于紅玲， 郭茜楠， 韓 旭

(天津水務(wù)集團(tuán)水質(zhì)監(jiān)測(cè)中心， 天津 300241)

隨著水體富營(yíng)養(yǎng)化情況的加劇，國內(nèi)外很多區(qū)域報(bào)道湖泊、水庫出現(xiàn)了藻類爆發(fā)的情況。目前世界各國對(duì)藻類相關(guān)代謝產(chǎn)物的研宄已經(jīng)相當(dāng)廣泛和深入。藻類的次生代謝產(chǎn)物嗅味物質(zhì)直接影響飲用水的感官性狀，引起了越來越多人的關(guān)注。20世紀(jì)50年代末至今，已有二十多個(gè)國家先后報(bào)道了水體存在異味的問題并進(jìn)行了相關(guān)研究。近年來，我國各地突發(fā)飲水污染事件頻發(fā)，據(jù)調(diào)查其中很多和飲用水中藻類產(chǎn)生的異味相關(guān)[1]。同時(shí)，全球氣候變暖和CO2濃度的增加也為藍(lán)藻生長(zhǎng)提供了有利條件，導(dǎo)致水體中藍(lán)藻大量繁殖形成藍(lán)藻水華， 影響了水域生態(tài)系統(tǒng)、旅游業(yè)及生態(tài)景觀。更為嚴(yán)重的是，某些有害藍(lán)藻分泌的毒素或致嗅物質(zhì)會(huì)使飲用水水質(zhì)惡化， 對(duì)居民飲用水安全構(gòu)成威脅[2]。這其中以2-甲基異莰醇及土臭素最為常見。兩者均為萜類化合物， 20 世紀(jì) 60 年代在放線菌中被發(fā)現(xiàn)[3]，其嗅閾值(OTC)較低，分別為15和10 ng/L。多種藻類也能產(chǎn)生這兩種嗅味物質(zhì)[4]。通常情況下，在藻類繁殖季節(jié)，我國部分湖泊、水庫等部分水體中的2-甲基異莰醇及土臭素濃度會(huì)超過10 ng/L，因此，進(jìn)行藻類計(jì)數(shù)、土臭素和2-甲基異莰醇的檢測(cè)很重要[5]。

筆者結(jié)合近年來北方湖泊、水庫中較為常見的藻類，選擇了3種藍(lán)藻，初步摸索了藻類培養(yǎng)條件，在保證藻類能正常培養(yǎng)、傳代后，確定了藻類計(jì)數(shù)方法，搭建了致嗅物質(zhì)的固相萃取-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀快速檢測(cè)方法，對(duì)藻類培養(yǎng)液開展檢測(cè)，以期為進(jìn)一步研究藻類與致嗅物質(zhì)相關(guān)性、水中致嗅物質(zhì)的去除等問題打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)藻類

實(shí)驗(yàn)所選擇的3種藻類的信息[6]見表1。

表1 3種藻類的基本信息

1.2 儀器和試劑

人工氣候培養(yǎng)箱(bluepard)；生物顯微鏡(Olympus BX51)；氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀( GC-MS；Agilent 8890-5977A)，具備CTC自動(dòng)進(jìn)樣器固相微萃取模塊；氣相相色譜柱：DB-5MS型毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；高壓滅菌鍋。

Milli-Q 超純水，15 MΩ·cm；BG11培養(yǎng)基；土臭素、2-甲基異莰醇混標(biāo)，100 μg/mL；2-異丁基-3-氧基吡嗪，1 000 μg/mL；氯化鈉，500 g，優(yōu)級(jí)，經(jīng)450℃烘烤2 h后置干燥器內(nèi)備用；高純氦，純度≥99.999%；移液槍。

藻種購置于中國科學(xué)院淡水藻種庫。

1.3 人工氣候培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件

根據(jù)初步摸索，確定藻類培養(yǎng)條件見表2。

1.4 藻類傳代與培養(yǎng)方式

1.4.1培養(yǎng)基配制

依據(jù)BG11培養(yǎng)基配制要求，進(jìn)行培養(yǎng)基配制、分裝與高壓滅菌。

1.4.2藻種復(fù)蘇

取10 mL所購買藻種，加入10 mL BG11培養(yǎng)液，置于人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日鏡下觀察培養(yǎng)液中藻類形態(tài)，待藻類狀態(tài)正常時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.4.3藻種傳代

用移液槍取1 mL藻類原培養(yǎng)液，置于100 mL新配制的BG11培養(yǎng)液中，混勻，放置于人工氣候培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.5 致嗅物質(zhì)檢測(cè)方法

1.5.1藻類培養(yǎng)液樣品的準(zhǔn)備

將藻類培養(yǎng)液混勻，取1 000 mL容量瓶，少量純水打底，用移液槍取1 mL藻類原培養(yǎng)液至1000 mL容量瓶中，定容搖勻。取頂空瓶，用10.00 mL移液管從已定容的容量瓶中量取10.00 mL稀釋培養(yǎng)液至頂空瓶中，加入3 g氯化鈉，加入內(nèi)標(biāo)物(2-異丁基-3-甲氧基吡嗪，濃度40 ng/L)，立即加蓋密封，搖勻，待測(cè)。

1.5.2檢測(cè)儀器參數(shù)

頂空固相微萃取進(jìn)樣條件：加熱平衡溫度，60℃；加熱平衡時(shí)間，30 min。

氣相色譜儀參考條件：進(jìn)樣口溫度，250℃；進(jìn)樣方式，不分流進(jìn)樣；升溫程序，起始溫度60℃保持2.5 min，以8℃/min速率升至250℃，保持5 min；離子源溫度，230℃；連接線溫度，280℃；離子化能量，70 Ev；掃描模式，選擇離子檢測(cè)(SIM)，選擇離子檢測(cè)參數(shù)見表 3。

1.6 藻類計(jì)數(shù)方法

參考《內(nèi)陸水域浮游植物監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)程》(SL 733—2016 )中密度分析要求[7]，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 藻類培養(yǎng)條件的確定

結(jié)合目前湖泊、水庫中藍(lán)藻繁殖季節(jié)的溫度和藍(lán)藻的生活習(xí)性，確定了藻類培養(yǎng)溫度為25℃，濕度為60%，光照為1 200 Lux。

每日對(duì)藻類培養(yǎng)液進(jìn)行搖勻，以避免藻類過度聚集，影響生長(zhǎng)。同時(shí)，應(yīng)每日隨機(jī)改變?cè)孱惻囵B(yǎng)液在人工氣候培養(yǎng)中的位置，以保證藻類均勻接收到光照。

2.2 藻類傳代方式的確定

嘗試了兩種傳代方式，一種是對(duì)藻類培養(yǎng)液進(jìn)行離心，分離出藻類，再對(duì)藻類進(jìn)行復(fù)溶，隨后稀釋轉(zhuǎn)接進(jìn)入培養(yǎng)基進(jìn)行傳代。使用該方法傳代后，在顯微鏡下觀察藻類形態(tài)，發(fā)現(xiàn)藻類損傷嚴(yán)重，需要1周甚至更長(zhǎng)的時(shí)間才能恢復(fù)到正常狀態(tài)。

另一種是選擇用移液槍取適量原藻類培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移進(jìn)入新配培養(yǎng)基，進(jìn)行稀釋的傳代方式。該方式下在藻類傳代后隔日鏡下觀察發(fā)現(xiàn)其形態(tài)正常，在生長(zhǎng)周期內(nèi)狀態(tài)較穩(wěn)定。

因此，最終選擇在1 ∶100(原培養(yǎng)液 ∶培養(yǎng)基)的條件下，用移液槍進(jìn)行稀釋傳代，不再進(jìn)行離心。傳代周期為25～32 d。

2.3 致嗅物質(zhì)檢測(cè)方法的性能考察

在確定了藻類培養(yǎng)方式后，使用固相微萃取-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)藻類培養(yǎng)液中土臭素、2-甲基異莰醇進(jìn)行檢測(cè)。

2.3.1方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

使用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線范圍在0～100 ng/L。以目標(biāo)物質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，得到土臭素?cái)M合曲線方程為：y=1.220 988x+0.008 057，R2=0.999 3；2-甲基異莰醇擬合曲線方程為：y=0.490 214x-0.003 701，R2=0.999 9。該方法濃度點(diǎn)設(shè)置均勻，線性良好。

2.3.2方法的檢出限

根據(jù)檢出限計(jì)算公式MDL=3.143S(n=7)，計(jì)算得到土臭素與2-甲基異莰醇的檢出限見表4。

表4 致嗅物質(zhì)的檢出限

2.3.3方法的精密度與準(zhǔn)確度

向水體中分別加入10與20 ng/L標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，進(jìn)行回收率與精密度實(shí)驗(yàn)，土臭素與2-甲基異莰醇的加標(biāo)回收率在95%～107%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%。該檢測(cè)方法的回收率較高，精密度較好。

2.4 藻類計(jì)數(shù)方式的確定

使用陽性純?cè)宸N(偽魚腥藻)進(jìn)行測(cè)定(n=12)，計(jì)數(shù)平均值為538×104cells/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.3%。該方法計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，精密度較好。

2.5 藻類產(chǎn)生致嗅物質(zhì)情況

對(duì)培養(yǎng)的偽魚腥藻、水華束絲藻和拉式擬浮絲藻，在傳代初期、中期、末期分別進(jìn)行嗅味物質(zhì)檢測(cè)，其檢出結(jié)果見表5。

結(jié)果顯示，在3種藻類傳代后的初期、中期、末期，只有偽魚腥藻可以檢出2-甲基異莰醇，其余藻類均未檢出致嗅物質(zhì)，土臭素在3種藻類培養(yǎng)液中均未檢出。偽魚腥藻的藻類計(jì)數(shù)結(jié)果與2-甲基異莰醇的檢出數(shù)據(jù)為正相關(guān)。

表5 3種培養(yǎng)藻類產(chǎn)生致嗅物質(zhì)的情況

3 結(jié)論與展望

通過條件摸索，初步建立了偽魚腥藻、水華束絲藻、拉式擬浮絲藻的培養(yǎng)與傳代方式。結(jié)合培養(yǎng)情況，確定了藻類計(jì)數(shù)與土臭素、2-甲基異莰醇的檢測(cè)方法。初步搭建了藻類計(jì)數(shù)與致嗅物質(zhì)相關(guān)性研究平臺(tái)。未來，應(yīng)進(jìn)一步采用所確定的方法開展藻類培養(yǎng)的相關(guān)研究。同時(shí)聯(lián)系實(shí)際供水生產(chǎn)需要，找到水體中各類致嗅物質(zhì)與相關(guān)藻類的關(guān)系，深入研究藻類對(duì)環(huán)境、水質(zhì)的影響，從而更好地摸索出藻類致嗅物質(zhì)的控制方法，提升供水水質(zhì)。