李煒娟 李小京 林少龍 任清風 任曉慧 徐群英 張中偉 肖元梅

(1南昌大學撫州醫(yī)學院，江西 撫州 344000；2南昌大學公共衛(wèi)生學院)

鉛可造成多系統(tǒng)多臟器的損傷，如心血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)。神經(jīng)系統(tǒng)對鉛比較敏感，微量鉛暴露便可以引起神經(jīng)系統(tǒng)的功能異常〔1〕。研究顯示：鉛誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷后，產(chǎn)生大量的活性氧自由基，這些自由基不穩(wěn)定，可與DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等大分子物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，使DNA單雙鏈發(fā)生斷裂，失去原來的結(jié)構(gòu)與功能〔2〕。DNA連接酶Ⅲ是存在于真核生物中能夠?qū)蓷lDNA鏈連接起來的酶。在DNA單雙鏈斷裂修復(fù)、堿基切除修復(fù)中，DNA 連接酶Ⅲ通過與多種基因(如PARP1、XRCC1、PNK等)結(jié)合參與氧化應(yīng)激損傷位點的修復(fù)〔3〕。目前，未見鉛中毒對DNA 連接酶Ⅲ蛋白表達的報道。本研究通過分析飲水鉛暴露大鼠腦組織連接酶Ⅲ蛋白表達水平及其與氧化應(yīng)激之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 三水合乙酸鉛(西隴化工廠，分析純)；腦組織蛋白提取試劑盒(OMEGE公司)；過氧化物酶(CAT)、過氧化氫(H2O2)、羥自由基抑制活力(抑制OH-活力)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；β-actin鼠抗(美國earthox)；Anti-DNA LigⅢ兔抗(Abcam公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；多功能酶標儀(美國 Molecular Devices)；鉛標準溶液(國家標準物質(zhì)研究中心)；AA-6300C型石墨爐原子吸收分光光度計(日本島津公司)；AAS SOLAAR M6石墨爐原子吸收分光光度計(Thermo公司)；722可見分光光度計(上海精密科學儀器公司)；低溫高速離心機(德國 Hettich)；混勻器；恒溫水浴鍋；搖床；電泳設(shè)備。

1.2實驗動物分組及處理 40只剛斷乳SPF級SD大鼠〔動物合格證號：SCXK(京)2012-0001〕，購自北京維通利華實驗動物有限公司，體重90～100 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，根據(jù)體重按隨機區(qū)組法分為5個劑量組，分別飲用去離子水(對照組)、100 mg/L(最低劑量組)、200 mg/L(低劑量組)、400 mg/L(中劑量組)、800 mg/L(高劑量組)乙酸鉛溶液，動物染毒60 d后處死并取腦組織，具體處理方法參照李煒娟等〔4～7〕的方法。

1.3檢測指標及其方法 (1)Western印跡檢測SD大鼠腦組織DNA LigⅢ蛋白的表達量：SD大鼠腦組織蛋白提?。籅CA法測定腦組織蛋白濃度；電泳；蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜；5%牛血清白蛋白(BSA)封閉；加入一抗，4攝氏度過夜；洗膜；孵育二抗；洗膜；加入發(fā)光劑；曝光；定影。(2)大鼠血液及腦組織鉛含量的測定；(3)氧化應(yīng)激指標：CAT、H2O2、抑制羥自由基能力(OH-)測定；具體方法參照肖元梅、任清風的測定方法〔4～7〕。

1.4統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0軟件進行方差分析、Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1不同染鉛劑量組大鼠腦組織DNA LigⅢ蛋白表達水平比較 慢性飲水鉛暴露后，低劑量組、中劑量組、高劑量組大腦皮質(zhì)、小腦和海馬中DNA LigⅢ蛋白表達量均明顯低于對照組(P<0.05)，最低劑量組大鼠大腦皮質(zhì)、海馬DNA LigⅢ蛋白表達水平也明顯低于對照組(P<0.05)，隨著染鉛劑量的增加DNA LigⅢ蛋白表達水平呈下降趨勢，見表1。

2.2大鼠血液、腦組織中鉛含量的變化 各染鉛組大鼠血液、大腦皮質(zhì)、小腦、海馬鉛的含量均高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 各組腦組織中DNA LigⅢ蛋白表達及鉛含量比較

2.3大鼠腦組織氧化應(yīng)激指標水平比較 染鉛后，大腦皮質(zhì)、小腦和海馬CAT和抑制OH-活力均明顯低于對照組，而H2O2水平明顯高于對照組(P<0.05)，并隨著染鉛劑量的升高，腦組織CAT和抑制OH-活力呈逐漸下降趨勢，而H2O2含量呈逐漸升高趨勢(P<0.05)，見表2。

表2 不同劑量組腦組織CAT、H2O2、抑制OH-活力水平比較

2.4DNA LigⅢ蛋白表達量與血鉛含量和氧化應(yīng)激指標相關(guān)性分析 大腦皮質(zhì)、小腦和海馬DNA LigⅢ蛋白表達量均與腦鉛含量呈負相關(guān)(P<0.05，P<0.01)，與CAT、抑制OH-活力呈正相關(guān)(P<0.01)，而與H2O2呈負相關(guān)(P<0.01)，見表3。

表3 DNA LigⅢ蛋白表達量與腦組織鉛含量和氧化應(yīng)激指標的相關(guān)性分析(r值)

3 討 論

三磷酸腺苷(ATP)依賴性DNA酶在真核生物中共有3種，分別為DNA LigⅠ、DNA LigⅣ和DNA LigⅢ，前2種主要分布于真核生物中，而DNA LigⅢ主要分布于脊椎動物種，它們在DNA的復(fù)制、斷裂修復(fù)、損傷應(yīng)答及基因重組過程中發(fā)揮重要作用〔8〕。DNA LigⅢ在堿基切除修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。氧化應(yīng)激或堿基切除修復(fù)是造成DNA單鏈斷裂最常見的損傷形式。體外研究證實：過氧化氫由細胞外進入細胞核內(nèi)損傷DNA的方式有兩種：一種是直接損傷細胞核內(nèi)的DNA；另一種是通過與二價金屬離子結(jié)合生成氧化能力更強的羥自由基，生成的羥自由基使核酶活化，促使DNA鏈發(fā)生斷裂〔2〕。本研究說明鉛誘導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生氧化應(yīng)激損傷。DNA LigⅢ通過與多個基因結(jié)合〔如X射線修復(fù)交叉互補蛋白-XRCC、多聚二磷酸腺苷(ADP)核糖聚合酶-PARP、DNA聚合酶β-DNA polβ等〕參與氧化應(yīng)激或堿基切除造成的DNA單鏈斷裂的修復(fù)〔3〕。在哺乳動物中，DNA LigⅢ可以編碼α和β兩種剪切體，這兩種剪切體的不同之處在于C-端〔9〕。DNA LigⅢαC-端含有一個BRCA1羧基末端結(jié)構(gòu)域即BRCT結(jié)構(gòu)域，DNA LigⅢβC-端是由17～18個氨基酸組成的細胞核定位信號〔10〕。DNA LigⅢαC-端的BRCT結(jié)構(gòu)域可與XRCC1、PARP1結(jié)合。當DNA單鏈斷裂損傷發(fā)生后，PARP1識別受損傷的缺口，隨即被活化，活化的PARP1與單鏈斷裂處解離，此時DNA LigⅢαC-端的BRCT結(jié)構(gòu)域與XRCC1N-端的BRCT結(jié)構(gòu)域結(jié)合，形成一個穩(wěn)定的復(fù)合物，此異二聚體復(fù)合物置換PARP1，完成單鏈斷裂的修復(fù)〔11～14〕。趙明星〔15〕研究顯示，在DNA堿基切除修復(fù)過程中，DNA LigⅢα、XRCC1和DNA polβ三者可以兩兩形成復(fù)合物(DNA LigⅢα與XRCC1的親和力高于DNA polβ)，參與DNA損傷位點的修復(fù)。Sallmyr等〔16〕研究顯示，在患有慢性骨髓性白血病細胞中，DNA LigⅢ的表達量增加，同時發(fā)現(xiàn)DNA LigⅣ下降，選擇性阻斷DNA LigⅢ的作用可能是治療癌癥的一個手段。本研究說明鉛通過誘導(dǎo)神經(jīng)細胞氧化應(yīng)激損傷而使DNA LigⅢ蛋白表達水平下降。