卓冰冷 彭艷 周志玉

(海口市人民醫(yī)院健康管理體檢部，海南 ?？?570208)

卵巢癌是一種常見的女性惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率居女性腫瘤的前列，預(yù)后不良，嚴重影響女性健康〔1〕。卵巢癌早期癥狀不明顯，大部分患者確診時已是晚期，且發(fā)生轉(zhuǎn)移，增加臨床的治療難度，進一步導(dǎo)致卵巢癌患者預(yù)后差、死亡率居高不下〔2〕。卵巢癌的治療方式除常見的手術(shù)、放化療外，基因治療成為研究的熱點〔3,4〕。微小RNA(miRNA)是近年來研究的熱點，可作為腫瘤診斷、治療的潛在基因靶點。miR-145在多腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可通過調(diào)控miR-145影響腫瘤細胞的生長、侵襲〔5〕。黃芩是一種常見的中草藥，對多種疾病如肺炎、高血壓等有治療作用〔6,7〕?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芩對腫瘤的病理演進過程發(fā)揮抑制作用。黃芩苷是一種天然黃酮，是黃芩的主要活性成分，被研究證實在多種腫瘤細胞增殖過程中發(fā)揮抑制作用〔8,9〕，其抗腫瘤作用機制較復(fù)雜，尚未完全明確。本研究擬從miR-145的角度探究黃芩苷對卵巢癌細胞增殖、侵襲的調(diào)控作用，為黃芩苷抗腫瘤機制的進一步闡釋提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實驗主要材料 卵巢癌多種細胞系(SKOV3、HO-8910、SW626、A2780、Caov-3)購自北納生物有限公司，黃芩苷購自中國藥品生物制品檢定所，DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、L15培養(yǎng)基、胎牛血清、四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，Lipofectamine2000購自美國Life Technologies公司，Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)購自寶生物工程(大連)有限公司；流式細胞檢測試劑盒購自美國賽默飛世爾生物科技有限公司，Transwell小室購自美國Corning公司，miR-145抑制劑購自上海吉凱生物有限公司。酶標儀購自德國Binder公司，流式細胞儀、7500熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2細胞的培養(yǎng) Caov-3、A2780細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，SKOV3、HO-8910細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，SW626細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的L15培養(yǎng)基，均置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱孵育。

1.3細胞的轉(zhuǎn)染 選取對數(shù)期Caov-3細胞，隨機分為對照組、黃芩苷(100 μmol/L)組、anti-miR-145組、黃芩苷+anti-miR-145組。在Lipofectamine2000說明書指示下，anti-miR-145組Caov-3細胞中轉(zhuǎn)染miR-145抑制劑；黃芩苷+anti-miR-145組細胞中轉(zhuǎn)染miR-145抑制劑后加入100 μmol/L黃芩苷進行處理，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，對照組為常規(guī)培養(yǎng)的Caov-3細胞。

1.4qPCR實驗 黃芩苷粉與適量DMSO溶液充分混合，濃度調(diào)整為5 000 μmol/L，暗室中保存，實驗前，加入細胞培養(yǎng)液稀釋為1 μmol/L、5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L，分別加入各組細胞中，在Trizol試劑說明書指示下，提取各組卵巢癌細胞總RNA，加入1.0 μl逆轉(zhuǎn)錄酶，37℃孵育15 min，95℃孵育5 s，合成cDNA。以β-actin為參照，進行qPCR，根據(jù)qPCR實際說明書指示，擴增條件為95℃ 3 min，95℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)，結(jié)果采用2-ΔΔCt法進行計算。miR-145和β-actin引物由上海生工合成，miR-145正義鏈：5′-TTGTCCTCACGGTCCAGTTT-3′，反義鏈：5′-TTTCCA GGAATCCCCATCTTAGC-3′；β-actin正義鏈：5′-GC ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3′，反義鏈：5′-TCACCTTCACCGTTCCAGTTTTT-3′。

1.5MTT實驗 收集對照組、黃芩苷(100 μmol/L)組、anti-miR-145組、黃芩苷+anti-miR-145組Caov-3細胞，將3×103個Caov-3細胞接種至96孔板，37℃培養(yǎng)24、48、72 h，每孔Caov-3細胞中加入20 μl MTT(5 mg/ml)，37℃培養(yǎng)4 h，每孔Caov-3細胞中加入150 μl DMSO，37℃培養(yǎng)10 min，振蕩15 min，置于酶標儀檢測570 nm吸光值(A值)。

1.6流式細胞術(shù)實驗 將對照組、黃芩苷(100 μmol/L)組、anti-miR-145組、黃芩苷+anti-miR-145組Caov-3細胞濃度調(diào)整為1×106/ml，37℃培養(yǎng)24 h，每組設(shè)置5個復(fù)孔，吸取10 μl 磷脂酰結(jié)合蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)和5 μl碘化丙啶(PI)加入每孔Caov-3細胞，暗室中染色15 min，置于流式細胞儀中檢測凋亡率。

1.7Transwell實驗 收集對照組、黃芩苷(100 μmol/L)組、anti-miR-145組、黃芩苷+anti-miR-145組轉(zhuǎn)染24 h的Caov-3細胞，加入無血清培養(yǎng)基重懸，基質(zhì)膠與DMEM培養(yǎng)基按1∶5進行稀釋，加入Transwell小室膜中，進行細胞侵襲實驗；Transwell上室加入2×105個Caov-3細胞重懸液，Transwell下室加入600 μl含10%胎牛血清培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h；磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗、棉簽輕輕擦拭Transwell上室，甲醛固定30min，結(jié)晶紫染色30min，顯微鏡下拍照、計數(shù)5個區(qū)域細胞，取其平均值。細胞遷移實驗Transwell小室不添加基質(zhì)膠稀釋液，其與同侵襲。

1.8統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1黃芩苷對卵巢癌多種細胞系中miR-145表達量的影響 與人正常卵巢上皮細胞(IOSE80，1.000±0.085)相比，100 μmol/L黃芩苷作用于卵巢癌多種細胞系(SKOV3、HO-8910、SW626、A2780、Caov-3)明顯促進miR-145的表達量(1.653±0.112，1.896±0.105，2.315±0.164，3.251±0.232，3.852±0.241，P<0.05)，其中在Caov-3細胞中的表達量相對較高。

2.2不同濃度黃芩苷對miR-145表達量的影響 與對照組(1.000±0.073)相比，1、5、25、50、100 μmol/L黃芩苷組miR-145相對表達量(1.265±0.087、1.315±0.109、2.152±0.185、3.025±0.231、3.865±0.263)均顯著升高，且呈濃度依賴性(P<0.05)；因此選取100 μmol/L黃芩苷作為后續(xù)實驗對象。

2.3黃芩苷聯(lián)合miR-145抑制劑對miR-145表達量的影響 與對照組比較，100 μmol/L黃芩苷組miR-145相對表達量顯著升高(P<0.05)；與100 μmol/L黃芩苷組比較，anti-miR-145組miR-145相對表達量顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-145組比較，黃芩苷+anti-miR-145組miR-145相對表達量顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 黃芩苷聯(lián)合miR-145抑制劑對miR-145表達量、細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移

2.4黃芩苷聯(lián)合miR-145抑制劑對細胞增殖的影響 與對照組比較，100 μmol/L黃芩苷組48、72 h細胞增殖顯著降低(P<0.05)；與100 μmol/L黃芩苷組比較，anti-miR-145組48、72 h細胞增殖顯著升高(P<0.05)；與anti-miR-145組比較，黃芩苷+anti-miR-145組48、72 h細胞增殖顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.5黃芩苷聯(lián)合miR-145抑制劑對細胞凋亡的影響 與對照組比較，100 μmol/L黃芩苷組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與100 μmol/L黃芩苷組比較，anti-miR-145組細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-145組比較，黃芩苷+anti-miR-145組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見表1，圖1。

圖1 黃芩苷聯(lián)合miR-145抑制劑對細胞凋亡的影響

2.6黃芩苷聯(lián)合miR-145抑制劑對細胞侵襲、遷移的影響 與對照組比較，100 μmol/L黃芩苷組細胞遷移和侵襲細胞數(shù)顯著降低(P<0.05)；與100 μmol/L黃芩苷組比較，anti-miR-145組細胞遷移和侵襲細胞數(shù)顯著升高(P<0.05)；與anti-miR-145組比較，黃芩苷+anti-miR-145組細胞遷移和侵襲細胞數(shù)顯著降低(P<0.05)。見表1，圖2。

圖2 黃芩苷聯(lián)合miR-145抑制劑對細胞遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

3 討 論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，也是女性腫瘤死亡率居高不下的主要原因。卵巢癌患者預(yù)后差，目前無有效治療方案。miRNA被證實參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并與腫瘤患者的臨床病理特征顯著相關(guān)，可作為腫瘤基因靶向診斷、治療的潛在分子靶點〔10～13〕。miR-145被證實在多腫瘤生長、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。在非小細胞肺癌中，miR-145表達量降低，過表達miR-145抑制細胞的遷移和侵襲〔14〕。miR-145在膀胱癌組織及多種細胞系中表達量降低，過表達miR-145可抑制細胞的增殖及促進細胞凋亡，表明miR-145有抗腫瘤作用〔15〕。在卵巢癌組織生長過程中，miR-145表達量明顯降低，過表達miR-145顯著抑制細胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡〔16〕，表明miR-145在卵巢癌病理進程中發(fā)揮重要的作用。

黃芩苷是中藥黃芩的重要活性成分，被證實有多種病理作用如抗感染〔17〕、抗病毒〔18〕等。研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可通過調(diào)控miRNA的表達量從而影響腫瘤細胞的增殖、侵襲等過程。黃芩苷作用的前列腺癌細胞中miR-485-5p表達量顯著增加，表明黃芩苷可能通過促進miR-485-5p表達量抑制前列腺癌細胞增殖〔19〕。與正常乳腺細胞相比，miR-126在乳腺癌細胞中表達量明顯降低，進一步檢測黃芩苷作用的乳腺癌細胞中miR-126表達量明顯上調(diào)，提示黃芩苷可能通過上調(diào)miR-126抑制乳腺癌細胞的增殖、促進凋亡〔20〕。上述研究表明，黃芩苷可能通過調(diào)控腫瘤細胞中的miRNA表達量發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究結(jié)果表明miR-145在卵巢癌病理演進過程中發(fā)揮抗癌作用，與劉龍浩等〔16〕報道結(jié)果相一致；100 μmol/L黃芩苷可抑制Caov-3細胞的增殖、侵襲、遷移，促進凋亡，進一步證實黃芩苷在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抗癌作用；黃芩苷作用于轉(zhuǎn)染miR-145抑制劑的Caov-3細胞中發(fā)現(xiàn)，miR-145抑制劑與黃芩苷聯(lián)合作用明顯逆轉(zhuǎn)黃芩苷對Caov-3細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用及凋亡促進作用，表明在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中，黃芩苷通過上調(diào)miR-145抑制細胞的惡性生物學特性。

綜上，黃芩苷可上調(diào)卵巢癌細胞中miR-145的表達量，有一定濃度依賴性；黃芩苷抑制Caov-3細胞增殖、遷移、侵襲，促進凋亡，其作用機制是通過上調(diào)miR-145的表達量。本實驗僅在細胞水平進行了初步研究，未來會通過構(gòu)建動物模型、探究miR-145下游靶基因等多方面進一步研究黃芩苷的作用機制。