龐莉娜，蘭艷艷，王志福，陳小梅，俞向梅

1 福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建福州 350122；2 福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福建福州 350003；3 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建福州350122

化療所致的周圍神經(jīng)病變（chemotherapy-induced peripheral neuropathy，CIPN）是腫瘤化療后常見的嚴重不良反應(yīng)，可表現(xiàn)為疼痛、麻木等感覺障礙，嚴重影響患者的生活質(zhì)量［1］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，約40%接受神經(jīng)毒性化療藥物治療的癌癥患者會出現(xiàn)CIPN，是導(dǎo)致化療劑量減少或早期停止化療的常見原因。紫杉醇廣泛用于治療各種癌癥（包括乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、胰腺癌和肺癌），是引起CIPN最常見的化療藥物，約60%患者發(fā)生紫杉醇誘導(dǎo)的神經(jīng)性疼痛（paclitaxel-induced neuropathic pain，PINP），主要表現(xiàn)為熱過敏、機械性超敏等［2］。

紫杉醇與促炎劑脂多糖類似，可與巨噬細胞toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）結(jié)合并激活，誘導(dǎo)促炎細胞因子表達［3］。有報道指出，PINP 可激活外周和脊髓背角炎癥因子TNF-α，誘導(dǎo)巨噬細胞活化，表現(xiàn)出經(jīng)典的神經(jīng)炎癥現(xiàn)象［4-5］。α7 煙堿型乙酰膽堿受體（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR）在周圍組織和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大量表達，與乙酰膽堿相互作用，激活膽堿能抗炎通路，抑制TNF-α 釋放，阻斷機體炎癥反應(yīng)［6-7］。研究發(fā)現(xiàn)，激活α7nAChR 可防止脊髓小膠質(zhì)細胞的形態(tài)學(xué)改變等，降低PINP 小鼠機械痛覺超敏，提示α7nAChR介導(dǎo)的抗炎途徑參與PINP 的治療過程［8-9］。因此，激活α7nAChR，減少TNF-α 等炎癥因子的釋放，可能是預(yù)防和治療PINP的關(guān)鍵靶點。

針對PINP，目前已有的防治策略仍不盡如人意。因此尋求中醫(yī)方案進行替代或補充治療，深入分析其背后的現(xiàn)代作用機制，以期未來更好地促進化療神經(jīng)性疼痛患者的感覺功能恢復(fù)，提高患者生活質(zhì)量。近年來基礎(chǔ)與臨床研究均證實，電針足三里治療化療神經(jīng)性疼痛效果顯著，但其背后的現(xiàn)代作用機制仍有待深入研究［10-13］。因此，本研究擬探討電針足三里是否通過調(diào)控脾臟、脊髓背角α7nAChR，降低TNF-α 含量，減輕炎癥反應(yīng)，從而改善PINP小鼠痛敏反應(yīng)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

60只雄性SPF級成年C57BL/6小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供［實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（閩）2019-0007］，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準。于自然晝夜交替和22～25 ℃室溫下飼養(yǎng)，自由進食水。實驗動物的處理均嚴格按照動物倫理準則及指南的相關(guān)條例執(zhí)行。

1.2 主要試劑

紫杉醇（美國MedChemExpress 公司）；α-銀環(huán)蛇毒素（α-bungarotoxin，α-BGT）（英國Abcam公司）；α7nAChR 抗體（英國Abcam 公司）；GAPDH 抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；異氟烷（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（美國Thermo 公司）；TNF-α ELISA 試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）。

1.3 主要儀器

Von Frey 測痛儀（美國North Medical 公司）；PL-200 熱刺痛儀（成都泰盟軟件有限公司）；0.5 寸針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；HANS-200E穴位神經(jīng)刺激儀（南京濟生醫(yī)療科技有限公司）；高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；IQ5 多重實時熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

2 實驗方法

2.1 分組與模型制備

2.1.1 實驗分組 將60 只SPF 級雄性C57BL/6 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，按照隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、電針組、腹腔拮抗劑組、鞘內(nèi)拮抗劑組，每組12只。經(jīng)行為學(xué)檢測全部結(jié)束后，根據(jù)實驗需要選擇對照組、模型組、電針組（每組3 只）檢測脾臟、脊髓α7nAChR 蛋白表達變化；為明確脾臟或脊髓α7nAChR 是否影響炎癥因子TNF-α 釋放，選擇對照組、模型組、電針組、腹腔拮抗劑組、鞘內(nèi)拮抗劑組［每組8 只，其中4 只用于實時熒光定量PCR 法（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測，4 只用于ELISA檢測］，分別檢測脾臟和脊髓TNF-α mRNA水平和蛋白表達。

2.1.2 模型制備 將模型組、電針組、腹腔拮抗劑組和鞘內(nèi)拮抗劑組小鼠采用腹腔注射紫杉醇法［14］制備化療神經(jīng)性疼痛模型，于造模的第1、3、5、7 天按2 mg/kg 的標準對小鼠腹腔注射紫杉醇（溶解于生理鹽水，按10 mL/kg標準注射）。

2.2 實驗動物處理方法

2.2.1 對照組 于造模的第1、3、5、7天對小鼠腹腔注射10 mL/kg的生理鹽水。

2.2.2 模型組 造模后除不予針刺外，其余過程同電針組。

突然暴漲起來的綠通車輛，也給干杉收費站帶來不小的壓力。為了提高綠色通道車輛的查驗速度，湖南省高速公路建設(shè)開發(fā)總公司長沙管理處為干杉收費站配備了1臺90萬元的X射線透視成像綠通檢測儀，增配備至54名工作人員，并聘請高級禮儀師及收費專家對全體收費員進行文明優(yōu)質(zhì)服務(wù)和綠色通道車輛查驗培訓(xùn)。目前，干杉收費站3進5出共8條車道全部打開，每臺綠色通道車輛查驗、通過收費站的時間由原來的20分鐘減少到3至5分鐘。同時投入3萬元，修建了一個152 平方米的綠色通道檢測棚，為等候檢測的綠色通道車輛遮陽遮雨。

2.2.3 電針組 從造模第1天開始給予電針雙側(cè)足三里（定位參考《實驗針灸學(xué)》［15］）。參考團隊前期研究方法［16］，讓小鼠持續(xù)吸入0.5%～1.5%異氟烷，麻醉狀態(tài)下將其固定在加熱墊上，將無菌針灸針刺入足三里，連接HANS-200E 穴位神經(jīng)刺激儀，通電后以小鼠雙下肢輕微抖動為宜。電針參數(shù)：連續(xù)波10 Hz；電流強度0.5 mA，15 min/（次·d），隔日1 次，共干預(yù)7次。

2.2.4 腹腔拮抗劑組 于造模第1、7、13 天腹腔注射α7nAChR 拮抗劑α-BGT（1 μg/kg），其余過程同電針組。

2.2.5 鞘內(nèi)拮抗劑組 于造模第1、7、13 天鞘內(nèi)注射α7nAChR拮抗劑α-BGT（0.5 μg/kg），其余過程同電針組。

2.3 觀察指標及方法

2.3.1 Von Frey測痛儀檢測縮爪閾值 根據(jù)up-anddown 的方法［17］進行測試與計算小鼠造模前，造模第7、14天的縮爪閾值（paw withdrawal threshold，PWT）。每次試驗前將小鼠放置于10 cm×10 cm×20 cm 的有機玻璃籠，待小鼠適應(yīng)環(huán)境30 min 后，在安靜狀態(tài)下，采用0.008～2.0 g 的Von Frey 尼龍纖維毛，垂直刺激動物后肢足掌中心部位。用一定強度的纖毛刺激，纖毛適度彎曲時計時，持續(xù)刺激時間為3～4 s。纖毛刺激時，伴隨著動物產(chǎn)生抬足、挪足、舔足等行為時，則視為陽性反應(yīng)，記錄此時使用的纖維毛折力值并標注“×”，之后選用相鄰的、更小一度折力值的纖維毛繼續(xù)檢測；如果小鼠未出現(xiàn)以上反應(yīng)，記錄此時使用的纖維毛折力值上并標注“0”，視為陰性反應(yīng)，之后選用相鄰的、更大一度折力值的纖維毛繼續(xù)檢測。從第1 次出現(xiàn)“陰性反應(yīng)后緊挨著陽性反應(yīng)”的情況后，至少再繼續(xù)檢測4 個折力值。把陰性與陽性反應(yīng)開始騎跨以及之后的數(shù)值代入50% Von Frey 反應(yīng)閾值公式計算，最終所得數(shù)值即為PWT，以此反映小鼠的機械痛行為學(xué)。

PWT＝［（10［Xf＋Kδ］）/10 000］×50%

其中Xf 為測量的最后1 個Von Frey 細絲的值，K為陽性反應(yīng)或陰性反應(yīng)的模式，δ為刺激過程出現(xiàn)的陰性和陽性的行為學(xué)變化。

2.3.2 熱刺痛儀檢測熱痛縮爪潛伏期 測試小鼠造模前，造模第7、14 天的熱痛縮爪潛伏期（paw withdrawal latency，PWL）。將小鼠放置于懸空的有機玻璃籠中適應(yīng)環(huán)境30 min 后，安靜狀態(tài)下，用熱刺痛儀的輻射光源照射小鼠后足中心區(qū)域皮膚（注意避開后足趾墊）。當(dāng)小鼠出現(xiàn)快速撤回、舔舐、抖動被刺激足時，儀器刺激光源自動切斷，并顯示PWL。測試過程中，注意保持玻璃籠底部小鼠環(huán)境干燥，避免影響實驗結(jié)果。測痛儀的刺激強度設(shè)置為30%，并在整個測試過程中保持參數(shù)一致；刺痛儀的輻射光源自動切斷時間設(shè)置為30 s，以避免造成測試過程中小鼠足部組織損傷。每個部位重復(fù)測量5 次，2 次刺激間隔時間5 min，記錄并計算5 次PWL 的平均值，作為小鼠后足的熱痛閾值。

2.3.4 RT-qPCR法檢測脾臟、脊髓背角TNF-α mRNA的水平 造模第14 天，無菌低溫新鮮取材，提取脾臟、脊髓背角總RNA；去除基因組DNA反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄PCR；RT-qPCR 檢測TNF-α mRNA 水平。引物序列如表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2.3.5 ELISA 法檢測脾臟、脊髓背角TNF-α 的蛋白表達 造模第14 天，取各組脾臟、脊髓背角組織勻漿14 000 r/min 離心5 min，取上清液-80 ℃保存。在ELISA試劑盒中分別按順序加入標準品和各組樣品100 μL，將反應(yīng)板輕晃混勻后置37 ℃40 min；用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌6次，濾紙拍干；除空白孔外每孔加入100 μL 稀釋的檢測抗體，封膜，37 ℃孵育20 min；用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌6 次，濾紙拍干；每孔加100 μL顯色底物，避光，37 ℃孵育10 min；每孔加入100 μL 終止液，30 min 內(nèi)在450 μm 波長檢測各孔吸光值，繪制標準曲線，計算樣品的蛋白表達量。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.00軟件進行統(tǒng)計分析。結(jié)果均服從正態(tài)分布，數(shù)據(jù)用（xˉ±s）表示。重復(fù)測量資料采用重復(fù)測量方差分析；多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊，采用LSD-t法進行各組間兩兩比較，若方差不齊，則采用Games-Howell 法進行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 5組不同時間點行為學(xué)檢測比較

采用Von Frey測痛儀和熱刺痛儀分別檢測造模前，造模第7、14天PWT和PWL行為學(xué)。5組小鼠造模前PWT 和PWL 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；模型組造模第7、14 天PWT 和PWL 較同時段對照組小鼠顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；電針組造模第7、14 天PWT 和PWL 較同時段模型組小鼠明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；腹腔拮抗劑組、鞘內(nèi)拮抗劑組小鼠造模第7、14 天PWT 和PWL 較同時段電針組小鼠顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 5組不同時間點行為學(xué)檢測比較Figure 1 Comparison of behavioral at different time points in five groups

3.2 3組脾臟α7nAChR蛋白表達比較

采用Western blot 法檢測脾臟α7nAChR 蛋白表達。與對照組比較，模型組小鼠脾臟α7nAChR 蛋白表達顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，電針組小鼠脾臟α7nAChR 蛋白表達明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 3組脾臟α7nAChR蛋白表達比較Figure 2 Comparison of α7nAChR protein expression in the spleen of three groups

3.3 4組脾臟TNF-α mRNA水平比較

采用RT-qPCR 法檢測脾臟TNF-α 轉(zhuǎn)錄水平。與對照組比較，模型組小鼠脾臟TNF-α mRNA 水平顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，電針組小鼠脾臟TNF-α mRNA水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與電針組比較，腹腔拮劑組小鼠脾臟TNF-α mRNA 水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 4組脾臟TNF-α mRNA水平比較Figure 3 Comparison of TNF-α mRNA in the spleen of four groups

3.4 4組脾臟TNF-α蛋白表達比較

采用ELISA 法檢測脾臟TNF-α 蛋白表達。與對照組比較，模型組小鼠脾臟TNF-α 蛋白表達顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，電針組小鼠脾臟TNF-α 蛋白表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與電針組比較，腹腔拮抗劑組小鼠脾臟TNF-α 蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 4組脾臟TNF-α蛋白表達比較Figure 4 Comparison of TNF-α protein expression in the spleen of four groups

3.5 3組脊髓背角α7nAChR蛋白表達比較

采用Western blot 法檢測脊髓背角α7nAChR蛋白表達。與對照組比較，模型組小鼠脊髓背角α7nAChR 蛋白表達顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，電針組小鼠脊髓背角α7nAChR 蛋白表達明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5。

圖5 3組脊髓背角α7nAChR蛋白表達比較Figure 5 Comparison of α7nAChR protein expression in dorsal spinal cord of three groups

3.6 4組脊髓背角TNF-α mRNA水平比較

采用RT-qPCR 法檢測脊髓背角TNF-α 轉(zhuǎn)錄水平。與對照組比較，模型組小鼠脊髓背角TNF-α mRNA水平顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，電針組小鼠脊髓背角TNF-α mRNA水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與電針組比較，鞘內(nèi)拮抗劑組小鼠脊髓背角TNF-α mRNA水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖6。

圖6 4組脊髓背角TNF-α mRNA水平比較Figure 6 Comparison of TNF-α mRNA in dorsal spinal cord of four groups

3.7 4組脊髓背角TNF-α蛋白表達比較

采用ELISA 法檢測脊髓背角TNF-α 蛋白表達。與對照組比較，模型組小鼠脊髓背角TNF-α 蛋白表達顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，電針組小鼠脊髓背角TNF-α 蛋白表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與電針組比較，鞘內(nèi)拮抗劑組小鼠脊髓背角TNF-α 蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖7。

圖7 4組脊髓背角TNF-α蛋白表達比較Figure 7 Comparison of TNF-α protein expression in dorsal spinal cord of four groups

4 討論

PINP 歸屬于中醫(yī)“痛痹證”范疇?！端貑枴け哉摗氛J為，風(fēng)、寒、濕邪氣雜糅而成痹證，當(dāng)人體虛弱、正氣不足時，外邪易侵襲機體，經(jīng)脈痹阻而產(chǎn)生疼痛?；熕幬镒仙即紝佟巴庑啊?，極易耗傷人體一身正氣，使氣虛血弱，經(jīng)脈痹阻，肌膚失溫，從而產(chǎn)生麻木、疼痛等癥狀。足三里穴為陽明經(jīng)多血多氣之經(jīng)穴，為扶正祛邪之要穴，可通過脾臟功能發(fā)揮機體免疫調(diào)節(jié)和抗炎鎮(zhèn)痛作用［18-19］，因此本實驗選用足三里穴進行研究。

同先前的研究一致，隔日腹腔注射紫杉醇（2 mg/kg）4次的小鼠出現(xiàn)明顯的機械異常性疼痛和熱痛［20-21］。低強度電刺激足三里穴，可顯著改善PINP 小鼠的機械痛和熱痛覺過敏。目前基礎(chǔ)研究主要從外周、脊髓水平方面探討針刺減輕PINP的作用機制，包括各種炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）、受體蛋白（TLR4、5-HT1AR）、不同類型的酶和分子（MyD88、NF-κB）等［12］。然而，電針干預(yù)PINP 背后的分子機制尚未完全闡明。由于化療引起的疼痛通常會更加復(fù)雜化，因此電針的鎮(zhèn)痛作用可能涉及其他潛在的機制。本研究通過腹腔和鞘內(nèi)分別注射α7nAChR 拮抗劑α-BGT，初步驗證脾臟、脊髓背角α7nAChR在電針足三里改善PINP中的重要作用。

α7nAChR 作為新型鎮(zhèn)痛劑的潛在靶點，在治療各種慢性疼痛方面療效甚佳，α7nAChR 表達于小膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元、巨噬細胞等表面，值得關(guān)注的是，巨噬細胞及小膠質(zhì)細胞等表面的α7nAChR 可以與乙酰膽堿相互作用，參與膽堿能抗炎通路，調(diào)節(jié)細胞的活化狀態(tài)、炎性細胞因子的釋放等，從而有效調(diào)控疼痛［22］。傳統(tǒng)的α7nAChR 激動劑和變構(gòu)調(diào)節(jié)劑可以打開離子通道以發(fā)揮其鎮(zhèn)痛作用，目前已有研究應(yīng)用α7nAChR 激動劑等相關(guān)工具藥治療PINP［8-9］，關(guān)于α7nAChR 在針刺鎮(zhèn)痛中的作用還知之甚少。WANG 等［23］研究發(fā)現(xiàn)，電針足三里可上調(diào)神經(jīng)性疼痛大鼠脊髓、背根神經(jīng)節(jié)α7nAChR 表達，抑制JAK2/STAT3信號通路，重新平衡細胞因子微環(huán)境，緩解大鼠機械超敏反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，電針足三里可以顯著提高脾臟和脊髓背角α7nAChR蛋白含量，鞘內(nèi)或腹腔注射α7 受體拮抗劑α-BGT后可阻斷電針的鎮(zhèn)痛效果。

外周組織、脊髓背角中樞的炎癥反應(yīng)在誘導(dǎo)神經(jīng)性疼痛進展中扮演重要角色，炎性細胞因子TNF-α 與化療神經(jīng)痛的發(fā)生有關(guān)［4，24］。在神經(jīng)性疼痛發(fā)生過程中，脊髓膠質(zhì)細胞激活后會增加TNF-α釋放，促進神經(jīng)元興奮敏化，釋放出致痛物質(zhì)從而誘發(fā)疼痛［25］。研究證實，激活α7nAChR信號傳導(dǎo)通路可減少TNF-α 的產(chǎn)生，并逆轉(zhuǎn)大鼠的機械性痛覺過敏［26］。迷走神經(jīng)電刺激可通過抑制脾臟TNF-α合成，降低系統(tǒng)炎癥，這一膽堿能抗炎途徑依賴于α7nAChR［27］。前期研究表明，低強度0.5 mA 電針足三里可模擬迷走神經(jīng)刺激，發(fā)揮膽堿能抗炎作用［16］。因此，本研究同樣采用低強度0.5 mA 電針刺激足三里，研究結(jié)果表明，電針可能通過促進脾臟、脊髓背角α7nAChR 表達，降低TNF-α 炎癥因子釋放，緩解PINP痛敏反應(yīng)。

綜上所述，電針足三里可能通過上調(diào)脾臟、脊髓背角α7nAChR 表達，降低促炎因子TNF-α 釋放，從而改善PINP 小鼠機械痛和熱痛覺過敏。本研究豐富了針刺鎮(zhèn)痛的理論基礎(chǔ)，為針灸治療PINP提供重要的理論依據(jù)。今后，將通過α7nAChR 基因條件性敲除、病毒感染等實驗技術(shù)，進一步深入探討脾臟、脊髓背角α7nAChR 及其誘導(dǎo)下游信號通路變化在電針治療PINP中的作用。