李曉焱 臧學(xué)利 馬艷

(安徽省淮北礦工總醫(yī)院婦產(chǎn)科，安徽 淮北 235000)

慢性宮頸炎是臨床常見的婦科疾病之一，會導(dǎo)致陰道分泌物增多，月經(jīng)不調(diào)等癥狀，且纏綿難愈、復(fù)發(fā)性高〔1〕。人乳頭瘤病毒(HPV)是一種乳頭瘤空泡病毒A屬，屬于球形DNA病毒，能夠引起患者人體皮膚黏膜上的鱗狀上皮增殖〔2〕。90%以上的婦女在感染HPV后可通過自身免疫力清除病毒，5%～10%的婦女只能抑制病毒復(fù)制生長，無法完全清除病毒，成為潛伏感染，雖然不會有細胞學(xué)改變，但會維持高水平HPV病毒載量，成為持續(xù)感染〔3〕。高危型HPV是宮頸癌病變的主要危險因素，因此慢性宮頸炎合并HPV感染是宮頸癌高危因素之一。為了抵抗外部病原菌感染、抑制機體炎癥反應(yīng)，女性陰道的微生態(tài)系統(tǒng)包括陰道生理性結(jié)構(gòu)、陰道菌群、免疫系統(tǒng)〔4〕。陰道菌群是重要生物屏障，能夠維持陰道正常菌群構(gòu)成和微生態(tài)平衡。宮頸直接暴露在陰道內(nèi)，時刻受到陰道內(nèi)環(huán)境的影響，當(dāng)陰道內(nèi)環(huán)境平衡破壞時，會增加HPV感染機會，促進HPV發(fā)展成癌癥的可能。人體對HPV感染的第一道防線為免疫系統(tǒng)的黏膜表面，陰道黏膜表面的細胞免疫是陰道局部免疫的重要內(nèi)容，也是機體免疫功能的一部分，其中T細胞亞群是陰道局部細胞免疫的主要效應(yīng)細胞〔5〕。有研究顯示，高危型HPV感染雖然是宮頸病變的初始因素，但其進一步發(fā)生發(fā)展還需與其他因素發(fā)揮協(xié)同刺激作用，其中外陰和陰道炎癥是常見的協(xié)同因素之一〔6〕。本研究擬分析慢性宮頸炎伴HPV感染患者陰道菌群變化及血清T細胞亞群和炎性因子的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2021年1月于安徽省淮北礦工總醫(yī)院診治的81例慢性宮頸炎伴HPV感染中老年患者為觀察組，另選取HPV陰性的中老年慢性宮頸炎患者60例為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《婦產(chǎn)科學(xué)(第8版)》〔7〕中慢性宮頸炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中觀察組經(jīng)HPV檢測、TCT檢測和陰道鏡活檢確診為HPV感染；②有性生活史，入組時非妊娠期、月經(jīng)期及哺乳期者；③取材前72 h內(nèi)無性生活、無婦科檢查、無陰道沖洗及用藥者；④年齡>40歲；⑤患者精神狀態(tài)良好，配合檢查并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并盆腔創(chuàng)傷、宮頸手術(shù)史或惡性腫瘤者；②合并感染性、免疫性疾病或營養(yǎng)不良者；③合并心腦血管疾病等嚴(yán)重內(nèi)科疾病、肝腎功能損傷者；④有免疫抑制劑或激活劑用藥史者；⑤已進行全身或局部治療者。兩組年齡、病程、病變類型、病情分級比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組臨床資料比較

1.2方法 兩組均應(yīng)用無菌窺器暴露宮頸陰道部，使用棉拭子刮取部分陰道內(nèi)側(cè)分泌物于試管中，后續(xù)用于陰道微生態(tài)檢測。抽取清晨空腹肘靜脈血5 ml，離心后留取血清，后續(xù)用于宮頸T淋巴細胞亞群和炎性因子檢測。采用酶化學(xué)法檢測陰道微生態(tài)，包括pH、過氧化氫、白細胞酯酶、唾液酸苷酶、β-葡萄糖醛酸糖苷酶、凝固酶。并檢測滴蟲、霉菌、支原體、衣原體、孢子和假菌絲等陰道菌群分布情況〔8〕。所得標(biāo)本液經(jīng)3 000 r/min離心10 min，收集下層細胞并置于抗凝試管，使用FACSCalibur型流式細胞儀(美國Brctond-Dickinson公司)測定T細胞亞群(CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)水平，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測炎性因子〔干擾素(IFN)-γ、白細胞介素(IL)-2、IL-4〕水平，試劑盒購自武漢默沙東生物科技有限公司，檢測步驟根據(jù)試劑盒說明書進行〔9〕。酶化學(xué)法：取出裝有檢測卡的鋁箔袋及樣本稀釋液等試劑放置室溫30 min，使其恢復(fù)室溫，插入窺陰器，長棉拭子從陰道側(cè)壁或后穹窿處盡可能多采集分泌物，立即送檢；取一樣本管，將分泌物拭子置于該管中，滴加樣本稀釋液8～10滴；充分涮洗后用手指輕輕擠壓試管壁，使拭子吸附的液體流回試管，棄拭子，得到樣本液，立即檢測或蓋緊置冰箱短時間冷藏；從包裝袋中取出檢測卡，輕輕揭掉板貼，用吸管吸取樣本液，在檢測卡的每孔滴加1滴樣本液，之后分別滴加顯色液，置37℃溫育10 min，觀察各孔反應(yīng)，與比色卡對比。酶聯(lián)免疫吸附試驗：從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條，空白孔加標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本稀釋液，其余相應(yīng)孔中加標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100 μl/孔)，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，36℃孵箱孵育90 min，洗板5次?？瞻卓准由锼鼗贵w稀釋液，其余孔加入生物素化抗體工作液(100 μl/孔)。用新封板膠紙封住反應(yīng)孔，36℃孵箱孵育60 min，洗板5次?？瞻卓准用附Y(jié)合物稀釋液，其余孔加入酶結(jié)合物工作液(100 μl/孔)。用新封板膠紙封住反應(yīng)孔，36℃孵箱，避光孵育30 min，洗板5次。加入顯色底物(TMB)100 μl/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15 min，加入終止液100 μl/孔，混勻后即刻測量OD450值(3 min內(nèi))。

1.3觀察指標(biāo) 觀察兩組陰道菌群、血清T細胞亞群(CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)、炎性因子(IFN-γ，IL-2、IL-4)，比較觀察組不同陰道菌群情況、HPV感染情況患者的T細胞亞群和炎性因子水平。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗、Logistic回歸分析；繪制受試者工作特征(ROC)曲線評估T細胞亞群和炎性因子對陰道微生態(tài)失調(diào)的診斷價值。

2 結(jié) 果

2.1兩組陰道菌群比較 兩組衣原體陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；觀察組滴蟲、霉菌、支原體、細菌性陰道炎陽性率、陰道微生態(tài)失調(diào)比例均明顯高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組陰道菌群比較〔n(%)〕

2.2兩組血清T細胞亞群和炎性因子水平比較 觀察組CD4+、CD4+/CD8+、IFN-γ、IL-2水平均明顯低于對照組，CD8+、IL-4水平均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

表3 兩組血清T細胞亞群和炎性因子水平比較

2.3血清T細胞亞群和炎性因子與慢性宮頸炎伴HPV感染相關(guān)性 Logistics回歸分析顯示，血清CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IFN-γ，IL-2、IL-4與慢性宮頸炎伴HPV感染相關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 血清T細胞亞群和炎性因子與慢性宮頸炎伴HPV感染的關(guān)系分析

2.4不同陰道微生態(tài)狀態(tài)慢性宮頸炎伴HPV感染患者血清T細胞亞群和炎性因子水平比較 陰道微生態(tài)失調(diào)患者CD4+、CD4+/CD8+、IFN-γ、IL-2水平均明顯低于陰道微生態(tài)正?；颊撸珻D8+、IL-4水平均明顯高于陰道微生態(tài)正?；颊?均P<0.01)。見表5。

表5 不同陰道微生態(tài)狀態(tài)慢性宮頸炎伴HPV感染患者血清T細胞亞群和炎性因子水平比較

2.5血清T細胞亞群和炎性因子對中老年慢性宮頸炎伴HPV感染患者陰道微生態(tài)失調(diào)的診斷價值 血清CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IFN-γ，IL-2、IL-4診斷中老年慢性宮頸炎伴HPV感染患者陰道微生態(tài)失調(diào)的AUC分別為0.782、0.713、0.681、0.650、0.720、0.751。見表6，圖1。

表6 血清T細胞亞群和炎性因子診斷中老年慢性宮頸炎伴HPV感染患者陰道微生態(tài)失調(diào)的ROC曲線分析

圖1 血清T細胞亞群和炎性因子診斷中老年慢性宮頸炎伴HPV感染患者陰道微生態(tài)失調(diào)的ROC曲線

2.6中老年慢性宮頸炎伴HPV感染患者感染型構(gòu)成情況 81例中老年慢性宮頸炎伴HPV感染患者中，高危型HPV感染占比59.26%(48/81)，其中HPV16 16例(19.75%)、HPV31 5例(6.17%)、HPV33 7例(8.64%)、HPV52 10例(12.35%)、HPV58 10例(12.35%)；低危型HPV感染占比40.74%(33/81)，其中HPV6 4例(4.94%)、HPV11 17例(20.99%)、HPV43 11例(13.58%)。

2.7不同HPV分型中老年慢性宮頸炎伴HPV感染患者與血清T細胞亞群和炎性因子水平比較 高危HPV感染患者CD4+、CD4+/CD8+、IFN-γ、IL-2水平均明顯低于低危HPV感染患者，CD8+、IL-4水平均明顯高于低危HPV感染患者(P<0.01)。見表7。

表7 不同HPV分型中老年慢性宮頸炎伴HPV感染患者與血清T細胞亞群和炎性因子水平比較

3 討 論

慢性宮頸炎是常見婦科疾病，若未及時診治，隨著病情發(fā)展可能演變?yōu)閷m頸癌〔10〕。HPV是嗜人黏膜、皮膚復(fù)層鱗狀上皮的一類DNA病毒，與多種疾病如食管癌、肛周癌、宮頸癌、外陰癌、陰莖癌等均具有緊密聯(lián)系〔11〕。慢性宮頸炎合并HPV感染不僅會加重病情，也會增加臨床治療難度。陰道菌群分布和陰道免疫功能是陰道微生態(tài)的重要組成部分，能夠有效維持陰道微生態(tài)正常，陰道微生態(tài)平衡與女性生殖系統(tǒng)健康有密切關(guān)系，其能夠有效隔絕外界病原微生物的入侵〔12〕。陰道是獨特的動態(tài)變化的微生態(tài)體系，其中存在各種微生物菌群，與宿主環(huán)境之間保持相互協(xié)調(diào)、相互制約的微生態(tài)動態(tài)平衡，平衡破壞時HPV感染風(fēng)險增加，也會促使HPV發(fā)展成癌。探究慢性宮頸炎伴HPV感染患者陰道菌群改變，并分析其與患者機體其他因子之間的關(guān)系，能夠為臨床診治該病提供一定理論依據(jù)。

本研究結(jié)果說明中老年慢性宮頸炎伴HPV感染患者陰道菌群失調(diào)。韓一栩等〔13〕研究顯示，老年高危HPV感染患者陰道菌群失調(diào)，與本研究結(jié)果一致。HPV會促進陰道微生物繁殖，導(dǎo)致引導(dǎo)微生物菌群分布紊亂，導(dǎo)致陰道微生態(tài)失調(diào)。HPV感染導(dǎo)致的陰道微環(huán)境改變包括pH值和免疫功能，這種改變利于微生物繁殖，不僅會引起陰道菌群改變、結(jié)構(gòu)紊亂，而且外界病原微生物繁殖加速，促進宮頸炎、陰道炎等生殖系統(tǒng)炎癥，誘發(fā)其他疾病〔14〕。本研究結(jié)果提示慢性宮頸炎伴HPV感染會改變患者免疫功能，升高炎癥水平。李燕華等〔15〕研究結(jié)果中，合并HPV感染的不孕癥患者相較HPV陰性的不孕癥患者更易存在免疫功能紊亂。HPV感染并不是全身，局限于起始感染部位，第一防線陰道黏膜表面細胞免疫十分重要，T淋巴細胞是陰道局部細胞免疫的主要效應(yīng)細胞，分為CD4+、CD8+兩個細胞亞群〔16〕。其中CD4+可輔助細胞免疫和體液免疫，能夠呈遞抗原，在機體免疫應(yīng)答中處于核心地位，作為輔助性T淋巴細胞，主要作用是協(xié)助B淋巴細胞分化并產(chǎn)生抗體，能夠客觀反映機體免疫狀態(tài)。CD8+是抑制性T細胞和細胞毒性T細胞，具有免疫抑制作用和細胞毒性功能，CD4+細胞和CD8+細胞相互影響，共同調(diào)控免疫反應(yīng)并維持免疫平衡，當(dāng)CD4+細胞數(shù)目減少、CD8+細胞數(shù)目增加、CD4+/CD8+比例降低時機體免疫功能下降，導(dǎo)致各種疾病發(fā)生〔17〕。IFN-γ是活化的Th細胞和NK細胞產(chǎn)生的炎性因子，能夠促進Th1細胞發(fā)育和抑制Th2細胞活化增殖，參與免疫調(diào)節(jié)過程〔18〕。IL-2在免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)過程中均屬于核心細胞因子，能夠直接影響機體免疫功能和免疫狀態(tài)，當(dāng)其表達增多時巨噬細胞殺傷腫瘤的活性增強〔19〕。IL-4能夠促使Th細胞向Th2細胞分化，抑制Th細胞向Th1細胞分化，以此發(fā)揮抑制淋巴細胞激活殺傷細胞的功能。本研究Logistics回歸分析進一步說明血清T淋巴細胞和炎性因子在其中發(fā)揮的重要作用。

本研究結(jié)果表明陰道菌群對機體免疫功能、炎癥水平均會產(chǎn)生影響。具體分析可知，滴蟲侵入機體后能夠激發(fā)免疫應(yīng)答反應(yīng)，且滴蟲性陰道炎常伴有嚴(yán)重炎癥反應(yīng)。霉菌性陰道炎發(fā)病與否不僅取決于致病菌的毒力，也與機體免疫防御功能有關(guān)。細菌性陰道病可能會導(dǎo)致Th1/Th2細胞免疫功能失衡，向Th2偏移，進而細胞免疫受到抑制，降低免疫功能。支原體進入女性生殖道時，可引起生殖道局部炎癥反應(yīng)和炎性細胞浸潤，被活化的T細胞會分泌多種炎性因子，引起免疫應(yīng)答。且ROC分析結(jié)果顯示CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IFN-γ、IL-2、IL-4在診斷中老年慢性宮頸炎伴HPV感染患者陰道微生態(tài)失調(diào)中具有良好診斷效能，深入證實免疫功能和炎性細胞水平可反映陰道菌群改變和微生態(tài)環(huán)境。鄭淑敏等〔20〕研究中，高危型HPV感染的老年宮頸癌患者HPV水平與宮頸局部免疫功能指標(biāo)關(guān)系密切，與本研究結(jié)果一致。分析其原因，高危HPV病毒的E5蛋白會抑制免疫細胞中絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)信號通路活化，進而抑制抗原呈遞和細胞因子分泌等免疫反應(yīng)，導(dǎo)致機體免疫功能抑制，且HPV能夠抑制干擾素信號通路活化，進而影響免疫細胞正常產(chǎn)生干擾素和T淋巴細胞的活化，患者機體T淋巴細胞數(shù)量減少，也會加重機體炎癥水平。雖然與其他研究相比，本研究并未選擇宮頸組織的相關(guān)指標(biāo)水平進行對比分析，而是選擇外周血檢測指標(biāo)水平，更易被患者接受。但本研究仍具有一定不足，首先納入的樣本較少，其次僅分析高危型和低危型HPV與免疫功能的關(guān)系，未深入分析這二者與陰道菌群的關(guān)系，也未對慢性宮頸炎不同嚴(yán)重程度、病變類型患者陰道菌群、免疫功能進行對比，未來還需加大樣本量，在本研究基礎(chǔ)上給予深入分析疾病嚴(yán)重程度、病變類型、HPV感染型別對陰道菌群、免疫功能的影響。

綜上，中老年慢性宮頸炎伴HPV感染患者陰道菌群出現(xiàn)改變、微生態(tài)失調(diào)，且免疫功能下降，炎癥水平上升，血清T淋巴細胞和炎性因子水平不僅和慢性宮頸炎伴HPV感染的發(fā)病、HPV感染型別有密切關(guān)系，也可輔助臨床診斷陰道微生態(tài)失調(diào)。