張金武 沈露 肖騁 魯建華 陳夢宇 陳莉

(咸寧市中心醫(yī)院(湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院)神經(jīng)內(nèi)科，湖北 咸寧 437099)

缺血性腦疾病屬于神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其發(fā)病率和死亡率都很高，治療效果較差，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及生命安全〔1〕。氧化應(yīng)激、炎癥是缺血性腦損傷等疾病的重要病理生理反應(yīng)，其可相互影響，進(jìn)一步討論腦缺血損傷的分子機(jī)制，尋找有效的神經(jīng)保護(hù)策略是臨床治療新的策略〔2，3〕。研究表明腦缺血時(shí)腦組織lncRNA表達(dá)發(fā)生了顯著改變，參與了腦缺血的病理生理學(xué)過程，可作為急性缺血性腦卒中診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物的靶點(diǎn)〔4，5〕。組蛋白去甲基化酶同源物1D反義1(JHDM1D-AS1)是一種長的非編碼RNA(lncRNA)，JHDM1D-AS1過表達(dá)通過調(diào)節(jié)miR-101-3p/雙特異性磷酸酶(DUSP)1軸減輕臂叢神經(jīng)損傷后脊髓中神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元損傷，發(fā)揮對神經(jīng)的保護(hù)作用〔6〕。過氧化氫(H2O2)處理的牙周膜干細(xì)胞中JHDM1D-AS1下調(diào)，JHDM1D-AS1上調(diào)通過降低熱休克蛋白家族成員(DNAJ)C10及真核細(xì)胞起始因子(eIF)2α的磷酸化，從而保護(hù)牙周膜干細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的凋亡〔7〕。而JHDM1D-AS1對腦損傷的影響及機(jī)制尚不清楚。研究報(bào)道m(xù)iR-144-3p過表達(dá)顯著降低了神經(jīng)元的細(xì)胞活力，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，并增加了氧化應(yīng)激；而下調(diào)miR-144-3p可以保護(hù)神經(jīng)元免受氧葡萄糖剝奪和復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷〔8〕。腦缺血再灌注損傷中miR-144-3p被上調(diào)，lncRNA Rian過表達(dá)通過miR-144-3p/GATA結(jié)合蛋白(GATA3)信號傳導(dǎo)減弱了腦缺血再灌注損傷引起的細(xì)胞凋亡〔9〕。H2O2是常見的活性氧化物，可導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)〔10〕。本實(shí)驗(yàn)用H2O2誘導(dǎo)PC12建立腦損傷模型，研究JHDM1D-AS1是否通過調(diào)控miR-144-3p影響PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1材料 PC12細(xì)胞(無錫欣潤生物科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(北京凱瑞基生物科技有限公司)；H2O2溶液(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司)；熒光定量試劑盒(武漢科昊佳生物科技有限公司)；凋亡檢測試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)；腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(南京賽泓瑞生物科技有限公司)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒〔弗元(上海)生物科技有限公司〕。

1.2細(xì)胞處理與分組 PC12細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后加入含40 μmol/L H2O2的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，作為模型(Model)組，正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照(Con)組；將pcDNA、pcDNA-JHDM1D-AS1、anti-miR-NC、miR-144-3p inhibitor轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞后用40 μmol/L的H2O2處理，記為Model+pcDNA組、Model+pcDNA-JHDM1D-AS1組、Model+anti-miR-NC組、Model+miR-144-3p inhibitor組；將pcDNA-JHDM1D-AS1分別與miR-NC、miR-144-3p mimic共轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞后用40 μmol/L的H2O2處理，記為Model+pcDNA-JHDM1D-AS1+miR-NC組、Model+pcDNA-JHDM1D-AS1+miR-144-3p mimic組。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測JHDM1D-AS1和miR-144-3p表達(dá)水平 提取細(xì)胞總RNA，合成cDNA后按試劑盒說明進(jìn)行PCR，循環(huán)條件為95℃ 3 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；相對表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算。JHDM1D-AS1和miR-144-3p分別以GAPDH和U6為內(nèi)參，JHDM1D-AS1上游引物：5′-CCTCGCGACGCTGAGAGAATC-3′，下游：5′-ACGGCACATTCCTCCCTCGGA-3′；GAPDH上游引物：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游：5′-TCCACCCTGTTGCTGTA-3′；miR-144-3p上游引物：5′-CTCACTCACATCAACAGACATTAATT-3′，下游：5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTGTC-3′；U6上游引物：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′，下游：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，加入10 μl的膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)，再加入5 μl的碘化丙啶(PI)，混勻后避光孵育10 min；用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.5試劑盒檢測細(xì)胞SOD活性和MDA含量 細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收集各組細(xì)胞，嚴(yán)格按試劑盒說明操作。

1.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測TNF-α、IL-1β水平 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后取上清，具體按照試劑盒操作進(jìn)行檢測。

1.7雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測JHDM1D-AS1和miR-144-3p的靶向關(guān)系 構(gòu)建JHDM1D-AS1的野生型和突變型熒光素酶載體WT-JHDM1D-AS1和MUT-JHDM1D-AS1，將其分別與miR-NC和miR-144-3p共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞PC12中，按照說明書檢測熒光素酶活性。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1JHDM1D-AS1對H2O2誘導(dǎo)的PC12損傷的影響 與Con組相比，Model組PC12細(xì)胞中JHDM1D-AS1表達(dá)水平明顯降低，miR-144-3p表達(dá)水平明顯升高，細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與Model組和Model+pcDNA組相比，Model+pcDNA-JHDM1D-AS1組PC12細(xì)胞中JHDM1D-AS1表達(dá)水平明顯升高，miR-144-3p表達(dá)水平明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，見表1，圖1。

圖1 JHDM1D-AS1對H2O2誘導(dǎo)的PC12凋亡的影響

2.2JHDM1D-AS1對H2O2誘導(dǎo)的PC12氧化應(yīng)激的影響 與Con組相比，Model組PC12細(xì)胞中SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高(P<0.05)；與Model組和Model+pcDNA組相比，Model+pcDNA-JHDM1D-AS1組PC12細(xì)胞中SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低(P<0.05)，見表1。

2.3JHDM1D-AS1對H2O2誘導(dǎo)的PC12炎癥因子的影響 與Con組相比，Model組PC12細(xì)胞中TNF-α、IL-1β含量升高(P<0.05)；與Model組和Model+pcDNA組相比，Model+pcDNA-JHDM1D-AS1組PC12細(xì)胞中TNF-α、IL-1β含量降低(P<0.05)，見表1。

表1 JHDM1D-AS1對H2O2誘導(dǎo)的PC12損傷氧化應(yīng)激、炎癥因子的影響

2.4JHDM1D-AS1靶向miR-144-3p JHDM1D-AS1與miR-144-3p有結(jié)合位點(diǎn)(圖2)；WT-JHDM1D-AS1與miR-144-3p共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光素酶活性降低(P<0.001)，MUT-JHDM1D-AS1與miR-144-3p共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光素酶活性無顯著變化，見表2。

表2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

圖2 JHDM1D-AS1靶向miR-144-3p

2.5抑制miR-144-3p對H2O2誘導(dǎo)的PC12損傷氧化應(yīng)激和炎癥因子的影響 與Model+anti-miR-NC組相比，Model+miR-144-3p inhibitor組細(xì)胞凋亡率明顯降低，SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低，TNF-α、IL-1β含量明顯降低(均P<0.001)，見圖3，表3。

圖3 抑制miR-144-3p對H2O2誘導(dǎo)的PC12凋亡的影響

表3 抑制miR-144-3p對H2O2誘導(dǎo)的PC12損傷氧化應(yīng)激和炎癥因子的影響

2.6miR-144-3p可逆轉(zhuǎn)JHDM1D-AS1對H2O2誘導(dǎo)的PC12損傷氧化應(yīng)激和炎癥因子的影響 與Model+pcDNA-JHDM1D-AS1+miR-NC組相比，Model+pcDNA-JHDM1D-AS1+miR-144-3p mimic組細(xì)胞凋亡率明顯升高，SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高，TNF-α、IL-1β含量明顯升高(均P<0.001)，見表4，圖4。

表4 miR-144-3p可逆轉(zhuǎn)JHDM1D-AS1對H2O2誘導(dǎo)的PC12損傷氧化應(yīng)激和炎癥因子的影響

圖4 miR-144-3p可逆轉(zhuǎn)JHDM1D-AS1對H2O2誘導(dǎo)的PC12凋亡的影響

3 討 論

腦缺血后的神經(jīng)元損傷是個(gè)復(fù)雜的病理過程，深入分析其分子機(jī)制，通過促進(jìn)或抑制相關(guān)lncRNA或miRNA的表達(dá)可能對腦損傷相關(guān)疾病的治療有益〔11，12〕。研究報(bào)道JHDM1D-AS1可減輕神經(jīng)炎癥，對神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用〔6〕。在營養(yǎng)饑餓狀態(tài)下增加的JHDM1D-AS1表達(dá)通過上調(diào)血管生成來加速胰腺癌腫瘤生長〔13〕。JHDM1D-AS1與DHX15相互作用，增強(qiáng)了非小細(xì)胞肺癌的生長和轉(zhuǎn)移〔14〕。而JHDM1D-AS1對H2O2誘導(dǎo)的PC12氧化應(yīng)激和炎癥的影響還尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過表達(dá)JHDM1D-AS1抑制了H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)。

研究報(bào)道m(xù)iR-144-3p模擬物可促進(jìn)促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，加速噬斑的形成從而導(dǎo)致載脂蛋白(Apo)E-/-小鼠動脈粥樣硬化的病理進(jìn)展加快〔15〕。抑制miR-144-3p可增強(qiáng)視網(wǎng)膜色素上皮中依賴核因子E2相關(guān)因子(Nrf)2的抗氧化信號，并防止氧化應(yīng)激引起的外部視網(wǎng)膜變性〔16〕。血紅素可通過上調(diào)miR-144-3p損害炎癥消退〔17〕。以上研究表明miR-144-3p參與氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抑制miR-144-3p表達(dá)抑制了H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)。且本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)JHDM1D-AS1靶向調(diào)控miR-144-3p，而miR-144-3p過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了JHDM1D-AS1對H2O2誘導(dǎo)的PC12氧化應(yīng)激和炎癥因子的影響。

綜上，JHDM1D-AS1過表達(dá)可能通過下調(diào)miR-144-3p減輕H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。