張麗麗 梁娜娜

(1揚州大學醫(yī)學院臨床醫(yī)學系，江蘇 揚州 225200；2江蘇省人民醫(yī)院浦口分院神經(jīng)內(nèi)科)

頸動脈粥樣硬化(CAS)是由于巨噬細胞源性泡沫細胞在頸動脈內(nèi)壁積累形成硬化斑塊及病變，導致頸動脈壁增厚，動脈腔狹窄。頸動脈斑塊的不斷生長或脫落會造成腦供血不足，引發(fā)缺血性腦卒中，嚴重危害中老年人健康〔1〕。CAS受到遺傳、飲食和環(huán)境等多種因素影響〔2,3〕。脂代謝異常引發(fā)的巨噬細胞泡沫化是頸動脈斑塊形成的主要因素〔4〕。既往研究發(fā)現(xiàn)血液中的氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)可以誘導血管內(nèi)皮細胞功能失常，引發(fā)巨噬細胞內(nèi)膽固醇積累，并引發(fā)巨噬細胞自噬、凋亡，促進巨噬細胞泡沫化〔5,6〕，然而ox-LDL誘導巨噬細胞泡沫化的遺傳調(diào)控機制還不是很清楚。MicroRNAs(miRNAs)是一類長度約22 nt的小非編碼RNA，其可以通過與靶基因mRNA特定序列互補配對，調(diào)控靶基因的穩(wěn)定性和翻譯活性，影響其下游基因的表達〔7〕。當前的研究發(fā)現(xiàn)，許多miRNAs深度參與了ox-LDL誘導的巨噬細胞泡沫化的過程〔8～10〕。本研究通過分析CAS患者與健康志愿者血漿樣品中miR-204的表達，進一步利用體外ox-LDL誘導巨噬細胞泡沫化的實驗模型，揭示了miR-204在調(diào)控巨噬細胞膽固醇積累和凋亡過程中的重要作用。

1 材料和方法

1.1一般資料 (1)CAS組：選擇2016年9月至2017年6月在揚州大學醫(yī)學院附屬江都人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科經(jīng)頸動脈超聲檢查診斷明確的CAS患者35例，男21例，女14例；年齡51～77歲，平均年齡為(67.3±9.1)歲。納入患者均排除出血或缺血性腦卒中、自身免疫性疾病、惡性腫瘤及肝、腎、心肺功能障礙。(2)對照組：選擇同期醫(yī)院體檢正常者30例，其中男17例，女13例，年齡47～78歲，平均年齡(66.2±9.7)歲。

1.2試劑和耗材 血漿和血清miRNA提取試劑盒(美國QIAGEN公司)，佛波酯(PMA)、膽固醇含量測定試劑盒(美國Sigma-Aldrich公司)，莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)反轉(zhuǎn)錄試劑混盒(北京全式金公司)，SYBR綠色熒光PCR預混液(美國Roche公司)，RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液、異硫氰酸熒光素(FITC)-膜聯(lián)蛋白(Annexin)V(美國ThermoFisher公司),人單核細胞白血病細胞(THP-1，武漢普諾賽生命科技有限公司)，人源ox-LDL(上海翊圣生物科技公司)，CCK-8細胞活力檢測試劑(日本同仁化學)，飽和油紅O染色液(北京索萊寶生物科技公司)。

1.3方法

1.3.1樣本的收集 使用乙二胺四乙酸(EDTA)采血管采集CAS組和對照組空腹靜脈血5 ml，血液樣品自然沉降2 h后，放置于4℃預冷的離心機中，2 000 r/min離心10 min，收集上層血漿，隨后采用QIAGEN公司的血漿和血清miRNA提取試劑盒抽提血漿樣品中的總RNA，抽提方法按照產(chǎn)品說明書進行。

1.3.2RNA提取純化及熒光定量PCR檢測 取1 μg總RNA，加入多聚胸腺嘧啶、T重復寡核苷酸引物，放置于70℃孵育5 min，隨后立即放置于冰上退火。在反應體系中加入M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、5×反應緩沖液、RNA酶抑制劑，于42℃孵育1 h，得到cDNA。以cDNA為模板，使用SYBR綠色熒光PCR預混液進行實時熒光定量PCR檢測miR-204的表達水平。miR-204特異性引物序列正義鏈：5′-UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU-3′，反義鏈見試劑盒；選擇U6基因為內(nèi)參，其特異性引物序列為：U6-正義鏈：5′-GCTTCGAGGCAGGTTACATG-3′；U6-反義鏈：5′-GCAACACACAACATCTCCCA-3′。

1.3.3細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 THP-1生長于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，放置在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗前，在培養(yǎng)基中加入終濃度為100 ng/ml的PMA處理48 h，誘導細胞分化為巨噬細胞，隨后轉(zhuǎn)染對照miRNA(NC-miRNA)或miR-204模擬物(mimic)，并用100 μg/ml ox-LDL孵育48 h。THP-1源性巨噬細胞分為4組：NC組，轉(zhuǎn)染NC-miRNA；miR-204組，轉(zhuǎn)染miR-204 mimic；ox-LDL+NC組，轉(zhuǎn)染NC-miRNA，并加入ox-LDL誘導；ox-LDL+miR-204組，轉(zhuǎn)染miR-204 mimics，并加入ox-LDL誘導。

1.3.4細胞內(nèi)膽固醇含量檢測 收集各組細胞，用磷酸鹽緩沖液清洗后，細胞冰上裂解后，3 000 r/min離心去除細胞碎片，并將上清分成3份，分別按照產(chǎn)品說明書測定細胞內(nèi)總膽固醇、游離膽固醇和蛋白濃度，并計算膽固醇/蛋白相對含量(μg/mg蛋白)，細胞膽固醇脂含量計算公式為：膽固醇脂=總膽固醇-游離膽固醇。

1.3.5油紅O染色 取0.1 g油紅O粉末溶于10 ml異丙醇中，充分溶解后放置于4℃冰箱保存。染色前，將油紅O溶液與蒸餾水按照2∶3比例充分混勻，得到油紅O染色液。收集各組細胞，用磷酸鹽緩沖液洗1次，加入4%多聚甲醛溶液室溫固定15 min,隨后加入500 μl油紅O染色液，染色30 min，用磷酸鹽緩沖液漂洗3次。

1.3.6CCK-檢測細胞活性 各組THP-1源性巨噬細胞等量接種于96孔板中(每孔2×105個)，待細胞充分貼壁后進行轉(zhuǎn)染和ox-LDL處理。48 h后每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)放置于37℃培養(yǎng)4 h。使用酶標儀讀取450 nm波長的吸光值A，并計算相對細胞活性。

1.3.7流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組細胞，經(jīng)磷酸鹽緩沖液漂洗1遍，調(diào)整細胞密度至2×106個/ml，取200 μl，1 000 r/min離心，收集沉淀細胞，加入200 μl Annexin V結(jié)合緩沖液重懸，再加入10 μl FITC-Annexin V染色液，室溫避光孵育15 min，再加入300 μl結(jié)合緩沖液，混勻后用流式細胞儀檢測，統(tǒng)計FITC陽性細胞比例。

1.4統(tǒng)計學分析 采用統(tǒng)計軟件GraphPad7.0進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1外周血血漿中miR-204的表達 CAS組血漿中miR-204表達水平顯著低于對照組(0.72±0.12 vs 1.00±0.09;P<0.05)。

2.2THP-1細胞膽固醇脂積累檢測 相比于NC組或miR-204組，ox-LDL+NC組和ox-LDL+miR-204組細胞總膽固醇和膽固醇脂含量均顯著上升(P<0.05)，表明ox-LDL處理引起了巨噬細胞內(nèi)的膽固醇積累。與ox-LDL+NC組相比，ox-LDL+miR-204組細胞總膽固醇含量沒有明顯變化(P>0.05)，膽固醇脂含量顯著下降(P<0.05)。見表1。

表1 各組細胞膽固醇脂及點膽固醇比較

細胞膽固醇脂主要貯存在脂滴中。使用油紅O對各組細胞染色標記脂滴，從圖1可以看出，與NC組和miR-204組相比，ox-LD+NC組和ox-LDL+miR-204組細胞內(nèi)脂滴的大小明顯增大，數(shù)量明顯變多。然而ox-LDL+miR-204組中脂滴明顯小于ox-LDL+NC組。

2.3細胞凋亡水平檢測 凋亡細胞FITC-Annexin V染色呈陽性(圖2)。與NC組和miR-204組相比，ox-LDL+NC組和ox-LDL-miR-204組細胞凋亡率顯著上升(均P<0.05)，而與ox-LDL+NC組相比，ox-LDL+miR-204組細胞凋亡率顯著下降(P<0.05)。見表2。

圖2 FITC-Annexin V染色檢測細胞凋亡水平

2.4細胞活力檢測 與NC組相比，miR-204組細胞活力沒有明顯變化(P>0.05)。與NC組和miR-204組比較，ox-LDL+NC組和ox-LDL+miR-204組細胞活力顯著下降(均P<0.05)。與ox-LDL+NC組相比，ox-LDL+miR-204組細胞活力顯著上升(P<0.05)。見表2。

白色箭頭指示細胞內(nèi)的脂滴圖1 各組油紅O染色標記細胞內(nèi)脂滴(×400)

表2 各組細胞活力及凋亡率比較

3 討 論

CAS會導致頸動脈腔狹窄，引起腦供血不足，甚至誘發(fā)缺血性腦卒中，帶來嚴重的健康風險〔1〕。在CAS的疾病進展過程中，由于脂質(zhì)代謝出現(xiàn)異常，外周血中的單核-巨噬細胞被脂質(zhì)浸潤，并大量攝取血清中的LDL及膽固醇，游離膽固醇進一步在細胞內(nèi)固化成為膽固醇脂，貯存在脂滴中，引起巨噬細胞泡沫化，成為泡沫細胞〔11〕。泡沫細胞中脂質(zhì)的積累帶來的脂毒性會引發(fā)巨噬細胞程序性死亡，并通過分泌大量細胞因子增強局部炎癥，也導致血管內(nèi)皮細胞功能異常，最終形成粥樣硬化斑塊〔12〕。

血漿中存在大量的外泌體介導細胞間通訊，外泌體中含有的大量miRNA和蛋白參與了許多疾病的進展過程，并可以作為疾病的診斷提供依據(jù)〔13〕。研究表明，miRNA作為重要的遺傳調(diào)控因子，通過調(diào)控巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞的功能，影響了CAS疾病進展〔1〕。Koga等〔14〕發(fā)現(xiàn)miR-204在家族性地中海熱病人血清中的表達水平明顯下降，而細胞水平的實驗也表明miR-204可以抑制脂多糖引起的巨噬細胞活化及炎癥因子的釋放。本研究結(jié)果提示miR-204可能參與了CAS疾病的發(fā)生過程，過表達miR-204可以抑制ox-LDL引發(fā)的巨噬細胞膽固醇脂的積累，而不影響總膽固醇的攝取，在巨噬細胞中過表達miR-204可以抑制ox-LDL誘導的巨噬細胞活力下降和凋亡，推測其原因可能是由于膽固醇脂積累減少緩解了細胞脂毒性。Yan等〔15〕利用小鼠巨噬細胞RAW264.7研究發(fā)現(xiàn)，miR-204可以靶向細胞周期依賴性激酶抑制因子(CDKN)2A,調(diào)控巨噬細胞的凋亡，然而miR-204調(diào)控巨噬細胞膽固醇脂積累的作用機制還需要進一步研究探討。

綜上所述，miR-204在CAS患者血漿中含量下降，其在調(diào)控巨噬細胞泡沫化過程中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。而含有miR-204的外泌體是否可以緩解CAS的疾病進展還需要動物實驗探究。