周冉張志斌張曉蕊孫杰張彥浩

(1.山東建筑大學(xué) 市政與環(huán)境工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101；2.山東省環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究設(shè)計(jì)院有限公司，山東 濟(jì)南 250012；3.山東省金膜再生水資源有限公司，山東 濟(jì)南 250100)

0 引言

微生物在湖泊底泥的有機(jī)物轉(zhuǎn)化、物質(zhì)循環(huán)等方面發(fā)揮著重要的作用。微生物群落結(jié)構(gòu)組成是衡量底泥理化性質(zhì)、功能穩(wěn)定性和健康狀況的重要“指示劑”。水分變化是影響底泥微生物種群結(jié)構(gòu)和微生物對(duì)底泥養(yǎng)分利用的重要因素[1-2]。由于真菌類群在抗逆性和恢復(fù)力方面存在差異，頻繁的干濕交替會(huì)引發(fā)真菌種群結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而可能會(huì)影響真菌種群功能變化[3]。劉奎等[4]研究了不同頻率、強(qiáng)度干濕交替和不同耕作方式影響下的東北農(nóng)田黑土微生物的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)干濕交替頻率對(duì)黑土中微生物的影響高于干濕交替強(qiáng)度。包麗君等[5]通過模擬實(shí)驗(yàn)研究了水稻土中古菌種群對(duì)干濕交替的響應(yīng)，表明微生物的重要類群并未因?yàn)榉磸?fù)干濕交替而發(fā)生較大改變，但古菌的生物量和相對(duì)豐度因干濕交替而發(fā)生明顯變化。目前，有關(guān)干濕交替對(duì)微生物群落的影響研究主要集中在土壤方面，而關(guān)于湖泊消落帶底泥干濕交替情況下真菌群落結(jié)構(gòu)的變化研究還鮮有報(bào)道。

南四湖是南水北調(diào)東線最重要的湖泊之一，是東線調(diào)水工程的重要水利樞紐[6]，由于水位波動(dòng)，其下級(jí)湖區(qū)大面積的消落帶底泥經(jīng)歷頻繁的干濕交替。近年來，東線調(diào)水導(dǎo)致南四湖水質(zhì)不時(shí)出現(xiàn)氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽波動(dòng)反彈，這可能與消落帶底泥污染釋放有關(guān)，底泥微生物對(duì)干濕交替過程中的營(yíng)養(yǎng)鹽轉(zhuǎn)化起著重要的作用[7-9]。文章采用高通量測(cè)序技術(shù)[10]分析干濕交替過程中底泥真菌群落的結(jié)構(gòu)變化以及真菌與底泥中理化性質(zhì)的相關(guān)關(guān)系，以期為東線調(diào)水水質(zhì)安全提供科技支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020年8 月在南四湖消落帶區(qū)域(北緯34°27′～35°20′、東經(jīng)116°34′～117°21′)采集0～10 cm表層底泥5 kg，剔除雜草和石塊，風(fēng)干研磨后過4 mm的篩，一部分樣品分析底泥理化性質(zhì)，其余部分用于淹沒-落干交替實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)周期設(shè)置為120 d。實(shí)驗(yàn)期采取淹沒(30 d)-落干(30 d)-淹沒(30 d)-落干(30 d)交替處理。實(shí)驗(yàn)分別在淹沒、落干開始第3天和結(jié)束前第3天取樣，每個(gè)周期收集4組樣品，共收集8組樣品。每次采樣取50 g表層底泥于無菌托盤中平均分成兩份，一份保存于-4℃，用于測(cè)量底泥理化性質(zhì)，另一份底泥立刻存于-80℃環(huán)境下進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3 底泥理化性質(zhì)測(cè)定

底泥樣品pH值和氧化還原電位(Oxidation Reduction Potential，ORP)采用電位法測(cè)定，總磷(Total Phosphorus，TP)采用氫氧化鈉熔融-鉬銻抗比色法測(cè)定，無機(jī)磷(Inorganic Phosphorus，IP)和有機(jī)磷(Organophosphorus，OP)采用標(biāo)準(zhǔn)化沉積物磷形態(tài)分析方法(Standard Measurements and Testing，SMT)進(jìn)行分級(jí)提取，采用干燒法測(cè)定底泥中有機(jī)質(zhì)的量，凱氏蒸餾法測(cè)定底泥中總氮(Total Nitrogen，TN)的量，總有機(jī)碳(Total Organic Carbon，TOC)采用總有機(jī)碳測(cè)定儀測(cè)定。

1.4 底泥真菌多樣性的測(cè)定

8個(gè)樣本中微生物群落總脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid，DNA)的提純根據(jù)E.Z.N.A.?soil DNA kit說明書進(jìn)行，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的提取質(zhì)量，采用NanoDrop2000測(cè)定8個(gè)樣本中目的基因條帶濃度和純度；采用ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA)和ITS2R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)對(duì)內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer，ITS)區(qū)域進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)擴(kuò)增[11]。每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)。PCR擴(kuò)增后得到明亮清晰的基因條帶，以便于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)[12]。樣品純化定量后，利用因美納公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序[13]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用R語言(version 3.3.1)軟件包；使用宏基因組分析軟件UPARSE(version 7.1)對(duì)序列進(jìn)行分類操作單元(Operational Taxonomic Unit，OTU)聚類分析[12]；通過Unite數(shù)據(jù)庫，分析不同底泥樣品的真菌在屬水平上的種群結(jié)構(gòu)組成；微生物群落結(jié)構(gòu)與底泥理化性質(zhì)的相關(guān)性采用冗余分析(Redundancy Analysis，RDA)相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干濕交替過程中底泥真菌多樣性分析

利用OTU數(shù)量分別定量分析底泥兩次干濕交替過程中8個(gè)樣品的真菌量，結(jié)果見表1。在淹沒過程中，底泥真菌OTU數(shù)量逐漸減少；在落干過程中，真菌OTU數(shù)量顯著增加，且落干后期的真菌OTU數(shù)量較淹沒后期多。表明大部分真菌在好氧條件下繁殖能力更強(qiáng)，對(duì)干旱環(huán)境的抵御能力也更強(qiáng)。通過Alpha分析可以得出底泥中淹沒-落干期間真菌群落的豐富度。表1中覆蓋率均＞0.99，說明樣品中檢測(cè)到的真菌類群準(zhǔn)確反映了樣品中真菌豐富度的真實(shí)情況。辛普森指數(shù)在淹沒期間高于落干期間，而香農(nóng)指數(shù)與之相反，表明落干期間的真菌豐富度高于淹沒期間；Sobs指數(shù)和Chao指數(shù)在干濕交替過程中呈降低趨勢(shì)，表明干濕交替使得微生物豐富度逐漸減少。

表1 干濕交替過程中真菌OTU數(shù)量和多樣性指數(shù)表

2.2 干濕交替過程中底泥理化性質(zhì)變化

干濕交替過程中表層底泥理化性質(zhì)變化見表2。干濕交替過程中，底泥pH值淹沒后升高，落干后降低，底泥隨干濕交替的進(jìn)行逐漸酸化。ORP淹沒后降低，落干后升高。底泥中TOC、TP、OP和IP的變化趨勢(shì)一致，均在干濕交替的影響下呈緩慢降低趨勢(shì)，TN的變化不顯著。

表2 干濕交替過程中底泥理化性質(zhì)表

2.3 干濕交替過程中底泥真菌種群變化

底泥樣品中真菌種群結(jié)構(gòu)組成差異如圖1所示。從結(jié)構(gòu)可知，各個(gè)時(shí)間階段的真菌種群既有相似性也有差異性；從數(shù)量可知，經(jīng)過兩次淹沒-落干的影響，樣品中的微生物真菌菌屬數(shù)量呈減少趨勢(shì)。通過高通量測(cè)序，8個(gè)樣品中共收集高質(zhì)量DNA序列566156條，序列長(zhǎng)度主要為200～300，平均長(zhǎng)度為240。S1、S2、D1、D2、S3、S4、D3和D4中特有菌屬 數(shù) 目 分 別 為53(19.49%)、10(3.68%)、15(5.51%)、36(13.24%)、10(3.68%)、8(2.94%)、6(2.21%)和5(1.84%)種，共同包含的真菌菌屬共有15種。淹沒期間，4個(gè)樣品中共有5個(gè)共同菌屬，分別是擔(dān)子菌屬(Basidiomycota)、纖維孢子菌(Fibroporia)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、酵母菌屬(Eleutherascus)和粘束孢屬(Graphium)；落干期間4個(gè)樣品中只有1個(gè)共有菌屬，為節(jié)擔(dān)菌屬(Wellmia)。

圖1 各底泥樣品真菌群落組成差異圖

物種組成分析反映了8個(gè)樣品的群落結(jié)構(gòu)。干濕交替過程中8個(gè)底泥樣品中的真菌分別屬于8個(gè)門、26個(gè)綱、215個(gè)屬，如圖2所示。在屬水平上，8個(gè)樣品之間底泥中的主要類群是翅孢殼屬(Emericellopsis)，占比0.9%～80.0%；支頂孢屬(Acremonium)，占比3%～26.7%。

圖2 各底泥樣品真菌結(jié)構(gòu)圖

2.4 微生物群落結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)的冗余分析

通過冗余分析(通過樣點(diǎn)的散集形態(tài)，在象限的分布等來反映研究區(qū)的特點(diǎn))對(duì)不同樣品的微生物群落和底泥理化性質(zhì)的關(guān)系進(jìn)行分析，如圖3所示。對(duì)于干濕交替過程中不同階段樣品中微生物群落，有機(jī)質(zhì)(Organic Matter，OM)和ORP對(duì)微生物群落的結(jié)構(gòu)影響最大，且兩者呈負(fù)相關(guān)；影響較大的理化性質(zhì)為TP和pH，兩者成正相關(guān)；樣品中底泥理化性質(zhì)中TP、pH、OP與OM、TN呈顯著負(fù)相關(guān)。

圖3 真菌群落屬水平與底泥理化性質(zhì)的RDA分析圖

盡管底泥中真菌的豐度和數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于細(xì)菌，但是真菌的呼吸作用卻明顯高于細(xì)菌，說明真菌的營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)化能力在底泥中占有重要地位[14-15]。通過研究紅樹林消落帶沉積物中微生物在生態(tài)中的貢獻(xiàn)作用，發(fā)現(xiàn)腐生真菌是整個(gè)微生物網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵組成部分，不僅與其他環(huán)境變量產(chǎn)生協(xié)同作用，甚至決定了整體微生物的群落結(jié)構(gòu)組成，無論是在縱向還是橫向的分組中，真菌在環(huán)境變量和微生物種群結(jié)構(gòu)變化都發(fā)揮了核心作用[16-17]。

在實(shí)驗(yàn)中，干濕交替過程中不僅真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，而且真菌菌屬數(shù)量也成逐漸減少趨勢(shì)。這與劉奎等[4]研究的黑土中微生物群落結(jié)構(gòu)變化與干濕交替相關(guān)性分析相似，高頻率的干濕交替減少了土壤中微生物的多樣性。真菌的群落結(jié)構(gòu)分析表明，在不同時(shí)間階段，翅孢殼屬和支頂孢屬均為優(yōu)勢(shì)菌屬且未被命名的菌屬占比逐漸增加。未被命名菌屬占比的增加表明在實(shí)驗(yàn)過程中人為擾動(dòng)較大。實(shí)驗(yàn)初期，翅孢殼屬一直占有較高比例且底泥為堿性土壤，而底泥經(jīng)歷兩次淹沒-落干后，pH值整體降低，翅孢殼屬占比減少，表明底泥pH值與翅孢殼屬之間相互影響[18-19]。這與IWAI等[20]研究的干濕交替情況下天然鹽類土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)和土壤理化性質(zhì)變化的研究結(jié)論相似，干濕交替不僅改變了底泥理化性質(zhì)，同時(shí)底泥中的真菌做出了相應(yīng)的響應(yīng)。

底泥理化性質(zhì)是衡量底泥質(zhì)量的重要指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，干濕交替的影響下表層底泥pH值、含水量、ORP等發(fā)生變化，干濕交替降低了底泥中的氮、磷，這與郭晨輝等[21]研究的表層沉積物中磷釋放對(duì)水質(zhì)產(chǎn)生的影響中，年內(nèi)水量分配不均增大了區(qū)域內(nèi)表層底泥中磷釋放風(fēng)險(xiǎn)的結(jié)論一致。ZHAO等[22]在研究瀾滄江水位波動(dòng)引起的土壤退化結(jié)果顯示，水位波動(dòng)降低了全氮的量。

湖泊底泥中真菌群落結(jié)構(gòu)受不同理化性質(zhì)的影響顯著不同[23]。實(shí)驗(yàn)通過RDA冗余分析發(fā)現(xiàn)，干濕交替過程中真菌群落結(jié)構(gòu)與有機(jī)質(zhì)、氧化還原電位的相關(guān)性最顯著，磷類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和pH值的相關(guān)性次之，而總氮的相關(guān)性最弱。不同環(huán)境理化性質(zhì)都對(duì)微生物產(chǎn)生一定的影響，極大地?cái)U(kuò)展了微生物群落特征和底泥微生物群落豐度的發(fā)展趨勢(shì)，增加了微生物的多樣性[24]。

3 結(jié)論

根據(jù)上述研究，得到以下結(jié)論:

(1)干濕交替改變了底泥的理化性質(zhì)和真菌的種群結(jié)構(gòu)，真菌物種豐富度呈下降趨勢(shì)，淹沒、落干穩(wěn)定期間，真菌微生物數(shù)量呈上升趨勢(shì)，穩(wěn)定的環(huán)境有利于微生物的繁殖和生存，頻繁干濕交替對(duì)環(huán)境有破壞作用。

(2)8個(gè)樣本中微生物群落結(jié)構(gòu)既有相似性，又有差異性，翅孢殼屬、支頂孢屬為樣本中優(yōu)勢(shì)菌屬。干濕交替會(huì)改變底泥真菌的群落結(jié)構(gòu)，干濕交替過程中，翅孢殼屬在真菌群落中占比逐漸降低，而未被命名真菌占比逐漸增加。

(3)干濕交替過程中，底泥中pH值、ORP變化顯著，OM、TP等物質(zhì)呈降低趨勢(shì)，真菌群落結(jié)構(gòu)受OM、ORP和pH的影響最大。