鞠光秀，呂曉靜，劉 暢，楊 超，曲 欣*

（1.青島市疾病預(yù)防控制中心/青島市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究院，山東青島 266033；2.山東省質(zhì)量技術(shù)審查評(píng)價(jià)中心有限公司，山東濟(jì)南 250014）

合成著色劑也稱(chēng)為合成色素，是食品加工中重要的一類(lèi)食品添加劑，《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）[1]規(guī)定，食品中允許使用的合成著色劑只有日落黃等11種，除此以外，都禁止添加到食品中[2]。工業(yè)染料著色力強(qiáng)且價(jià)格低廉，常有不法商販將其非法添加到食品中以謀取不正當(dāng)利益。工業(yè)染料長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生致敏、致畸或致癌作用[3]。

目前，檢測(cè)食品中禁用工業(yè)染料的方法主要有超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，UPLCMS/MS）[4-5]和高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[6-7]。UPLC-MS/MS

靈敏度高、分辨率好，但儀器價(jià)格昂貴；HPLC使用普遍，具有成本低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。番茄醬的工業(yè)染料污染備受關(guān)注。本研究以違法添加較多的11種工業(yè)染料為檢測(cè)對(duì)象，通過(guò)前處理方法及液相色譜條件的優(yōu)化，建立了同時(shí)檢測(cè)番茄醬中11種工業(yè)染料（紅2G、酸性橙Ⅱ、堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、羅丹明B、對(duì)位紅和蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ）的高效液相色譜方法。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備與試劑

設(shè)備：1260Ⅱ高效液相色譜儀，配DAD檢測(cè)器（安捷倫公司）；N-EVAP 112氮吹儀（Organomation公司）；Heraeus Megafuge 8R高速冷凍離心機(jī)（Thermo Fisher公司）；KQ5200DB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器）。

試劑：酸性橙Ⅱ?yàn)锳ccuStandard產(chǎn)品；紅2G、羅丹明B、對(duì)位紅均為Dr. Ehrenstorfer GmbH產(chǎn)品；蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ均為First Standard產(chǎn)品；堿性橙2、堿性橙21和堿性橙22均為CNW產(chǎn)品。甲醇、乙腈、乙酸銨、乙酸均為色譜純；氨水為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

用乙腈溶解并配制濃度為10 μg·mL-1的11種工業(yè)染料混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。移取適量上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈-水（1∶1，V/V）溶液稀釋成濃度為0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、4.0 μg·mL-1、6.0 μg·mL-1和10 μg·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 色譜條件

ZORBAX SB-C18色 譜 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣體積：10 μL；流動(dòng)相：A 0.02 mol·L-1乙酸銨-0.1%乙酸水溶液，B 乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)：450 nm、485 nm和520 nm；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫條件

1.2.3 樣品前處理

稱(chēng)取均勻的番茄醬樣品5 g于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈（含0.5%乙酸），渦旋混勻1 min、超聲提取10 min，5 000 r·min-1離心5 min獲取上清液并置于另一離心管中，再次加入10 mL乙腈-水（1∶1，V/V）溶液重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，移取5 mL提取液40 ℃水浴下氮吹至近干，使用乙腈-水（1∶1，V/V）溶液定容至2 mL，過(guò)0.22 μm濾膜上機(jī)。

1.2.4 試驗(yàn)優(yōu)化

（1）色譜條件中檢測(cè)波長(zhǎng)的優(yōu)化。采用DAD檢測(cè)器，分別采集每種化合物的最大吸收波長(zhǎng)，綜合采集到的波長(zhǎng)數(shù)據(jù)，對(duì)最大吸收波長(zhǎng)相近的化合物采用同一波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。

（2）前處理方法中提取溶劑的選擇優(yōu)化。提取溶劑的選擇對(duì)實(shí)驗(yàn)的成敗至關(guān)重要，實(shí)驗(yàn)中綜合分析各個(gè)化合物的理化性質(zhì)，兼顧提取效率和實(shí)驗(yàn)成本，選取對(duì)目標(biāo)化合物溶解性較好的溶劑，并考察了不同組合溶劑的提取效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件中檢測(cè)波長(zhǎng)的優(yōu)化

11種化合物都有較強(qiáng)的紫外-可見(jiàn)光吸收，最大吸收波長(zhǎng)在410～550 nm。兼顧靈敏度的前提下，最大吸收波長(zhǎng)相近的化合物選擇了同一波長(zhǎng)。450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)堿性橙2，485 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)酸性橙Ⅱ、堿性橙21、堿性橙22、對(duì)位紅和蘇丹紅I～Ⅱ，520 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)紅2G、羅丹明B、蘇丹紅Ⅲ～Ⅳ。標(biāo)準(zhǔn)色譜圖如圖1所示。

圖1 11種工業(yè)染料混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.2 前處理方法中提取溶劑的選擇優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑

工業(yè)染料常用的提取溶劑有水、甲醇、乙腈、丙酮和混合溶液等。11種化合物中，紅2G水溶性強(qiáng)，酸性橙Ⅱ、羅丹明B、堿性橙2、堿性橙21和堿性橙22在水和有機(jī)溶劑中都有一定的溶解性，對(duì)位紅和蘇丹紅染料都不溶于水而易溶于有機(jī)溶劑。實(shí)驗(yàn)中考察了多種溶劑分別在提取溶劑用量為10 mL、20 mL、30 mL條件下的提取效率。提取溶劑用量為20 mL時(shí)，不同提取溶劑各化合物的回收率見(jiàn)表2（超聲時(shí)間為20 min）。結(jié)果表明，乙腈（含0.5%乙酸）比甲醇、純乙腈具有更高的提取效率，除紅2G和酸性橙Ⅱ外，其他染料的回收率達(dá)到75%以上。選用乙腈-水（1∶1，V/V）進(jìn)行二次提取，紅2G和酸性橙Ⅱ的回收率明顯提高。故選擇10 mL乙腈（含0.5%乙酸）和10 mL乙腈-水（1∶1，V/V）各提取一次，經(jīng)過(guò)兩次提取，回收率在85%以上。

表2 4種提取溶劑加標(biāo)回收率（單位：%）

2.2.2 溶劑用量

固定提取溶劑為乙腈（含0.5%乙酸）和乙腈-水，考察了不同溶劑用量（5 mL+5 mL、7.5 mL+7.5 mL、10 mL+10 mL、12.5 mL+12.5 mL、15 mL+15 mL、20 mL+20 mL）對(duì)11種染料回收率的影響。用量為5 mL+5 mL時(shí)，部分化合物的回收率小于50%，表明此用量不能將相應(yīng)化合物完全提取出來(lái)；用量為7.5 mL+7.5 mL時(shí)，所有染料回收率明顯提高，達(dá)到80%以上；用量為15 mL+15 mL和20 mL+20 mL時(shí)，個(gè)別染料的回收率稍有提高，但是增加溶劑用量對(duì)回收率貢獻(xiàn)較小。故選擇提取溶劑為10 mL乙腈（含0.5%乙酸）和10 mL乙腈-水，兩次提取。

2.2.3 超聲時(shí)長(zhǎng)

實(shí)驗(yàn)中考察了單次超聲時(shí)長(zhǎng)（5 min、10 min、15 min、20 min）對(duì)11種染料回收率的影響。結(jié)果表明，除單次超聲5 min大部分染料的回收率小于80%外，其他超聲時(shí)長(zhǎng)下，所有11種染料的回收率皆大于80%，但是延長(zhǎng)超聲時(shí)長(zhǎng)對(duì)回收率貢獻(xiàn)較小，故乙腈（含0.5%乙酸）和乙腈-水用量都為10 mL，每次超聲時(shí)長(zhǎng)為10 min。

2.3 方法線(xiàn)性和檢出限

以目標(biāo)化合物的峰面積對(duì)其質(zhì)量濃度進(jìn)行線(xiàn)性回歸，發(fā)現(xiàn)11種工業(yè)染料在1.2.2所述色譜條件下分離效果良好，線(xiàn)性范圍為0.5～10.0 μg·mL-1，相關(guān)系數(shù)在0.999以上。紅2G、酸性橙Ⅱ、堿性橙2、堿性橙21、羅丹明B、對(duì)位紅、堿性橙22和蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的線(xiàn)性方程分別為y=13.08x-0.060、y=5.672x+0.001、y=19.58x+0.123、y=29.84x-0.328、y=42.61x-5.402、y=21.99x+0.345、y=22.23x-1.342、y=42.28x-0.683、y=45.45x-3.065、y=40.78x+3.174、y=20.65x+1.331，通過(guò)配制一系列低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，依據(jù)3倍信噪比計(jì)算其檢出限，檢出限分別為0.25 mg·kg-1、0.35 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1、0.15 mg·kg-1、0.08 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1、0.08 mg·kg-1、0.08 mg·kg-1、0.10 mg·kg-1和0.20 mg·kg-1。信 噪 比為10時(shí)的濃度為定量限。

2.4 加標(biāo)回收率和精密度

取番茄醬的空白樣品進(jìn)行高、中、低（分別為8.0 mg·kg-1、3.2 mg·kg-1、1.6 mg·kg-1）3個(gè) 濃 度 水平的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，且每個(gè)濃度進(jìn)行6次平行測(cè)定，計(jì)算平均回收率和精密度，發(fā)現(xiàn)本方法的回收率在80.6%～97.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.76%～5.89%，準(zhǔn)確性與重現(xiàn)性均符合要求。結(jié)果如表3所示。

表3 加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

（續(xù)表3）

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

在青島市區(qū)內(nèi)超市、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)上采購(gòu)不同品牌的番茄醬50份，應(yīng)用本法進(jìn)行測(cè)定，所測(cè)樣品均未檢出11種工業(yè)染料。

3 結(jié)論

本研究建立了同時(shí)測(cè)定番茄醬中11種工業(yè)染料的高效液相色譜方法。該方法前處理簡(jiǎn)單、回收率高、精密度好、分析成本低，可應(yīng)用于普通實(shí)驗(yàn)室中對(duì)番茄醬中11種工業(yè)染料的日常分析檢測(cè)。