按照2支/頭的劑量肌肉注射PG，4月4日、4月5日早上再按2支/頭的劑量肌肉注射PG，4月6日觀察受體發(fā)情情況并做好記錄，4月13日通過直腸檢查卵巢黃體發(fā)育情況擇優(yōu)移植。

1.2.3 胚胎采集方法 供體和牛經(jīng)超排及人工授精后第7天采用二路沖卵管法進行非手術(shù)沖胚。步驟如下：

(1)將供體牛保定，用2%普魯卡因(劑量為4～6 mL)進行薦尾間隙硬膜外腔麻醉。

(2)用子宮頸粘液去除棒吸除粘液。

(3)將帶鋼芯的沖卵管插入陰門，達到子宮頸口。用直腸把握法引導沖卵管穿過子宮頸并到達子宮角前端(靠近子宮頸一側(cè))。

(4)將鋼芯緩慢抽出10～15 cm，用20 mL注射器給沖卵管氣囊注入約10～15 mL空氣，抽出沖卵管鋼芯。

(5)用100 mL注射器每次吸取約60 mL沖卵液從沖卵管三通處注入子宮角(直到略有注射阻力為止)，然后回收沖卵液。每側(cè)子宮角重復沖卵數(shù)次，沖卵液總用量約500 mL。

(6)將回收液放到集卵杯過濾，在室溫下(18～22 ℃)靜置5～10 min后鏡檢。

1.2.4 胚胎級別鑒定 根據(jù)胚胎的輪廓、細胞發(fā)育的均勻性、細胞色澤等形態(tài)學標準，胚胎按質(zhì)量優(yōu)劣可分為A、B、C、D 4個等級[9-10]。A級：優(yōu)良胚胎。胚胎發(fā)育階段與胚齡一致，形態(tài)典型，呈球形，卵細胞和分裂球的輪廓清晰、細胞質(zhì)致密、色澤和分布均勻一致，透明度好，無附著細胞和泡液；B級：普通胚胎。胚胎發(fā)育階段和胚齡基本一致，與典型胚胎相比稍有變形，但卵細胞和分裂球的輪廓清晰、細胞質(zhì)較致密、分布均勻、可見一些附著細胞和泡液，變形細胞約占10%～30%；C級：不良胚胎。胚胎發(fā)育階段與胚齡不太一致，形態(tài)變化明顯，卵細胞和分裂球的輪廓稍不清晰或部分不清晰、細胞質(zhì)不均勻、色澤發(fā)暗、結(jié)構(gòu)較松散，游離細胞或泡液較多，變性細胞占30%～50%；D級：變性、退化胚胎。輪廓模糊，色調(diào)暗，結(jié)構(gòu)松散，碎片細胞和泡液很多，變性細胞約占50%～80%。

一般而言，A、B、C級為可用胚胎，但C級胚胎移植成功率較低，若以生產(chǎn)為目的則不建議使用，D級胚胎不宜移植。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗相關(guān)數(shù)據(jù)采用SAS統(tǒng)計分析系統(tǒng)(SAS 9.0)[11]進行分析。不同等級(A、B級)胚胎移植效果、不同發(fā)育階段(桑椹胚、囊胚)胚胎移植效果用百分率表示，其差異顯著性用x2檢驗，α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 超數(shù)排卵效果

通過對7頭供體和牛采用PG+FSH方案進行超數(shù)排卵并2次人工授精處理后，第7天用非手術(shù)法采集胚胎，結(jié)果見表1、表2。

從表1、表2可以看出：試驗采用PG+FSH方案對供體和牛進行超數(shù)排卵處理，整體效果較為理想，頭均胚胎數(shù)為(11.29±4.86)枚，頭均可用胚胎數(shù)[A級、B(+/-)級]為(5.86±3.27)枚。說明在本次和牛超數(shù)排卵試驗中，藥品劑量使用合理。需要說明的是11002號供體母牛，沖胚過程中一共獲得了22枚胚胎，但由于其生殖系統(tǒng)疾病，所獲取的胚胎均已退化或死亡，其原因可能是配種過程中造成生殖道感染進而引發(fā)炎癥所致。

表1 供體牛超數(shù)排卵效果

表2 供體牛頭均獲胚數(shù)/頭均可用胚數(shù)

2.2 胚胎移植效果

將7頭和牛超數(shù)排卵后獲得的41枚可用胚胎(A、B級)分別移植給41頭經(jīng)過同期發(fā)情處理的荷斯坦空懷母牛，40 d后采用直腸和B超檢查進行妊娠檢查，妊娠效果見表3。

從表3可以看出：本次試驗共移植41枚胚胎，妊娠21頭，妊娠率為51.22%。其中，按胚胎等級分，則A級胚胎移植妊娠率為54.55%(12/22)，B級胚胎移植妊娠率47.37%(9/19)；按胚胎發(fā)育階段，則桑椹胚移植妊娠率為46.88%(15/32)，囊胚移植妊娠率為66.67%(6/9)。

表3 胚胎移植效果

2.3 不同等級、不同發(fā)育階段胚胎移植效果比較

試驗采用x2檢驗對不同等級(A級、B級)、不同發(fā)育階段(桑椹胚、囊胚)胚胎移植妊娠率進行差異顯著性檢驗。結(jié)果表明：不同等級胚胎移植妊娠率無顯著差異(P=0.884 6)；不同發(fā)育階段胚胎移植妊娠率差異不顯著(P=0.501 6)。

3 討 論

3.1 超數(shù)排卵效果

超數(shù)排卵是指在母畜發(fā)情周期中的適當時期人為地注射外源促性腺激素，從而促使卵巢中卵泡發(fā)育和排卵的數(shù)量大大增加的方法。此法在低繁殖力畜種中使用較為廣泛。由于牛是單胎大家畜，自然狀態(tài)下一個發(fā)情周期通常只排1枚成熟卵母細胞。因此，為了在一個發(fā)情周期內(nèi)獲得更多的卵母細胞，就需要通過注射外源激素促使其排出更多的成熟卵母細胞。

根據(jù)之前的報道，李金輝等[12]用FSH+PG法處理秦川牛獲得頭均可用胚數(shù)4.2枚左右；劉俊平等[13]用FSH+PG+GnRH法處理奶牛獲得頭均可用胚數(shù)6.2枚左右；喬海生等[14]用CIDR+GnRH+FSH+PGF法處理供體牛獲可用胚數(shù)為5.4～8.8枚；和占星等[15]用FSH+PG法處理在全放牧條件下的婆羅門牛和BMY牛，獲得頭均可用胚數(shù)為3.31枚。另據(jù)石曉兵等[4]選用27頭11～13月齡青年和牛作供體，采用CIDR+FSH+PG法進行超數(shù)排卵，共獲得和牛胚胎274枚(頭均10.15枚)、可用胚胎173枚(含C級胚胎)，頭均可用胚胎6.41枚。

本試驗中，采用PG+FSH方法對和牛進行超數(shù)排卵，頭均獲得胚胎數(shù)為(11.29±4.86)枚，可用胚胎(5.86±3.27)枚(只統(tǒng)計A級和B級胚胎)。若剔除11002號供體母牛因后期感染而未能提供可用胚胎因素，本試驗實際頭均可用胚胎數(shù)為(6.83±2.41)枚，且本試驗所用供體和牛平均年齡在5歲以上，因此，與前述報道相比，本試驗超數(shù)排卵效果較為理想。

3.2 胚胎移植效果

胚胎移植的效果主要是通過移植妊娠率來衡量。本試驗綜合妊娠率為51.22%(21/41)，略低于石曉兵等[4]報道的53%。究其原因可能是由于胚胎移植效果受胚胎質(zhì)量、供受體的同期性、移植操作技術(shù)、受體牛營養(yǎng)及飼養(yǎng)管理水平等因素的影響，移植效果具有諸多的不確定性。因此，要想獲得較好的胚胎移植效果，供體牛超數(shù)排卵、受體牛胚胎移植過程中的每一個環(huán)節(jié)都必須嚴格把控[16-17]。

此外，本試驗中共移植A級胚胎22枚，妊娠率54.55%，移植B級胚胎19枚，妊娠率47.37%，但二者的移植妊娠率無顯著差異(P=0.884 6)。這與石曉兵等[4]得出的“一級胚胎移植受胎率(56.10%)顯著高于二級胚胎(46.30%)(P<0.05)”的結(jié)論以及西貝正彥等[18]報道的“品質(zhì)越好受胎率越高(P<0.05)”的結(jié)論相悖。另外，本試驗中共移植桑椹胚32枚，移植妊娠率為46.88%(15/32)，移植囊胚9枚，移植妊娠率為66.67%(6/9)，二者差異亦不顯著(P=0.501 6)。這一結(jié)論與隋鶴鳴[7]、西貝正彥等[18]的研究結(jié)果相一致。

4 結(jié) 論

(1)試驗采用PG+FSH方案按照總劑量PG 8支/頭、FSH 17 mL/頭(4 d減量注射)，并輔以25 μg/頭促排3號對供體和牛進行超數(shù)排卵，效果較為理想。

(2)試驗鮮胚移植妊娠率為51.22%，基本達到實際生產(chǎn)水平。不同等級(A級、B級)胚胎、不同發(fā)育階段(桑椹胚、囊胚)胚胎對移植妊娠率均無顯著影響。

(3)胚胎移植是一個系統(tǒng)工程，其移植效果受胚胎質(zhì)量、移植操作熟練程度、受體牛營養(yǎng)及飼養(yǎng)管理水平等諸多因素的影響，只有每一個環(huán)節(jié)都盡可能做到盡善盡美，才有可能獲得較為理想的移植效果。