黃汕梅李 暢馬梓珊郭玉洪趙洋洋劉 原銀幫巧劉 鷹*唐耀平

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué),南寧 530200;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院,南寧 530011;3.廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧 530200)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary artery diseases,CAD)嚴(yán)重危害著民眾的健康,是導(dǎo)致死亡的主要原因之一[1-2]。CAD的發(fā)展主要是由于斑塊在冠脈內(nèi)不斷的堆積使冠脈逐漸狹窄,從而導(dǎo)致心肌組織缺血缺氧,嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)[3]。近年來(lái),越來(lái)越多的學(xué)者將研究投向中醫(yī)經(jīng)典方劑,通過(guò)深入探索其中的作用機(jī)制,找到防治心肌缺血的新靶點(diǎn)和新策略。

早在公元8世紀(jì),《敦煌遺囑》中就記載用硝石雄黃散“治中惡,急心痛,手足逆冷者,頃刻可殺人,其人唇舌青紫者,著舌以通心氣。硝石五錢(qián)匕,雄黃一錢(qián)匕。上二味,共為極細(xì)末,啟病者舌,著散一匕于舌下,少時(shí)即定;若有涎出,令病者隨涎咽下,必愈”[4]。其療效顯著,具有很高的臨床運(yùn)用價(jià)值和開(kāi)發(fā)前景,是中醫(yī)藥中不可多得的用于臨床心血管急癥的方藥。但遺憾的是,目前在臨床上很少使用硝石雄黃散治療CAD。究其原因,一方面可能是對(duì)硝石雄黃散防治CAD的作用機(jī)制不明確;另一方面,可能是擔(dān)心雄黃(主要成分四硫化四砷,As4S4)的毒性[5]。從方藥的組成及給藥途徑來(lái)看,硝石雄黃散作用途徑很可能與臨床常用的硝酸酯類(lèi)藥物完全不一樣。本研究從探索硝石雄黃散對(duì)小鼠心肌梗死面積、心肌梗死標(biāo)志物、血清NO水平以及肝腎功能的影響,初步揭示硝石雄黃散保護(hù)小鼠缺血心肌的作用機(jī)制及其生物安全性,為進(jìn)一步研發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF級(jí)雄性未交配的C57BL/6J小鼠,8周齡,體重(20±5)g,由廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心統(tǒng)一購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(湘)2019-0004],檢疫合格后于廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)、造模并取材[SYXK(桂)2019-0001]。飼養(yǎng)環(huán)境溫度(25±2)℃,相對(duì)濕度60%,光照12 h/12 h明暗循環(huán),每籠5只C57BL/6J小鼠,并嚴(yán)格按照3R原則給予人道關(guān)懷。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵守國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求,經(jīng)過(guò)廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(DW20210929-177)。

1.2 主要試劑與儀器

中藥硝石(成都金山化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):20200504);中藥雄黃(湖南淳芝寶藥業(yè)有限責(zé)任公司)。據(jù)參考文獻(xiàn)[6-7]報(bào)道,硝石雄黃散中的硝石又名火消,其主要成為硝酸鉀(KNO3),為保證實(shí)驗(yàn)的一致性,統(tǒng)一用硝酸鉀(貨號(hào):GB/T647-2011)代替硝石。每種中藥材均為同一批次,由廣西中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心統(tǒng)一購(gòu)進(jìn)。

氧氣(廣西瑞達(dá)化工科技有限公司,Lot:210028);異氟烷(深圳瑞沃德生命科技有限公司,Lot:202006);總NO檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物公司,Lot:No.120820210604);小鼠心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I, cTnI)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes, CK-MB)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)ELISA試劑盒(江蘇博深生物科技有限公司,Lot:20210630044 T、20210630043 T、20210630042 T);2,3,5-三苯基氯化四氮(北京索萊寶科技有限公司,Lot:NO.520C031);4%多聚甲醛通用型組織固定液(biosharpa,批號(hào):71040900);谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、肌酐等測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所;Lot: 20210715、20210714);尿素氮測(cè)試盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司,Lot: 20210716)。

Tecan Infinite 200Pro酶標(biāo)儀(中國(guó)上海迪奧生物科技有限公司);HM-325E病理組織切片機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);BX54 MRF-S光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司);557040型號(hào)小動(dòng)物呼吸機(jī)、Table Top小動(dòng)物麻醉機(jī)、Germinator500干式消 毒 器、小 鼠 心 梗 手 術(shù) 器 械 等(美 國(guó)HarvardBioscience 公司);全能型成像分析系統(tǒng)、1658033型電泳儀、電轉(zhuǎn)儀和電源(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及中藥含服

將C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為空白組(Blank,n=30)、假手術(shù)組(sham,n=30)、模型組(AMI,n=30)、雄黃組(XH,n=30)、硝石組(XS,n=30)和硝石雄黃組(XSXH,n=30);按《敦煌遺囑》記載:“硝石五錢(qián)匕,雄黃一錢(qián)匕……著散一匕于舌下”[8]換算成現(xiàn)代單位[9],成人1 d服用的劑量為硝石10 g和雄黃2 g混合研磨成細(xì)粉,取2 g于舌下含服(含1.67 g硝石和0.33 g雄黃)。通過(guò)等效劑量公式:人體劑量(mg)/人體體重(kg)×9.1×小鼠體重(kg),計(jì)算小鼠每天服用硝石雄黃劑量為6.5 mg(含5.42 mg硝石和1.08 mg的雄黃)[10]。在制備模型前1周及造模成功之后,每只小鼠以20 mg/kg劑量腹腔注射N(xiāo)-硝基-L-精氨酸甲酯阻滯劑(N-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride, L-NAME)30 min后,采用異氟烷麻醉各組小鼠后,按分組將藥粉散在小鼠舌下,每日1次。在模型建立后,詳細(xì)記錄各組小鼠的存活情況。

1.3.2 心肌缺血模型制備

準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)小鼠,放置進(jìn)麻醉盒內(nèi),連接好Table Top小動(dòng)物麻醉機(jī),利用異氟烷麻醉成功后,行氣管插管并連接呼吸機(jī)(參數(shù):Vt:200 μL;PIP:30 cmH2O;PEEP:2 cmH2O),于頸胸部脫毛備皮,常規(guī)消毒后,將第3、4肋間的皮膚與肌肉在胸骨左側(cè)2 mm處切開(kāi)1 cm左右,打開(kāi)胸腔并充分暴露心臟,將心臟表面的心包膜撕開(kāi),用8.0線按淺近寬出的手法將冠狀動(dòng)脈左前降至結(jié)扎(約在左心耳下1～2 mm處),見(jiàn)心尖部變白后擠出胸腔的空氣,關(guān)胸縫合。之后將小鼠放在37℃的恒溫板上進(jìn)行復(fù)蘇和心電圖檢查,結(jié)果見(jiàn)心電圖ST段抬高,即為心肌缺血模型建立成功的標(biāo)志[11]。

1.3.3 組織取材及檢測(cè)

在造模后的第12、24、36 h和第14天取樣。將小鼠放入小動(dòng)物麻醉機(jī)中麻醉后取血,在4℃條件下靜置2 h后以轉(zhuǎn)速4000 r/min離心10 min,取上清備用。取小鼠心臟,在生理鹽水中將心包膜等物質(zhì)洗凈,將心室腔內(nèi)的血擠壓干凈。造模后第14天取下的心臟,清理干凈后將部分心臟放入-20℃的冰箱內(nèi)冷凍2 h后進(jìn)行TTC染色,其余部分放入含有2 mL 4%多聚甲醛通用型組織固定液的EP管中,后續(xù)用作HE染色。剩余的臟器在清理干凈后,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(1)血清心肌梗死標(biāo)志物

采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)造模12、24和36 h后,小鼠血清中心肌梗死標(biāo)志物cTnI、CKMB和LDH等指標(biāo)。

(2)NO水平檢測(cè)

使用Griess法檢測(cè)造模14 d后血清中NO水平,實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

(3)TTC染色和HE染色檢測(cè)心肌梗死面積大小

用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液溶解TTC染色劑粉末,配置成2% TTC溶液,避光保存。從-20℃的冰箱中取出造模第14天取下的心臟,垂直于長(zhǎng)軸方向?qū)⑿呐K切成2～3 mm厚的切片。將切片放入含有2% TTC溶液的EP管中,按說(shuō)明書(shū)操作。染色后放入固定液中過(guò)夜,次日拍照。造模第14天取下的心臟從固定液中取出脫水后,進(jìn)行常規(guī)的石蠟包埋,切片,HE染色,脫水封片,顯微鏡下觀察分析。

(4)肝腎功能檢測(cè)

使用微板法和微量法檢測(cè)服用硝石雄黃散后第12 h和第14天小鼠血清中各項(xiàng)肝腎功能指標(biāo)(ALT、AST、AKP、肌酐和尿素氮),嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)試劑盒操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用IBM Corporation SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和方差分析組間的差異性。以P＜0.05來(lái)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 建立小鼠心肌梗死模型

各組小鼠在建立心肌梗死模型之前的生命體征正常,心電圖結(jié)果顯示為正常心電圖,如圖1A所示;建立心肌梗死模型后,心電圖結(jié)果顯示:ST段明顯抬高,如圖1B所示,即表明小鼠心肌缺血模型造模成功。

2.2 硝石雄黃散對(duì)NO3--NO2--NO通道的調(diào)控

2.2.1 L-精氨酸-NO途徑的阻斷

腹腔注射L-NAME后,小鼠的心肌組織中內(nèi)皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)蛋白表達(dá)明顯受抑制,如圖2所示;即體內(nèi)依賴(lài)eNOS蛋白生成NO的經(jīng)典途徑L-精氨酸-NO途徑受到抑制,體內(nèi)NO由補(bǔ)充途徑NO3--NO2--NO途徑生成。

2.2.2 硝石雄黃散對(duì)NO生物活性的影響

與空白組相比,假手術(shù)組NO水平無(wú)顯著變化(P＞0.05),兩組血清中NO水平較高;發(fā)生心肌梗死后,NO水平顯著降低(P＜0.05);與模型組相比,雄黃組和硝石組能顯著提高心肌梗死小鼠的NO水平(P＜0.01);而硝石雄黃組血清NO含量最高,為19.56 μmol/L(P＜0.001),見(jiàn)圖3。

2.3 硝石雄黃散對(duì)小鼠血清心肌梗死標(biāo)志物的影響

與空白組相比,假手術(shù)組中血清梗死標(biāo)志物CK-MB、LDH和cTnI水平無(wú)顯著變化(P＞0.05)。在模型組形成后,血清心肌標(biāo)記物CK-MB、LDH和cTnI水平與空白組和假手術(shù)組相比顯著升高(P＜0.05),硝石雄黃組小鼠血清中cTnI、CK-MB和LDH水平較雄黃組和硝石組明顯降低(P＜0.05),見(jiàn)表1。

表1 硝石雄黃散對(duì)小鼠血清心肌梗死標(biāo)志物的影響(±s, n=6)Table 1 Effect of Xiaoshixionghuang San on serum myocardial infarction markers in mice

表1 硝石雄黃散對(duì)小鼠血清心肌梗死標(biāo)志物的影響(±s, n=6)Table 1 Effect of Xiaoshixionghuang San on serum myocardial infarction markers in mice

注:與空白組相比, *P＜0.05;與模型組相比, #P＜0.05, ##P＜0.001。Note.Compared with Blank group, *P＜0.05.Compared with AMI group, #P＜0.05, ##P＜0.001.

組別Group空白組Blank group假手術(shù)組Sham group模型組AMI group雄黃組XH group硝石組XS group硝石雄黃組XSXH group cTnI(pg/mL) 5.12±0.40 5.16±0.84 52.11±0.90* 38.62±3.19*# 30.31±1.88*# 20.92±2.07*##CK-MB(pg/mL) 74.76±1.54 73.88±1.29 431.03±16.16* 303.33±13.65*# 218.77±8.61*# 122.56±4.99*##LDH(ng/mL) 3.19±0.08 3.13±0.10 13.53±0.63* 10.93±0.26*# 8.48±0.23*# 5.76±0.18*##

2.4 硝石雄黃散保護(hù)小鼠心肌梗死的病理學(xué)實(shí)驗(yàn)

TTC染色結(jié)果顯示:假手術(shù)組與空白組相比,心肌染色后呈現(xiàn)鮮紅色,無(wú)明顯差異;發(fā)生心肌梗死后,白色梗死區(qū)域面積明顯增加(P＜0.05);與模型組相比,經(jīng)雄黃治療后白色梗死區(qū)域大小無(wú)明顯變化(P＞0.05);經(jīng)硝石和硝石雄黃散治療后梗死區(qū)域明顯減少(P＜0.05),硝石雄黃組與其他組相比,其白色心肌梗死部分顯著減小(P＜0.01)。HE染色結(jié)果顯示:空白組和假手術(shù)組心肌組織正常,心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和輪廓完整分明、緊密有序地排列,胞核清晰可見(jiàn),與胞質(zhì)分界清晰;模型組心肌細(xì)胞破裂壞死,排列分散紊亂,心肌細(xì)胞空泡變性明顯,間隙變大內(nèi)有炎性細(xì)胞浸;與模型組相比,硝石組與雄黃組可見(jiàn)部分心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整,排列整齊有序,心肌細(xì)胞空泡性改變減少,細(xì)胞間隙變小,仍有少量地炎性細(xì)胞浸潤(rùn);硝石雄黃組可見(jiàn)心肌細(xì)胞著色較淺,細(xì)胞結(jié)構(gòu)與輪廓較完整清晰,排列較為整齊緊密,但仍有個(gè)別細(xì)胞核與胞質(zhì)分界不清晰。見(jiàn)圖4和圖5。

注:A:建立心梗模型之前的心電圖;B:建立心梗模型之后的心電圖。圖1 小鼠心肌缺血模型建立前后心電圖結(jié)果Note.A, Ecg before myocardial infarction model was established.B, Ecg after myocardial infarction model was established.Figure 1 Ecg results before and after establishment of myocardial ischemia model in mice

注:A:空白組;B:假手術(shù)組;C:模型組;D:雄黃組;E:硝石組;F:硝石雄黃組。與空白組相比, *P＜0.05;與模型組相比, #P＜0.01, ##P＜0.001。圖3 各組小鼠血清NO水平Note.A, Blank group.B, Sham group.C, AMI group.D, XH group.E, XS group.F, XSXH group.Compared with Blank group, *P＜0.05.Compared with AMI group, #P＜0.01, ##P＜0.001.Figure 3 Serum NO level of mice in each group

注:A:空白組;B:假手術(shù)組;C:模型組;D:雄黃組;E:硝石組;F:硝石雄黃組。圖2 eNOS蛋白Western blot檢測(cè)結(jié)果Note.A, Blank group.B, Sham group.C, AMI group.D, XH group.E, XS group.F, XSXH group.Figure 2 eNOS protein Western blot test results

2.5 硝石雄黃散對(duì)小鼠肝腎功能的影響

心肌梗死模型小鼠經(jīng)雄黃和硝石雄黃散干預(yù)后12 h和第14天,硝石雄黃組小鼠血清中ALT、AST、AKP、肌酐和尿素氮等含量與空白組相比,無(wú)明顯差異(P＞0.05),雄黃組各項(xiàng)肝腎功能指標(biāo)均顯著升高(P＜0.01),見(jiàn)表2。

表2 硝石雄黃散對(duì)小鼠肝腎功能的影響(±s,n=6)Table 2 Effect of Xiaoshixionghuang San on liver and kidney function in mice

表2 硝石雄黃散對(duì)小鼠肝腎功能的影響(±s,n=6)Table 2 Effect of Xiaoshixionghuang San on liver and kidney function in mice

注:急性毒性,與空白組相比, *P＜0.01;亞急性毒性,與空白組相比, **P＜0.01。Note.Acute toxicity, compared with Blank group, *P＜0.01.Subacute toxicity, compared with Blank group, **P＜0.01.

急性毒性Acute toxicity 亞急性毒性Subacute toxicity空白組Blank group雄黃組XH group硝石雄黃組XSXH group 空白組Blank group 雄黃組XH group硝石雄黃組XSXH group AST活力(卡門(mén)氏單位)AST vigour(Carmen’s unit) 73.68±6.54 141.14±6.72* 76.90±0.38 74.96±5.58 137.56±5.58**78.45±3.06 ALT活力(卡門(mén)氏單位)ALT vigour(Carmen’s unit) 16.49±0.58 91.46±0.20* 17.07±0.17 24.43±0.52 95.50±0.38**24.85±0.29 AKP活力(金氏單位/100 mL)AKP vitality (King unit / 100 mL) 7.76±0.65 15.77±0.81* 8.02±0.10 7.83±0.87 21.20±0.45**8.08±0.62肌酐含量(μmol/L)Creatinine content (μmol/L) 19.95±4.18 48.45±7.62* 26.71±7.63 18.95±3.83 54.53±12.48**20.96±1.52尿素氮含量(mg/mL)Urea nitrogen content(mg/mL) 0.20±0.01 0.46±0.03* 0.21±0.01 0.21±0.02 0.56±0.02**0.21±0.01

2.6 硝石雄黃散對(duì)小鼠存活情況的影響

通過(guò)比較整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程各組小鼠的存活情況發(fā)現(xiàn),與模型組相比,硝石雄黃組的小鼠存活情況明顯改善(圖6)。

3 討論

近些年來(lái),對(duì)CAD的防治無(wú)論在技術(shù)上還是在策略上,均取得了重大進(jìn)展,但其發(fā)病率和死亡率仍居高不下,許多問(wèn)題亟待解決。尋找解決CAD的新策略、新技術(shù)和新藥物,仍是臨床的迫切需求,對(duì)傳統(tǒng)方藥的研發(fā)是近年來(lái)的熱點(diǎn)。

CAD屬于中醫(yī)“胸痹”范疇[12]。早在公元8世紀(jì)的《敦煌遺書(shū)》就記載了治療CAD心絞痛的硝石雄黃散,療效顯著,由于其作用機(jī)制和臨床安全性不明,使得它在臨床中被長(zhǎng)期忽視。硝石雄黃散由硝石和雄黃組成,硝石即硝酸鹽(NO3-)[6]。目前大部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:硝酸鹽在介導(dǎo)腫瘤、炎癥、缺氧及酸中毒的病理生理過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用,尤其對(duì)心血管系統(tǒng)的有益作用已經(jīng)通過(guò)人體臨床實(shí)驗(yàn)得到證實(shí):當(dāng)口服一定量的NO3-時(shí),可舒張患者的血管,使血壓降低,肌肉血流增強(qiáng),循環(huán)耗氧量降低等[13-15]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明:NO3-可以提高大鼠抗氧化能力來(lái)預(yù)防心臟、腎等某些器官的缺血再灌注損傷[16-18]。這些實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了NO3-是心血管健康中的重要分子。人體內(nèi)NO3-的水平與NO水平密切相關(guān)。NO分子在體內(nèi)極其不穩(wěn)定被氧化成穩(wěn)定的NO3-和亞硝酸鹽(NO2-)分子儲(chǔ)存在血液與組織中,NO水平與NO3-/NO2-水平在體內(nèi)維持動(dòng)態(tài)平衡[19]。早有大量的研究表明NO是一種通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)環(huán)境的平衡來(lái)抵御心血管疾病的氣體信號(hào)分子[20-21]。它主要通過(guò)誘導(dǎo)局部血管舒張、抑制白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附、平滑肌細(xì)胞遷移和增殖以及血小板聚集來(lái)促進(jìn)局部血管循環(huán)系統(tǒng)的多種有益作用,維持血管功能[22-23]。當(dāng)發(fā)生心肌缺血缺氧時(shí),L-Arginine-NOS-NO途徑受到抑制,體內(nèi)NO水平降低[24]。人體產(chǎn)生NO有兩條途徑。當(dāng)抑制L-Arginine-NOS-NO通路時(shí),另一條補(bǔ)充途徑被激活,即還原型輔酶I/還原型輔酶II被硝酸還原酶作為電子供體催化NO3-和NO2-的單電子發(fā)生還原反應(yīng)生成NO來(lái)保護(hù)缺血心肌,即NO3--NO2--NO通路[25-26]。

注:A:空白組;B:假手術(shù)組;C:模型組;D:雄黃組;E:硝石組;F:硝石雄黃組。與空白組相比, *P＜0.05;與模型組相比, #P＜0.05, ##P＜0.01。圖4 各組小鼠梗死面積TTC染色結(jié)果Note.A, Blank group.B, Sham group.C, AMI group.D, XH group.E, XS group.F, XSXH group.Compared with Blank group, *P＜0.05.Compared with AMI group, #P＜0.05, ##P＜0.01.Figure 4 TTC staining results of infarct area of mice in each group

注:A:空白組;B:假手術(shù)組;C:模型組;D:雄黃組;E:硝石組;F:硝石雄黃組。圖5 小鼠心肌組織HE染色結(jié)果Note.A, Blank group.B, Sham group.C, AMI group.D, XH group.E, XS group.F, XSXH group.Figure 5 HE staining results of mouse myocardial tissue

注:A:空白組;B:假手術(shù)組;C:模型組;D:雄黃組;E:硝石組;F:硝石雄黃組。圖6 各組小鼠存活情況Note.A, Blank group.B, Sham group.C, AMI group.D, XH group.E, XS group.F, XSXH group.Figure 6 Survival of the mice in each group

《中國(guó)藥典》中記載了:“雄黃的功用:解毒殺蟲(chóng)、燥濕祛痰、截瘧……”。文獻(xiàn)研究表明雄黃含有的重金屬砷,其可對(duì)臟器尤其是肝與腎造成不同程度的毒性損傷[24];一項(xiàng)雄黃對(duì)昆明小鼠的急性毒性研究結(jié)果顯示:雄黃可造成小鼠部分肝細(xì)胞及腎小管個(gè)別上皮細(xì)胞輕度水腫[27]。李奕諾等[28]在納米雄黃對(duì)小鼠的急性毒性研究中發(fā)現(xiàn):其對(duì)小鼠的半數(shù)致死量為309.72 mg/kg;因干預(yù)致死的小鼠可見(jiàn)雙肺、肝彌散性充血,脾腫大發(fā)黑,小腸壁彌漫性充血,小腸脹氣,部分腸道腫脹并發(fā)黑壞死。張秀娟等[5]發(fā)現(xiàn)采用雄黃干預(yù)小鼠3周后,藥物干預(yù)組小鼠血清中的ALT、AST、ALP和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的水平較空白組均明顯升高;實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示雄黃對(duì)小鼠肝結(jié)構(gòu)和功能造成損傷以及腎小管輕度濁腫。Huo等[29]在采用代謝組學(xué)的方法研究雄黃對(duì)小鼠肝的亞慢性毒性發(fā)現(xiàn):雄黃的亞慢性毒性機(jī)制與亞急性毒性機(jī)制相同,均為擾亂能量代謝、膽堿代謝和氨基酸代謝。上述實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)雄黃以及含雄黃制劑的長(zhǎng)期大劑量攝入可導(dǎo)致砷蓄積性的肝腎損傷,因此硝石雄黃散的毒副作用備受關(guān)注。

本研究在阻斷L-Arginine-NOS-NO通路后,分別采用硝石、雄黃以及硝石雄黃散整方給藥干預(yù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與空白組和假手術(shù)組相比,當(dāng)小鼠發(fā)生心肌梗死后,血清中NO水平明顯降低(P＜0.05),血清心肌標(biāo)記物CK-MB、LDH和cTnI水平顯著升高(P＜0.05),心肌梗死面積明顯增加(P＜0.05),心肌細(xì)胞破裂壞死,排列分散紊亂,心肌細(xì)胞空泡變性明顯,間隙變大內(nèi)有炎性細(xì)胞浸;經(jīng)藥物干預(yù)后,模型小鼠血清中NO水平明顯提高(P＜0.01);其中,經(jīng)硝石雄黃散整方干預(yù)后,模型小鼠血清中NO含量最高,為19.56 μmol/L,明顯高于其他各組(P＜0.01);硝石雄黃組小鼠血清中cTnI、CK-MB和LD水平較雄黃組和硝石組明顯降低(P＜0.05);各組TTC染色心肌梗死區(qū)均縮小,硝石雄黃組與其他組相比,其白色心肌梗死部分顯著減小(P＜0.01);HE染色顯示各組均有保護(hù)小鼠缺血心肌細(xì)胞的作用,但以硝石雄黃組最為明顯,在顯微鏡下可見(jiàn)有個(gè)別細(xì)胞核與胞質(zhì)分界不清晰,大部分心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)與輪廓完整清晰,排列較為整齊緊密,無(wú)細(xì)胞空泡性改變。實(shí)驗(yàn)提示硝石雄黃散具有良好的保護(hù)缺血心肌的作用,而雄黃能促進(jìn)NO3-經(jīng)NO3--NO2--NO通路還原成NO,增強(qiáng)整方藥效。

為了確定硝石雄黃散是否對(duì)肝腎功能存在急性毒性和亞急性毒性的損害,本研究分別檢測(cè)了小鼠在服用硝石雄黃散后12 h和第14天血清中肝腎功能的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與空白組相比,服用雄黃和硝石雄黃散后12 h和第14天,雄黃組血清中肝腎功能指標(biāo)具有顯著的差異(P＜0.01);硝石雄黃組血清中肝腎功能相關(guān)指標(biāo)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),證實(shí)了硝石雄黃散對(duì)小鼠肝腎功能無(wú)急性和亞急性毒性影響(P＞0.05),整方使用具有安全性。

綜上所述,當(dāng)經(jīng)典途徑L-Arginine-NOS途徑受到抑制時(shí),舌下含服硝石雄黃散可顯著提高體內(nèi)NO水平,降低cTnI、CK-MB和LDH等心肌梗死標(biāo)志物的水平,縮小梗死面積,保護(hù)缺血缺氧心肌細(xì)胞和組織,明顯改善小鼠的存活情況。硝石雄黃散通過(guò)NO3--NO2--NO途徑產(chǎn)生大量的NO改善心肌缺血,改善心肌組織缺血損傷,這可能是硝石雄黃散治療CAD心絞痛的作用機(jī)制之一。同時(shí),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)了硝石雄黃散對(duì)小鼠的肝腎功能沒(méi)有明顯的損傷。這表明了硝石雄黃散是一種治療CAD的安全有效藥物,為在臨床安全推廣使用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但雄黃是如何提供硝石保護(hù)缺血心肌的作用機(jī)制以及雄黃為什么在本方中的毒副作用明顯消失的機(jī)制需要進(jìn)一步的深入探索,提示課題組將硝酸鹽作為提升NO水平的體外供體藥物需要繼續(xù)進(jìn)行深入研發(fā)。