呂威力 邢雪松

(沈陽醫(yī)學(xué)院 1病理學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110034；2解剖學(xué)教研室)

研究發(fā)現(xiàn)成年動物腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs) 的增殖分化促進(jìn)腦缺血修復(fù)，通過分化的新生神經(jīng)元替代受損的神經(jīng)元，在一定程度上能夠改善神經(jīng)功能缺損〔1～4〕。 Wnt5a信號通路在促進(jìn)細(xì)胞增殖分化等過程中起著十分關(guān)鍵的作用,參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種信號途徑〔5〕。本研究建立大鼠血管性癡呆(VD)模型探討VD相關(guān)信號分子Wnt5a與內(nèi)源性NSCs的改變及行為學(xué)訓(xùn)練的影響，初步闡明VD中內(nèi)源性VD增殖分化的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1VD模型的制備 選用健康雄性2月齡wistar大鼠54只，體重220～240 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動物許可證號〔SCXK(遼)2015-0001〕。隨機(jī)分為：假手術(shù)組(Sham組，3、7、14、21 d，n=6)，模型組(Model組，3、7、14、21 d,n=24)，訓(xùn)練組(Training組，3、7、14、21 d,n=24)。采用兩血管阻斷加硝普鈉降壓法建立VD動物模型。術(shù)前4 h禁水，12 h禁食。手術(shù)臺上仰臥位固定大鼠，1%(45 mg/kg)戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒后進(jìn)行頸正中切口，分離兩側(cè)頸總動脈(CCA)，雙側(cè)迷走神經(jīng)用玻璃針分離，注意避免牽拉，在夾閉雙側(cè)頸總動脈之前，腹腔注射2.5 mg/kg硝普鈉，然后動脈夾無創(chuàng)夾閉雙側(cè)頸總動脈10 min，再通10 min，再10 min夾閉，打開動脈夾縫合傷口，局部慶大霉素抗菌后放回籠中正常飼養(yǎng)。用多導(dǎo)生物記錄儀在實(shí)驗(yàn)過程中統(tǒng)計(jì)大鼠血壓，結(jié)果顯示大鼠平均動脈壓在103 mmHg左右，注射硝普鈉后動脈壓迅速下降到51 mmHg左右，2 min后動脈壓會緩慢上升到69 mmHg，持續(xù)1 h左右。大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中直腸溫度保持在37℃左右，以防止溫度降低對腦缺血損傷的修復(fù)作用。假手術(shù)組不注射硝普鈉和阻斷頸總動脈，其他處置與建模大鼠相同。造模1 d后訓(xùn)練組給予行為學(xué)訓(xùn)練，分別在3、7、14、21 d后處死取腦，然后進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.2穿梭箱訓(xùn)練 條件刺激是聲音，非條件刺激是電擊。將大鼠先放在穿梭箱內(nèi)進(jìn)行暗適應(yīng)5 min，然后進(jìn)行聲音刺激5秒，如果大鼠不穿梭到另一側(cè)，就進(jìn)行電擊，電流強(qiáng)度為15 mA，使大鼠逃到另一側(cè)不通電的箱底，然后電擊停止。如果不逃到另一側(cè)箱底就電擊5 s。讓大鼠休息30 s后進(jìn)行下一輪訓(xùn)練。穿梭箱訓(xùn)練在造模后進(jìn)行，每次進(jìn)行20次聲和電的刺激實(shí)驗(yàn)。

1.3行學(xué)評分 各組大鼠手術(shù)后進(jìn)行模型篩選，大鼠造模是否成功主要通過神經(jīng)行為學(xué)評分進(jìn)行評定，神經(jīng)行為學(xué)評分參照了Zea Longa等〔16〕5分制標(biāo)準(zhǔn)：沒有神經(jīng)功能缺損0分；前爪不能完全伸展1分；大鼠行走的時候向兩側(cè)晃動2分；大鼠行走時身體向兩側(cè)傾倒3分；不能自發(fā)行走意識喪失4分。評分后0分和4分大鼠要被剔除，補(bǔ)充確保每個亞組6只大鼠。

1.4Nestin免疫熒光染色 常規(guī)灌注各組大鼠，然后取腦，連續(xù)冠狀冰凍切片，片厚約30 μm，進(jìn)行免疫熒光檢測。PBST 0.01 mol/L洗滌切片，30 min 37℃孵育。硼酸緩沖液0.1 mol/L浸泡，PBST 0.01 mol/L洗滌。加入血清A，15 min 37℃孵育，勿洗傾去。滴加稀釋1∶2 000的羊抗Nestin一抗，4℃過夜。PBST 0.01 mol/L洗滌。滴加1∶100四甲基若丹明異硫氰酸鹽(TRITC)-兔抗山羊二抗，避光30 min 37℃孵育。0.01 mol/L PBST洗滌，貼片避光陰干稀釋甘油封片后進(jìn)行熒光顯微鏡觀察和拍片。選取每只大鼠切片中3張具有典型反應(yīng)的切片，在海馬齒狀回區(qū)每張切片取3個視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，采用Image-Pro Plus5.0圖像處理軟件對結(jié)果進(jìn)行圖像分析處理進(jìn)行Nestin陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.5Wnt5a 的免疫組織化學(xué)檢測 取各組缺血大鼠前囟-3.14～前囟-4.5 mm海馬區(qū)，片厚3 mm左右，4%多聚甲醛固定液浸入24 h后，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測Wnt5a在缺血海馬的表達(dá)情況。37℃在切片上滴山羊血清30 min，分別4℃過夜滴加一抗兔抗鼠Wnt5a，37℃滴二抗60 min，37℃滴入ABC復(fù)合液60 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色15 min，蒸餾水沖洗后常規(guī)脫水，透明中性樹膠封片。陰性對照片用0.01 mol/L PBS代替一抗。光鏡下用Metamorph/Evolution MP5.0顯微圖像分析系統(tǒng)每張切片測5個相同單位面積的平均灰度值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析。

2 結(jié) 果

2.1行為學(xué)評分 Sham組大鼠神經(jīng)功能評分均為(0.00±0.00)分，無缺損。Training組與Model組相比，行為學(xué)評分下降明顯〔(2.21±0.31)分vs(3.01±0.27)分，P<0.05〕。

2.2穿梭箱測試結(jié)果 與Sham組相比，Model組AAR和PAR率都顯著下降(P<0.05)。Training組的AAR和PAR率顯著高于Model組(P<0.05)。見表1。

表1 各組穿梭箱測試結(jié)果比較

2.3HE染色評估組織學(xué)改變 Sham組海馬神經(jīng)元排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)元數(shù)量密集；Model組細(xì)胞周圍的間隙變寬，神經(jīng)元腫脹變性，分布不均，3 d亞組變化明顯；見圖1。與Model組比較，Training組海馬神經(jīng)元腫脹明顯減少，細(xì)胞形態(tài)明顯改善，神經(jīng)元數(shù)量較多。

圖1 Model組和 Training組3 d HE染色(×400)

2.4Nestin免疫熒光染色檢測 Sham組海馬可見切片上少量的散在的Nestin陽性細(xì)胞,3 d、7 d、14 d、21 d間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Model組3 d組,缺血海馬Nestin免疫陽性細(xì)胞表達(dá)開始增多,表現(xiàn)為大小不一并且呈簇狀分布;7 d組Nestin陽性細(xì)胞達(dá)峰值;21 d組缺血海馬Nestin免疫陽性細(xì)胞數(shù)有所減少，但是持續(xù)表達(dá);Training組與Model組比較,3 d、7 d、14 d和21 d缺血海馬Nestin免疫陽性細(xì)胞都顯著增多(P<0.05) 。見表2、圖2。

圖2 各組海馬Nestin及Wnt5a陽性細(xì)胞(×400)

表2 各組Nestin陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)及Wnt5a表達(dá)比較

2.5Wnt5a免疫組織化學(xué)檢測 腦組織切片中顯示W(wǎng)nt5a蛋白陽性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有黃色或棕褐色顆粒。Sham組Wnt5a在海馬表達(dá)輕微。Model組7 d Wnt5a反應(yīng)陽性產(chǎn)物比Sham組明顯增多，隨缺血再灌注時間的進(jìn)一步延長逐漸減少，14 d組表達(dá)逐漸減少，直到21 d組(P<0.05)。Training組在缺血海馬神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)可見棕黃色顆粒Wnt5a表達(dá)，較Model組各亞組陽性產(chǎn)物表達(dá)增加(P<0.05)。見表2。

3 討 論

VD是由腦血管因素造成腦組織損害所引起的癡呆綜合征，主要臨床癥狀為記憶力減退、表情淡漠和人格改變。目前已經(jīng)證實(shí)在成人海馬齒狀回的顆粒下區(qū)有一定數(shù)量內(nèi)源性NSCs。在一定條件下缺血NSCs反應(yīng)性增殖，遷移到受損部位并且分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，最終對神經(jīng)功能修復(fù)的過程具有一定的促進(jìn)作用〔7～9〕。

VD 患者缺血腦組織發(fā)生的病理性變化明顯，比如大量神經(jīng)元凋亡，這些改變在缺血海馬組織中同樣可以觀察到，并且可以逐漸延伸到海馬周邊結(jié)構(gòu)。目前研究海馬組織是VD患者缺血腦組織結(jié)構(gòu)中最明顯的易受損區(qū)。海馬作為機(jī)體感覺和運(yùn)動的整合區(qū)，同認(rèn)知功能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸的可塑性相關(guān)，是學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)。同時海馬投射部位和學(xué)習(xí)記憶中樞有著不小的重疊區(qū)域，這樣就可以理解VD 和海馬之間的緊密聯(lián)系了〔10,11〕。

Wnts家族是富含半胱氨酸的分泌蛋白，可通過結(jié)合受體激活體內(nèi)多種細(xì)胞內(nèi)信號通路來調(diào)控多種生物功能，比如各種細(xì)胞的增殖分化、凋亡存活和遷移能力等。Wnt5a在胚胎期及出生后各種組織器官細(xì)胞功能的發(fā)育中發(fā)揮重要作用。Wnt5a可以促進(jìn)胚胎發(fā)育過程中神經(jīng)的生長，因此基因突變后可導(dǎo)致胚胎體軸發(fā)育不良導(dǎo)致死亡。Wnt5a信號途徑對脊椎動物早期發(fā)育同樣發(fā)揮著重要的作用，比如背腹排列方向，匯聚延伸及各器官的形成。異種移植模型表明，Wnt5a信號通路還可以通過激活促癌基因的異常表達(dá)包括基質(zhì)金屬蛋白酶和層黏連蛋白，能使祖細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)，參與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程?，F(xiàn)在證實(shí)Wnt5a確實(shí)可影響造血細(xì)胞的增殖分化，外周血單核細(xì)胞有Wnt5a及其受體Fz的表達(dá)可以促進(jìn)其向樹突細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。Wnt5a可以通過激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)，損害胰島素受體底物的活性，從而抑制胰島素信號，致使產(chǎn)生胰島素抵抗。越來越多的證據(jù)表明，Wnt5a不僅在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、組織形成過程中起重要作用，Wnt5a及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有可能成為疾病診斷與治療的分子靶點(diǎn)〔12～16〕。

本研究結(jié)果說明，穿梭箱訓(xùn)練促進(jìn)缺血海馬損傷修復(fù)中起到至關(guān)重要的作用，Wnt5a對神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化具有促進(jìn)作用。