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        菜心小孢子培養(yǎng)技術(shù)的研究進(jìn)展

        2022-10-27 10:13:04任海龍周賢玉孫藝嘉李光光江定張華戴修純張晶鄭巖松
        長江蔬菜 2022年18期

        任海龍,周賢玉,孫藝嘉,李光光,江定,張華,戴修純,張晶,鄭巖松

        (廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 510308)

        菜心(Brassica campestrisL.ssp.chinensisvar.utilisTsen et Lee)又名菜薹,是嶺南地區(qū)栽培規(guī)模最大的特產(chǎn)蔬菜之一,僅廣東省每年的栽培面積就在300萬畝(20萬hm2)次以上。近年來,以寧夏為代表的菜心產(chǎn)業(yè)化布局快速發(fā)展,使之成為一種全國性的大宗蔬菜,在我國蔬菜生產(chǎn)中的地位越來越重要[1]。菜心主要通過雜交選育的方式獲得新品種,選育過程一般需6~8代,相當(dāng)費(fèi)工費(fèi)時(shí),且長期自交還會出現(xiàn)種性衰退現(xiàn)象[2]。整齊一致且生產(chǎn)性能強(qiáng)的雜交菜心品種是當(dāng)前育種追求的主要目標(biāo)。應(yīng)用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)獲得單倍體,進(jìn)而加倍成后代完全純合的雙單倍體植株(DH植株),可在短時(shí)間內(nèi)獲得純合、穩(wěn)定的育種材料,從而大幅度縮短育種年限,并且還能分離得到隱性性狀,在創(chuàng)制菜心優(yōu)良自交系和提高育種效率方面具有明顯優(yōu)勢,因而備受關(guān)注[3~10]。

        1982年Robert[11]首次利用小孢子培養(yǎng)技術(shù),成功獲得了甘藍(lán)型油菜的小孢子胚狀體及其再生植株。自此以后,游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)入了快速發(fā)展階段,國內(nèi)外已先后將小孢子培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用到油菜[12]、大白菜[13,14]和甘藍(lán)類蔬菜[15]的育種中。 我國在20世紀(jì)90年代中期才報(bào)道了菜心小孢子培養(yǎng)的研究[16],相對于其他十字花科蔬菜,菜心小孢子培養(yǎng)的起步晚,難度大,還未有培育出品種的報(bào)道。

        菜心繁種田

        1 菜心小孢子培養(yǎng)的影響因素

        1.1 基因型

        基因型被認(rèn)為是影響菜心游離小孢子成胚的首要因素。朱允華等[4]以特早50、青梗菜心和四九菜心(19)為供試材料,分析了影響菜心游離小孢子培養(yǎng)的因素,認(rèn)為基因型對小孢子培養(yǎng)起著決定性的作用,不同材料間誘導(dǎo)頻率差異顯著;曾小玲等[5]以11個(gè)不同基因型的菜心栽培品種為試材,結(jié)果有7個(gè)基因型材料獲得小孢子胚,且不同基因型誘導(dǎo)形成胚的頻率存在顯著差異,同樣表明基因型是影響菜心小孢子胚發(fā)生的重要因素;Wong等[17]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),晚熟類型比早熟類型菜心小孢子的出胚率高。近年來,楊易等[8]和趙艷艷等[9]對不同基因型菜心進(jìn)行了小孢子離體培養(yǎng)的胚胎誘導(dǎo)研究,結(jié)果均表明,基因型是決定菜心品種能否出胚的一個(gè)重要因素,不同基因型試材間小孢子胚誘導(dǎo)率具有明顯差異。

        1.2 生理狀態(tài)

        單核靠邊期被認(rèn)為是小孢子成胚誘導(dǎo)的最佳時(shí)期,小孢子發(fā)育時(shí)期通常需要在顯微鏡下鏡檢確定。為了取樣方便,Wong等[17]提出花蕾在2.0~2.9 mm時(shí)的出胚率最佳;龐強(qiáng)強(qiáng)等[2]研究也發(fā)現(xiàn)菜心小孢子發(fā)育時(shí)期與花蕾和花藥外部形態(tài)特征密切相關(guān),得出單核靠邊期的花蕾縱徑3.05~3.39 mm,花萼長3.25~3.46 mm,花瓣長2.10~2.33 mm,瓣萼比為0.63~0.71,花藥長2.57~2.89 mm、瓣藥比為0.77~0.85,可作為不同材料花蕾最佳取樣時(shí)期的鑒定指標(biāo),為菜心小孢子花蕾的選擇提供了依據(jù)。

        另外,植株生長的環(huán)境條件也會影響小孢子胚或胚狀體的產(chǎn)量。曾小玲等[5]的試驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)晝夜氣溫在12~24℃時(shí)菜心胚誘導(dǎo)率較高,夜溫低于10℃或日溫高于30℃時(shí)均不利于菜心游離小孢子的出胚,春季小孢子培養(yǎng)的脫分化能力比秋季高。

        1.3 預(yù)處理

        小孢子培養(yǎng)需要打破配子體原有的發(fā)育方向,溫度調(diào)節(jié)是主要手段。朱允華等[4]認(rèn)為,4℃低溫預(yù)處理幼花穗可明顯提高小孢子胚狀體的誘導(dǎo)率;Cao等[16]研究認(rèn)為,在小孢子培養(yǎng)體系中,將過濾后的菜心小孢子于33℃熱激處理1 d,對游離小孢子的膨大至關(guān)重要,不進(jìn)行熱激處理或熱激處理3 d都會明顯抑制小孢子的成胚;Wong等[17]發(fā)現(xiàn),32℃熱激處理48 h出胚效果更好。

        1.4 培養(yǎng)基及其添加物

        菜心小孢子培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)基是B5培養(yǎng)基和NLN培養(yǎng)基,B5培養(yǎng)基用于沖洗液,NLN培養(yǎng)基用于胚狀體誘導(dǎo)。通常還會添加蔗糖、NAA、6-BA和活性炭等促進(jìn)小孢子胚胎的發(fā)育。當(dāng)前已發(fā)表的菜心小孢子培養(yǎng)基配方如表1。

        表1 已發(fā)表的菜心小孢子培養(yǎng)基配方

        蔗糖濃度為100~170 g/L的NLN培養(yǎng)基是進(jìn)行菜心小孢子胚誘導(dǎo)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。楊易等[8]采用不同蔗糖濃度和激素配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)基,對不同基因型菜心進(jìn)行小孢子離體培養(yǎng)的胚胎誘導(dǎo),認(rèn)為不同蔗糖濃度的NLN誘導(dǎo)率差異顯著,NLN-10誘導(dǎo)效果最佳,出胚率最高,達(dá)30.46胚/皿,在NLN-10中分別添加0.1 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA,能顯著提高出胚率,是不加激素NLN-10處理出胚率的1.5倍,但該激素組合對難出胚的試驗(yàn)材料無促進(jìn)出胚作用,且當(dāng)6-BA和NAA濃度均提高到0.2 mg/L時(shí),胚胎生長發(fā)育受到抑制;趙艷艷等[9]以10個(gè)菜心品種為試材進(jìn)行小孢子培養(yǎng)及體系優(yōu)化,結(jié)果表明,同一基因型在不同培養(yǎng)基成分誘導(dǎo)條件下,添加活性炭對小孢子胚狀體誘導(dǎo)率的影響較大,培養(yǎng)基中蔗糖質(zhì)量濃度為130 g/L時(shí)胚誘導(dǎo)率最高,在培養(yǎng)基中添加0.05 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA可以顯著提高菜心胚狀體誘導(dǎo)率;此外,朱允華等[4]也認(rèn)為培養(yǎng)基中加入活性炭可改善胚的分化;與固定的蔗糖濃度NLN培養(yǎng)基不同,曾小玲等[5]提出熱激培養(yǎng)第1天用170 g/L高濃度蔗糖培養(yǎng)之后轉(zhuǎn)換成含130 g/L蔗糖培養(yǎng)基能顯著提高小孢子胚誘導(dǎo)率,同時(shí)添加0.05 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA能促進(jìn)菜心小孢子誘導(dǎo)成胚,添加0.4 mg/L GA3可顯著提高菜心小孢子胚芽誘導(dǎo)率和平均每胚出芽數(shù);顧宏輝等[3]在前人研究的基礎(chǔ)上,以早熟菜心品種油青四九為供體材料,認(rèn)為熱激誘導(dǎo)后更換培養(yǎng)液比不換培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)能明顯改善胚狀體質(zhì)量,提高正常胚狀體比例;近年,牛劉靜等[6,7]在大白菜培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上建立了增城菜心和連州菜心的小孢子培養(yǎng)體系,并探討了細(xì)胞器抗氧化劑(VcNa)和植物生長調(diào)節(jié)劑(BR和TDZ)對小孢子胚胎發(fā)生及胚狀體再生成苗的影響,認(rèn)為在NLN-13培養(yǎng)基中添加適宜濃度的BR或TDZ可顯著提高連州菜心小孢子胚胎發(fā)生率和直接成苗率,擴(kuò)展了原有小孢子添加物的種類。

        2 菜心染色體加倍與植株再生

        染色體加倍是培育菜心雙單倍體植株的關(guān)鍵。顧宏輝等[3]的研究表明,游離小孢子培養(yǎng)的菜心具有較高比例的自發(fā)二倍體(70%)及四倍體(8%),較少的混倍體,這與甘藍(lán)型油菜再生植株的倍性分布相反,可以省去加倍等繁瑣步驟,能直接應(yīng)用于育種研究中。龐強(qiáng)強(qiáng)等[10]對3份不同基因型的菜心研究發(fā)現(xiàn),再生植株的二倍體自然加倍率在62.22%~71.11%,75 mg/L秋水仙素處理可以提高再生株系的二倍體率。

        3 存在問題與發(fā)展方向

        雖然菜心的小孢子培養(yǎng)已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展,但是目前菜心尚未形成統(tǒng)一的小孢子培養(yǎng)體系,且出胚率和植株成苗率仍然不是很高,體系的重復(fù)性和穩(wěn)定性都不好,致使還未能在育種中應(yīng)用。如新近發(fā)表的文章中,趙艷艷等[9]認(rèn)為,130 g/L蔗糖濃度NLN(NLN-13)小孢子胚誘導(dǎo)率最高,在培養(yǎng)基中添加0.05 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA可以顯著提高菜心胚狀體誘導(dǎo)率;而楊易等[8]則認(rèn)為,100 g/L蔗糖濃度NLN(NLN-10)小孢子胚誘導(dǎo)率最高,130 g/L蔗糖濃度NLN(NLN-13)會明顯降低菜心的出胚率,分別添加0.1 mg/L 6-BA和NAA的出胚效果最佳。所報(bào)道的菜心小孢子培養(yǎng)體系大相徑庭,建議今后應(yīng)從以下3個(gè)方面著手開展工作。

        菜心小孢子胚狀體和幼苗

        ①對已報(bào)道的菜心小孢子體系進(jìn)行優(yōu)化,找到一種適合各菜心基因型的普適型培養(yǎng)體系,使小孢子培養(yǎng)技術(shù)得到更廣泛的應(yīng)用。

        ②在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步簡化和完善菜心小孢子培養(yǎng)體系中預(yù)處理方式、培養(yǎng)基成分及外源添加物等方案,大幅提高小孢子的出胚率。

        ③開展菜心小孢子胚胎發(fā)育過程和發(fā)育途徑的基礎(chǔ)研究,為完善菜心單倍體育種技術(shù)提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

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