朱曉琴 蘇 敏

1 南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇省南通市 226001； 2 南通大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科

妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus, GDM)是一種在妊娠期首次發(fā)生或發(fā)現(xiàn)的不同程度糖代謝異常的內(nèi)分泌代謝性疾病，在我國(guó)GDM發(fā)病率已達(dá)17.5%～18.9%[1]。GDM與巨大兒、胎兒生長(zhǎng)受限、新生兒低血糖等多種不良妊娠結(jié)局相關(guān)，且GDM孕婦以后發(fā)生2型糖尿病的概率顯著增加。因而，在致力于良好控制孕期血糖的同時(shí)，探索GDM的發(fā)病機(jī)制對(duì)于早期預(yù)防GDM的發(fā)生具有重要的臨床價(jià)值。

胰島素受體底物1(Insulin receptor substrate 1,IRS1)是調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，當(dāng)IRS1表水平或其磷酸化水平異常時(shí)，都將影響胰島素在細(xì)胞內(nèi)的水平，進(jìn)而引起胰島素效能下降，誘發(fā)胰島素抵抗(Insulin resistance,IR)[2]，而胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病機(jī)制的核心。細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(Suppressor of cytokine signaling-3，SOCS3)是少數(shù)具有降血糖作用的脂肪因子之一，同時(shí)被認(rèn)為是胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路中的重要負(fù)性調(diào)節(jié)因子[3]。通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前關(guān)于SOCS3與妊娠期糖尿病及胰島素抵抗的相關(guān)性研究仍以傳統(tǒng)的胰島素靶器官為主，研究胎盤(pán)組織中SOCS3表達(dá)與胰島素抵抗的相關(guān)性未見(jiàn)報(bào)道。

本課題擬分別利用QRT-PCR、免疫組化檢測(cè)SOCS3、IRS1在胎盤(pán)組織中的表達(dá)及分布情況，通過(guò)Western blot檢測(cè)SOCS3、IRS1、IRS1ser307三種蛋白的表達(dá)量，并分析胎盤(pán)組織中SOCS3與IRS1、IRS1ser307蛋白表達(dá)的相關(guān)性；同時(shí)分析SOCS3與IRS1、IRS1ser307的相關(guān)性，從而探討妊娠期糖尿病胎盤(pán)組織中SOCS3對(duì)IRS1、IRS1ser307表達(dá)水平的影響。以探討GDM胎盤(pán)發(fā)生胰島素抵抗的分子機(jī)制，以及SOCS3作為靶分子在GDM治療中的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象:選取如皋市人民醫(yī)院2020年3月—2021年3月就診的單胎、首次妊娠、既往無(wú)內(nèi)外科合并癥的孕婦作為研究對(duì)象。其中40例孕期產(chǎn)檢無(wú)異常，設(shè)為對(duì)照組；40例在孕24～28周行OGTT檢查提示GDM(血糖值依據(jù)現(xiàn)行GDM診斷標(biāo)準(zhǔn))，設(shè)為妊娠期糖尿病組(GDM組)。所選孕婦均知情同意，并簽署知情同意書(shū)。兩組產(chǎn)婦年齡、分娩孕周、孕中期BMI、孕晚期BMI無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1兩組孕婦一般資料比較

1.1.2 主要試劑：SOCS3 Monoclonal Antibody(Proteintech，66797-1-lg)，Anti-IRS1 antibody(ABcam，ab40777)，Anti-IRS1 (phospho S307) antibody (ABcam，ab1194)，Rabbit anti-β actin antibody(Beyotime，AF0003)，Anti-mouse IgG,HRP-linked Antibody(Cell signaling，7076S)，Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody(Cell Signaling，7074S)，DAB顯色試劑盒(BOSTER，AR1022)，聚合HRP標(biāo)記抗小鼠IgG(BOSTER，SV0001)，聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG(BOSTER，SV0002)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme，R223-01)，SYBR-Green Master PCR Mix(Vazyme，Q711-02/03)

1.2 方法

1.2.1 石蠟切片：兩組孕婦足月剖宮產(chǎn)后，取胎盤(pán)組織常規(guī)方法制作石蠟切片：切片厚度4μm。

1.2.2 HE染色觀察胎盤(pán)組織病理變化：常規(guī)程序脫蠟染色，蘇木素染色3min，伊紅染色1s。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色觀察SOCS3、IRS1的表達(dá)定位：切片脫蠟至水。H2O2孵育10min，PBS洗滌5min×3次。枸櫞酸鹽抗原熱修復(fù)，PBS洗滌5min。5%BSA 37℃孵育30min。滴加一抗(SOCS3抗體1∶250稀釋， IRS1抗體1∶50稀釋)，4℃孵育過(guò)夜。PBS洗5min×3次，二抗37℃孵育30min。PBS洗5min×3次，DAB顯色，蒸餾水終止顯色。蘇木素復(fù)染3min。梯度脫水和透明，封片，隔天拍照。先低倍鏡觀察，選擇目標(biāo)區(qū)域高倍鏡下，隨機(jī)觀察5個(gè)視野，陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色。

1.2.4 PCR檢測(cè)SOCS3、IRS1的基因表達(dá)水平：Trizol法提取總RNA。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和熒光定量PCR。引物序列見(jiàn)表2。

表2PCR引物序列

1.2.5 Western Blot檢測(cè)SOCS3、IRS1、 IRS1ser307蛋白表達(dá)水平:常規(guī)方法提取蛋白。配制分離膠及濃縮膠。蛋白上樣量為200μg。電泳先80V再120V。300mA 90min轉(zhuǎn)膜。室溫封閉2h。一抗(SOCS3、IRS1抗體1∶1 000稀釋， IRS1ser307抗體1∶250稀釋)4℃過(guò)夜，PBST洗10min×3次。二抗(1∶2000稀釋)室溫90min，PBST洗20min×3次。ECL顯色。

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察胎盤(pán)組織病理結(jié)構(gòu) 對(duì)照組(見(jiàn)圖1a)胎盤(pán)組織無(wú)明顯異常；GDM組(見(jiàn)圖1b)胎盤(pán)血管分布紊亂，管壁增厚且管腔狹窄，血細(xì)胞減少，胎盤(pán)絨毛成熟不良且絨毛間質(zhì)血管充盈，合體滋養(yǎng)層異常，細(xì)胞滋養(yǎng)層增生，基底膜變厚。

a b

2.2 免疫組織化學(xué)染色觀察SOCS3的表達(dá)定位 SOCS3主要特異性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，SOCS3在對(duì)照組(見(jiàn)圖2a)中表達(dá)很弱，幾乎無(wú)表達(dá)；在GDM組(見(jiàn)圖2b)中表達(dá)升高，呈黃色，為陽(yáng)性表達(dá)。

a b

2.3 免疫組織化學(xué)染色觀察IRS1的表達(dá)定位 IRS1主要特異性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，IRS1在對(duì)照組(圖3a)中染色呈棕黃色，為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在GDM組(圖3b)中表達(dá)降低，幾乎不表達(dá)。

a b

2.4 PCR檢測(cè)SOCS3、IRS1的基因表達(dá)水平 應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)分析SOCS3、IRS1在胎盤(pán)組織中的基因表達(dá)水平。與對(duì)照組相比，在GDM組胎盤(pán)中SOCS3(見(jiàn)圖4a)表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，其表達(dá)量是對(duì)照組的5.39倍(5.39±4.17)；IRS1(見(jiàn)圖4b)則是表達(dá)下調(diào)(P<0.01)，其表達(dá)量?jī)H有對(duì)照組的一半左右(0.48±0.31)。

圖4PCR檢測(cè)SOCS3、IRS1的基因表達(dá)水平

2.5 Western Blot檢測(cè)SOCS3、IRS1、 IRS1ser307的蛋白表達(dá)水平 應(yīng)用Western Blot技術(shù)分析SOCS3、IRS1、 IRS1ser307在胎盤(pán)組織中的蛋白表達(dá)水平，與對(duì)照組相比，GDM組胎盤(pán)中SOCS3(圖5a、b)表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，其表達(dá)量是對(duì)照組的3.06倍(3.06±0.46)；IRS1(圖5a、c)表達(dá)下調(diào)(P<0.01)，其表達(dá)量?jī)H有對(duì)照組的2/3左右(0.67±0.13)；IRS1ser307(圖5a、d)表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，其表達(dá)量是對(duì)照組的2.97倍(2.97±0.24)。

圖5Western Blot檢測(cè)SOCS3、IRS1、 IRS1ser307的蛋白表達(dá)水平

2.6 GDM胎盤(pán)組織中SOCS3與IRS1、IRS1ser307蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析 為進(jìn)一步研究SOCS3與IRS1、IRS1ser307蛋白表達(dá)的關(guān)系，采用Spearman 秩和相關(guān)性分析GDM胎盤(pán)組織中SOCS3與IRS1、SOCS3與IRS1ser307的相關(guān)性。經(jīng)分析SOCS3與IRS1之間的相關(guān)性(r=-0.635 4，P<0.000 1)，SOCS3與IRS1ser307之間的相關(guān)性(r=0.902 8，P<0.000 1)均呈強(qiáng)相關(guān)，見(jiàn)圖6。

圖6SOCS3與IRS1、IRS1ser307蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

3 討論

妊娠期糖尿病(GDM)是一種常見(jiàn)的妊娠期合并癥，且屬于高危妊娠。雖然國(guó)內(nèi)外對(duì)于GDM的研究已有40多年的時(shí)間，但GDM的發(fā)病機(jī)制至今仍未完全闡明。而機(jī)體局部和系統(tǒng)性胰島素抵抗(IR)是GDM的核心問(wèn)題[4]。近年來(lái)多項(xiàng)研究認(rèn)為，GDM的發(fā)生可能與胰島β細(xì)胞功能缺陷、激素水平、炎性因子、遺傳信息、日常飲食等因素有關(guān)。正常妊娠期間，孕婦對(duì)胰島素的敏感性及反應(yīng)性降低，因此IR可能是造成葡萄糖的攝取及利用障礙，導(dǎo)致GDM的關(guān)鍵原因之一[5]。

機(jī)體內(nèi)糖脂的代謝依賴于胰島素，胰島素則需要與細(xì)胞膜表面的胰島素受體結(jié)合，激活胰島素受體底物1(IRS1)，活化的IRS1進(jìn)一步啟動(dòng)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。IRS1是胰島素信號(hào)通路中連接細(xì)胞內(nèi)外的信號(hào)蛋白，是關(guān)鍵性分子，其表達(dá)量和活化水平極大地影響著胰島素生理效應(yīng)[6]。而IRS1不同位點(diǎn)的磷酸化，由于蛋白激酶的影響，對(duì)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)行正性或負(fù)性調(diào)控[7]，如絲氨酸位點(diǎn)Ser307、Ser612、Ser1101活化抑制信號(hào)傳導(dǎo)，而酪氨酸位點(diǎn)Tyr 989活化則是促進(jìn)信號(hào)傳導(dǎo)。在正常生理?xiàng)l件下，胰島素與細(xì)胞表面受體結(jié)合前，IRS1以絲氨酸磷酸化為主，以關(guān)閉信號(hào)通路；當(dāng)胰島素結(jié)合受體后，IRS1酪氨酸位點(diǎn)磷酸化，競(jìng)爭(zhēng)性抑制絲氨酸位點(diǎn)的磷酸化，同時(shí)啟動(dòng)下游信號(hào)通路，從而發(fā)揮生理效應(yīng)[8]；但I(xiàn)R發(fā)生時(shí)，由于高糖等狀態(tài)的存在，胰島素與受體結(jié)合后，IRS1酪氨酸位點(diǎn)的磷酸化減弱，絲氨酸磷酸化作用增強(qiáng)，抑制了胰島素信號(hào)向下游傳導(dǎo)，進(jìn)一步加重IR、高糖狀態(tài)[9-10]。研究表明，IRS1表達(dá)量減少以及過(guò)度的絲氨酸磷酸化可導(dǎo)致胰島素信號(hào)傳導(dǎo)紊亂[11-12]。Hu等[13]在人肝細(xì)胞癌(HepG2)中發(fā)現(xiàn)，橙皮苷通過(guò)下調(diào)TLR4，上調(diào)IRS1的表達(dá)，來(lái)改善HepG2細(xì)胞中的IR。Zhang等[14]也發(fā)現(xiàn)WEE(Edgeworthia gardneri)在HepG2細(xì)胞中可能通過(guò)IRS1/GSK3β/FoxO1信號(hào)通路的調(diào)控來(lái)發(fā)揮抗IR作用，WEE通過(guò)上調(diào)IRS1，以及IRS1酪氨酸磷酸化的表達(dá)來(lái)降低IR作用。本實(shí)驗(yàn)在GDM組中，IRS1表達(dá)降低，IRS1ser307表達(dá)升高，這與文獻(xiàn)研究一致。

SOCS3在機(jī)體內(nèi)分布廣泛，與人體脂質(zhì)代謝、免疫、炎癥、妊娠等密切相關(guān)。SOCS3可負(fù)調(diào)控生長(zhǎng)激素、瘦素、泌乳素等細(xì)胞因子的信號(hào)傳遞，還與多種受體如促紅細(xì)胞受體、胰島素受體、瘦素受體等連接發(fā)揮對(duì)多種因子的調(diào)節(jié)作用。SOCS3 可競(jìng)爭(zhēng)性地與胰島素受體及活化的IRS 相結(jié)合，阻礙正常的IRS/PI3K/PKB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，而抵抗素可上調(diào) SOCS3 的表達(dá)，誘導(dǎo) IR 的發(fā)生。在 IR 狀態(tài)下，IRS 的絲氨酸磷酸化水平升高，并抑制酪氨酸磷酸化水平，從而降低IRS 的活性、加速 IRS 的降解，繼而影響胰島素信號(hào)的傳遞。Jorgensen等[15]的研究發(fā)現(xiàn)特異性敲除小鼠骨骼肌中SOCS3基因后，IRS1 的表達(dá)水平和Akt的磷酸化明顯升高，從而抑制了高胰島素血癥和胰島素抵抗的發(fā)展。Li等[16]研究發(fā)現(xiàn)miR-152可以通過(guò)下調(diào)SOCS3的表達(dá)來(lái)抑制GDM小鼠的肝臟IR。Xu等[17]則在2型糖尿病(T2DM)中研究發(fā)現(xiàn)，Angptl7通過(guò)上調(diào)SOCS3的表達(dá)，導(dǎo)致IRS1在蛋白酶體中的降解，進(jìn)而促進(jìn)IR和T2DM。Chen等[18]在HepG2 和 C2C12細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)黑果樹(shù)花青素通過(guò)下調(diào)SOCS3表達(dá)，提高IRS1水平，降低IRS1ser307表達(dá)，來(lái)減弱IR作用，增強(qiáng)HepG2 和 C2C12 細(xì)胞中的胰島素敏感性和糖原合成。本實(shí)驗(yàn)在GDM組中，SOCS3表達(dá)水平升高，這與文獻(xiàn)研究結(jié)果一致。

本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還顯示GDM產(chǎn)婦胎盤(pán)組織中SOCS3蛋白表達(dá)水平與IRS1表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，與IRS1ser307表達(dá)水平呈正相關(guān)。提示SOCS3可能在GDM的IR發(fā)展中起一定作用，SOCS3有望成為GDM治療的新方向、新靶點(diǎn)。