李守江，孔祥佳，劉智禹，趙 峰，蘇永昌，陳曉婷

1 福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州 350122；2 福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門 361013；3 福建省水產(chǎn)研究所，福建廈門361013

人體在長(zhǎng)時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)中會(huì)表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)耐力下降、效率低下，主觀上伴有倦怠感，疲勞就是機(jī)體主動(dòng)呈現(xiàn)的一種生理性保護(hù)反應(yīng)。如果不能消除疲勞，就有可能發(fā)展成過(guò)勞，勞力耗中氣、勞神傷氣血，最終導(dǎo)致機(jī)體不可逆損傷，從而制約多個(gè)行業(yè)的安全與發(fā)展。引起疲勞的原因很多，其中能量耗竭是主要原因之一［1］。力竭性運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致線粒體膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞，能量生成減少，因而產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)性疲勞［2］。如何有效克服運(yùn)動(dòng)性疲勞一直是醫(yī)學(xué)以及運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。目前，緩解運(yùn)動(dòng)性疲勞的方法有物理手段和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充等。其中，物理手段可采用按摩、針灸、負(fù)壓等方法恢復(fù)體力，緩解疲勞［3-5］；營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充包括服用營(yíng)養(yǎng)素、藥物等消除運(yùn)動(dòng)性疲勞［6-8］。這2 種緩解運(yùn)動(dòng)性疲勞的方法相比，物理方法需配備專用設(shè)備或?qū)I(yè)理療人員，在應(yīng)用及推廣中受到一定限制；而營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充在使用過(guò)程中更為便捷、高效。因此，開(kāi)發(fā)安全、無(wú)激素殘留、無(wú)副作用，起到抗疲勞作用的營(yíng)養(yǎng)素具有重要的研究意義。

研究表明，多糖類、酵素、多酚類、生物堿類、皂苷類、活性肽等物質(zhì)對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞具有影響，既可緩解疲勞，又能減少毒副作用［6，9-13］。其中，活性肽多來(lái)源于海洋生物［14］，具有較高的生物活性和較強(qiáng)的靶向?qū)Ｒ恍浴ｖ烎~(yú)Katsuwonus pelamis屬于低脂高蛋白海產(chǎn)品，產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富［15-16］，可作為制備天然活性肽的優(yōu)質(zhì)試材。目前有關(guān)鰹魚(yú)活性肽的制備工藝及其對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞的影響未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以鰹魚(yú)為試材，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，研究酶解法制備活性肽的工藝，并探討鰹魚(yú)活性肽對(duì)小鼠抗疲勞的影響，旨在為開(kāi)發(fā)利用鰹魚(yú)資源、開(kāi)展多肽生物活性的綜合利用提供參考依據(jù)和理論指導(dǎo)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

鰹魚(yú)，由福建省水產(chǎn)研究所提供。

木瓜蛋白酶（X1＝800 000 U/g）、中性蛋白酶（X2＝50 000 U/g）、風(fēng)味蛋白酶（X3＝20 000 U/g）、堿性蛋白酶（X4＝50 000 U/g）、酸性蛋白酶（X5＝50 000 U/g）（南寧龐博生物工程有限公司）；濃鹽酸、濃硫酸、氫氧化鈉、三氯乙酸、硼酸、溴甲酚綠、甲基紅、乙酸鈉、乙酸、甲醇、乙酰丙酮、硫酸銨、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、中性紅生物染色劑（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；FOSS催化劑片（硫酸銅＋硫酸鉀）（福斯分析儀器公司）；0.9%生理鹽水（辰欣藥業(yè)股份有限公司）；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配合飼料（北京華阜康生物科技股份有限公司）；20×PBS 稀釋液（北京索萊寶科技有限公司）；三磷酸腺苷二鈉（上海澄紹生物科技有限公司）；血清乳酸試劑盒（LD）測(cè)定試劑盒、血清乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)定試劑盒、血清尿素氮（BUN）測(cè)定試劑盒、丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒（武漢默沙克生物科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性KM 鼠，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)于吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)碼：SCXK（京）2014-0004。

1.3 儀器與設(shè)備

Kjeltec8400 全自動(dòng)定氮儀（福斯分析儀器公司）；HYP-1008 型八孔消化爐（上海纖檢儀器有限公司）；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海博遠(yuǎn)電器有限公司）；BSA224S 電子分析天平（德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；UV-3200 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；FE28-Standard 型pH 計(jì)（Mettler Toledo）；IKA C-MAG HS7數(shù)顯磁力攪拌器（艾卡儀器設(shè)備有限公司）；5810R Centrifuge 離心機(jī)（艾本德中國(guó)有限公司）；SCC21B型真空冷凍干燥機(jī)（新芝生物科技有限公司）；Direct-Q3UV 型純水系統(tǒng)（Millipore）；Biomedical 超低溫冰箱（海爾）；Infinite 200 PRO型酶標(biāo)儀（Tecan）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 鰹魚(yú)活性肽制備流程

鰹魚(yú)洗凈→去內(nèi)臟、魚(yú)頭、魚(yú)尾→取肉→高速組織勻漿機(jī)絞碎、拌勻→加水→酶解→滅酶→離心→取上清液→冷凍干燥→鰹魚(yú)酶解產(chǎn)物（鰹魚(yú)活性肽）。

2.2 蛋白酶的篩選

選用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶等5 種蛋白酶酶解鰹魚(yú)。每克魚(yú)糜分別加入2 000 U的不同蛋白酶，以鰹魚(yú)活性肽得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探討最適用于酶解鰹魚(yú)活性肽的酶類。各酶的酶解條件及添加量見(jiàn)表1。

表1 5種蛋白酶酶解參數(shù)Table 1 Hydrolysis parameters of five protease

酶解結(jié)束后于95～100 ℃加熱10 min 鈍化滅酶，10 000 r/min低溫（4 ℃）離心20 min，取上清液測(cè)定并計(jì)算鰹魚(yú)活性肽得率。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

在鰹魚(yú)魚(yú)糜與超純水混合攪拌試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)料液比1∶1 是鰹魚(yú)魚(yú)糜與超純水有效混合的最大比值。因此，在篩選出的風(fēng)味蛋白酶基礎(chǔ)上，考察料液比（鰹魚(yú)魚(yú)糜分別按照料液比為1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3 g/mL 的比例加入超純水）、加酶量（每克魚(yú)糜中分別加入1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U的蛋白酶，分別對(duì)應(yīng)酶添加量為2.5、5、7.5、10、12.5 g）、酶解時(shí)間（3、4、5、6、7 h）、酶解溫度（30、40、50、60、70 ℃）對(duì)鰹魚(yú)活性肽得率的影響，并確定各酶解條件的最適范圍。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)及分析結(jié)果，在固定料液比為1∶1 的基礎(chǔ)上，以加酶量、酶解時(shí)間和酶解溫度為關(guān)鍵工藝參數(shù)，通過(guò)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用Design Expert 8.0.6 分析軟件進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)，試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 2 Design factors and levels of response surface test

2.5 鰹魚(yú)活性肽得率計(jì)算

參考祝婧［17］的方法計(jì)算。其中，酸溶蛋白質(zhì)水解物含量采用GB/T 22729—2008［18］的方法測(cè)定，氨基酸態(tài)氮含量采用GB5009.235—2016［19］的方法測(cè)定，鰹魚(yú)蛋白含量采用GB5009.5—2016［20］的方法測(cè)定。

活性肽得率＝（酸溶蛋白質(zhì)水解物含量－氨基酸態(tài)氮含量）/鰹魚(yú)蛋白含量×100%

2.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.6.1 分組及模型制備 將90只KM小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，按體質(zhì)量隨機(jī)分成6 組，每組15 只，分別為安靜空白組、運(yùn)動(dòng)模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、鰹魚(yú)活性肽低劑量組（200 mg/kg，簡(jiǎn)稱低劑量組）、鰹魚(yú)活性肽中劑量組（400 mg/kg，簡(jiǎn)稱中劑量組）、鰹魚(yú)活性肽高劑量組（800 mg/kg，簡(jiǎn)稱高劑量組），連續(xù)4 周按表3所示對(duì)各組小鼠進(jìn)行給藥處理。

表3 動(dòng)物分組和處理Table 3 Animal grouping and administration

除安靜空白組外，其余各組構(gòu)建遞增負(fù)荷式游泳訓(xùn)練誘導(dǎo)的小鼠疲勞模型，以訓(xùn)練時(shí)間為變量進(jìn)行訓(xùn)練。即第1 周采用10 min 遞增至50 min 訓(xùn)練（按每2 d遞增20 min進(jìn)行游泳運(yùn)動(dòng)，下同）6 d，休息1 d；第2 周采用50 min 遞增至90 min 訓(xùn)練6 d，休息1 d；第3周采用90 min遞增至130 min訓(xùn)練6 d，休息1 d；第4 周訓(xùn)練2 次，首先采用負(fù)重6%訓(xùn)練直至小鼠力竭，休息1 d，然后再采用負(fù)重6%訓(xùn)練直至小鼠再次力竭達(dá)到疲勞；以小鼠游泳過(guò)程中頭部下沉5 s內(nèi)未浮出水面作為判斷小鼠力竭標(biāo)準(zhǔn)，并記錄該時(shí)間作為小鼠游泳力竭時(shí)間。負(fù)重力竭游泳結(jié)束后，采用摘眼球取血的方式獲得血液樣本，將血液靜置0.5 h，3 000 r/min 低溫（4 ℃）離心10 min，取上清液即為血清待測(cè)液；同時(shí)，在冰臺(tái)上取肝臟，經(jīng)液氮速凍，轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6.2 血清BUN 和LD 含量測(cè)定 按照試劑盒規(guī)定方法測(cè)定BUN和LD含量。

2.6.3 血清LDH 活性測(cè)定 按照試劑盒規(guī)定方法測(cè)定LDH活性。

2.6.4 肝臟MDA 含量和SOD 活性測(cè)定 稱取0.2 g肝臟，加入1.8 mL 4 ℃預(yù)冷PBS（pH 7.4），研磨制成10%肝臟勻漿，于4 ℃3 000 r/min 條件下離心20 min，取上清液，即為肝臟勻漿待測(cè)液。按照試劑盒規(guī)定方法測(cè)定MDA含量和SOD活性。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。定量資料服從正態(tài)分布以（）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行各組樣本平均數(shù)的比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 蛋白酶的篩選

選取木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶5種蛋白酶，在各種酶的最適宜條件下對(duì)鰹魚(yú)魚(yú)糜進(jìn)行酶解。風(fēng)味蛋白酶酶解鰹魚(yú)魚(yú)糜的效果最佳，活性肽得率最高，為17.000%；中性蛋白酶酶解鰹魚(yú)魚(yú)糜的效果次之，活性肽得率為15.155%；而木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶酶解鰹魚(yú)魚(yú)糜的效果略差。統(tǒng)計(jì)分析表明，風(fēng)味蛋白酶酶解鰹魚(yú)活性肽得率顯著高于中性蛋白酶（P＜0.05），極顯著高于木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶（P＜0.01）。因此，選用風(fēng)味蛋白酶作為最佳蛋白酶，用以制備鰹魚(yú)活性肽。見(jiàn)圖1。

圖1 5種蛋白酶對(duì)鰹魚(yú)活性肽得率的影響Figure 1 Effects of five proteinases on the yield of bioactive peptide in Katsuwonus pelamis

3.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 料液比對(duì)鰹魚(yú)活性肽得率的影響 隨著料液比的減少，鰹魚(yú)活性肽得率降低，即料液比為1∶1時(shí)，活性肽得率達(dá)到最大。這說(shuō)明料液比達(dá)到一定水平時(shí)，底物和酶已達(dá)到完全飽和的狀態(tài)，隨著料液比的繼續(xù)降低，鰹魚(yú)活性肽的得率反而下降，影響酶解效果。統(tǒng)計(jì)分析表明，料液比為1∶1 時(shí)的鰹魚(yú)活性肽得率顯著高于料液比為1∶1.5～1∶3 時(shí)的活性肽得率（P＜0.05）。因此，為了顯著提高鰹魚(yú)活性肽得率，優(yōu)化試驗(yàn)時(shí)固定料液比為1∶1。見(jiàn)圖2。

圖2 料液比對(duì)鰹魚(yú)活性肽得率的影響Figure 2 Effect of solid-to-liquid ratio on the yield of bioactive peptide in Katsuwonus pelamis

3.2.2 加酶量對(duì)鰹魚(yú)活性肽得率的影響 酶反應(yīng)底物的水解程度取決于酶的加入量。隨著酶用量的增加，鰹魚(yú)活性肽得率呈逐漸上升后逐漸下降的變化趨勢(shì)。當(dāng)加酶量為1 000～2 000 U/g 時(shí)，活性肽得率隨著酶用量的增大而快速上升；當(dāng)加酶量為2 000～4 000 U/g時(shí)，活性肽得率隨著酶用量的增大而呈緩慢上升趨勢(shì)，當(dāng)加酶量達(dá)到4 000 U/g時(shí)，水解充分，活性肽得率達(dá)到最高值；當(dāng)加酶量為4 000～5 000 U/g 時(shí)，活性肽得率隨著酶用量的增大而呈緩慢下降趨勢(shì)。這表明底物濃度相對(duì)于酶添加量達(dá)到飽和后，活性肽得率將不會(huì)隨著加酶量的增加而增大，反而會(huì)抑制酶活性，使得活性肽得率下降。統(tǒng)計(jì)分析表明，加酶量為4 000 U/g 時(shí)的鰹魚(yú)活性肽得率顯著高于1 000～3 000 U/g（P＜0.05），但與5 000 U/g差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，為了顯著提高鰹魚(yú)活性肽得率，選取加酶量的變量范圍為（4 000±400）U/g，即對(duì)應(yīng)風(fēng)味蛋白酶添加量的變化范圍為（10±1）g作進(jìn)一步的優(yōu)化試驗(yàn)。見(jiàn)圖3。

圖3 加酶量對(duì)鰹魚(yú)活性肽得率的影響Figure3 Effect of enzyme addition on the yield of bioactive peptide in Katsuwonus pelamis

3.2.3 酶解時(shí)間對(duì)鰹魚(yú)活性肽得率的影響 在一定酶解時(shí)間內(nèi)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，活性肽得率趨于平緩，但隨著酶解時(shí)間繼續(xù)增加，活性肽得率呈先快速上升后快速下降的變化趨勢(shì)。其中，酶解3～5 h 時(shí)，活性肽得率趨于平緩；酶解5～6 h 時(shí)，活性肽得率快速上升，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到6 h 時(shí)，此時(shí)活性肽得率的值最高；酶解6～7 h 時(shí)，活性肽得率又快速下降。這表明適宜的酶解時(shí)間能夠促進(jìn)風(fēng)味蛋白酶與底物的結(jié)合，底物中能夠被酶解的物質(zhì)是有限的，當(dāng)?shù)孜镏械目杀幻附馕镔|(zhì)充分酶解后，繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，反而會(huì)導(dǎo)致酶活性降低，可能還會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物，從而影響鰹魚(yú)活性肽得率和品質(zhì)。因此，選取酶解時(shí)間的變量范圍為（6±0.5）h作進(jìn)一步的優(yōu)化試驗(yàn)。見(jiàn)圖4。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)鰹魚(yú)活性肽得率的影響Figure 4 Effect of enzymatic time on the yield of bioactive peptide in Katsuwonus pelamis

3.2.4 酶解溫度對(duì)鰹魚(yú)活性肽得率的影響 鰹魚(yú)活性肽得率受酶解溫度的影響，隨著酶解溫度的升高，活性肽得率呈先上升后下降的變化趨勢(shì)。當(dāng)酶解溫度為30～40 ℃時(shí)，活性肽得率隨著酶解溫度的升高而逐漸增加，當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，活性肽得率達(dá)到最大值；當(dāng)酶解溫度為40～50 ℃時(shí)，活性肽得率隨著酶解溫度的升高而快速降低；當(dāng)酶解溫度為50～70 ℃時(shí)，活性肽得率變化平緩。這表明酶解溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)對(duì)酶的活性中心產(chǎn)生影響，抑制酶活性、降低酶解效果，從而影響鰹魚(yú)活性肽得率。統(tǒng)計(jì)分析表明，酶解溫度為40 ℃時(shí)的鰹魚(yú)活性肽得率顯著高于50～70 ℃（P＜0.05），但與30 ℃差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，為了顯著提高鰹魚(yú)活性肽得率，選取酶解溫度的變量范圍為（40±5）℃作進(jìn)一步的優(yōu)化試驗(yàn)。見(jiàn)圖5。

圖5 酶解溫度對(duì)鰹魚(yú)活性肽得率的影響Figure 5 Effect of enzymatic temperature on the yield of bioactive peptide in Katsuwonus pelamis

3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)及分析結(jié)果，在固定料液比為1∶1的基礎(chǔ)上，以加酶量、酶解時(shí)間和酶解溫度為關(guān)鍵工藝參數(shù)，通過(guò)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用Design Expert 8.0.6 分析軟件進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及數(shù)據(jù)處理結(jié)果如表4所示。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 4 Experimental design with response variable for response surface analysis

3.3.2 模型建立及顯著性分析 根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，對(duì)上述17組試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，獲得項(xiàng)目指標(biāo)（R1活性肽得率）對(duì)影響因子（A加酶量、B酶解時(shí)間和C酶解溫度）的關(guān)系為：

為檢驗(yàn)該二次多元回歸方程的有效性，進(jìn)一步對(duì)響應(yīng)面法優(yōu)化鰹魚(yú)活性肽得率的顯著性和多元回歸模型的方差進(jìn)行分析可知，其分析結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 響應(yīng)面法優(yōu)化鰹魚(yú)活性肽得率的方差分析Table 5 Variance analysis of polypeptides yield in Katsuwonus pelamis by response surface methodology

由表5 可知，回歸方程一次項(xiàng)A、C 對(duì)活性肽得率的影響極顯著（P＜0.01），B 對(duì)活性肽得率的影響不顯著（P＞0.05）。從交叉項(xiàng)對(duì)活性肽得率的影響來(lái)看，AB 對(duì)活性肽得率的影響顯著（P＜0.05），AC對(duì)活性肽得率的影響極顯著（P＜0.01），而B(niǎo)C 對(duì)活性肽得率的影響不顯著（P＞0.05）。

二次多元回歸方程模型P值為0.000 4＜0.01，表明該模型高度顯著，該實(shí)驗(yàn)方法是可靠的；而模型的失擬性P值為0.108 3＞0.05 為不顯著，進(jìn)一步說(shuō)明模型與實(shí)際情況擬合情況良好，可以使用該模型對(duì)實(shí)際試驗(yàn)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。決定系數(shù)R2反應(yīng)了回歸方程對(duì)數(shù)據(jù)的擬合程度，其數(shù)值在0～1 之間，R2越接近于1 表明擬合程度越好。該實(shí)驗(yàn)響應(yīng)值R1的決定系數(shù)R2＝0.961 0，說(shuō)明響應(yīng)值與回歸方程的擬合程度很好，表明鰹魚(yú)活性肽得率試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值具有較高的一致性；模型的校正決定系數(shù)R2Adj＝0.910 9，表明該模型能解釋91.09%響應(yīng)值變化，僅有8.91%不能用該模型來(lái)解釋。因此，該模型能夠較好地優(yōu)化鰹魚(yú)活性肽的酶解工藝。

3.3.3 交互作用分析 響應(yīng)曲面圖可反映各因素及其交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。若響應(yīng)面圖的曲面坡度平緩，表明兩影響因子交互作用??；若陡峭，則表示交互作用大。

由圖6a～6c 可知，加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度3個(gè)因素之間的交互作用對(duì)鰹魚(yú)活性肽得率的影響不同。由圖6a 可知，響應(yīng)曲面圖坡度稍陡，說(shuō)明加酶量和酶解時(shí)間的交互作用相對(duì)顯著；由圖6b可知，響應(yīng)曲面圖坡度較陡，說(shuō)明加酶量和酶解溫度的交互關(guān)系較為顯著；由圖6c 可知，響應(yīng)曲面圖坡度較為平緩，說(shuō)明酶解時(shí)間和酶解溫度的交互關(guān)系不顯著。從響應(yīng)曲面圖中直觀得出的結(jié)果與方差分析的結(jié)果一致。

圖6 酶解條件對(duì)鰹魚(yú)活性肽得率交互影響的曲面圖Figure 6 Surface diagram of the interaction of enzymatic hydrolysis conditions on the yield of bioactive peptide in Katsuwonus pelamis

3.3.4 參數(shù)優(yōu)化及模型驗(yàn)證 通過(guò)Design Expert 8.0.6分析軟件得出酶解法制備鰹魚(yú)活性肽的最佳工藝參數(shù)，即加酶量4 400 U/g，酶解時(shí)間為6.5 h，酶解溫度42.08 ℃；在該條件下鰹魚(yú)活性肽得率為33.647 9%。考慮到實(shí)際操作的可行性，調(diào)整最佳工藝參數(shù)為加酶量4 400 U/g，酶解時(shí)間為6.5 h，酶解溫度42 ℃；按照該工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到鰹魚(yú)活性肽得率為33.166%，與預(yù)測(cè)值僅相差0.481 8%，說(shuō)明通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化得到的回歸模型方程及最佳條件可靠。

3.4 鰹魚(yú)活性肽對(duì)小鼠抗疲勞的影響

3.4.1 鰹魚(yú)活性肽對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響 與運(yùn)動(dòng)模型組相比，給藥組均能不同程度地延長(zhǎng)小鼠力竭游泳時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；且與陽(yáng)性對(duì)照組相比，鰹魚(yú)活性肽中、高劑量可極顯著增加小鼠負(fù)重力竭游泳時(shí)間（P＜0.01）。這說(shuō)明鰹魚(yú)活性肽對(duì)減輕力竭游泳小鼠的疲勞具有一定的作用。見(jiàn)表6。

表6 鰹魚(yú)活性肽對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響（）Table 6 Effect of bioactive peptide in Katsuwonus pelamis on exhausted swimming time of mice（）

表6 鰹魚(yú)活性肽對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響（）Table 6 Effect of bioactive peptide in Katsuwonus pelamis on exhausted swimming time of mice（）

注：與運(yùn)動(dòng)模型組比較，1）P＜0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，2）P＜0.01。Note:Compared with the exercise model group,1)P＜0.01;compared with the positive control group,2)P＜0.01.

3.4.2 鰹魚(yú)活性肽對(duì)小鼠血清BUN含量的影響 運(yùn)動(dòng)模型組小鼠的BUN 含量高于安靜空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。當(dāng)小鼠力竭游泳運(yùn)動(dòng)后，給藥組BUN 含量均極顯著低于運(yùn)動(dòng)模型組（P＜0.01）；進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性對(duì)照組BUN 含量極顯著高于鰹魚(yú)活性肽低、高劑量組（P＜0.01），顯著高于中劑量組（P＜0.05）。這說(shuō)明隨著小鼠運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的增加，運(yùn)動(dòng)模型組小鼠血清中的BUN 含量快速增加，從而導(dǎo)致小鼠疲勞現(xiàn)象的出現(xiàn)；而給藥組可有效降低小鼠血清BUN 含量，從而提高小鼠運(yùn)動(dòng)負(fù)荷能力，延緩小鼠疲勞產(chǎn)生。見(jiàn)表7。

表7 鰹魚(yú)活性肽對(duì)小鼠血清BUN含量的影響（）Table 7 Effect of bioactive peptide in Katsuwonus pelamis on serum BUN content of mice（）

表7 鰹魚(yú)活性肽對(duì)小鼠血清BUN含量的影響（）Table 7 Effect of bioactive peptide in Katsuwonus pelamis on serum BUN content of mice（）

注：與安靜空白組比較，1）P＜0.01；與運(yùn)動(dòng)模型組比較，2）P＜0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，3）P＜0.01，4）P＜0.05。Note:Compared with the quiet blank group,1) P＜0.01;compared with the exercise model group,2)P＜0.01;compared with the positive control group,3)P＜0.01,4)P＜0.05.

3.4.3 鰹魚(yú)活性肽對(duì)小鼠血清LD 含量的影響 力竭游泳運(yùn)動(dòng)后的小鼠LD 含量增加，且運(yùn)動(dòng)模型組小鼠的LD 含量極顯著高于安靜空白組（P＜0.01）。與運(yùn)動(dòng)模型組相比，給藥組LD 含量均降低，且陽(yáng)性對(duì)照組以及鰹魚(yú)活性肽中、高劑量組LD 含量極顯著降低（P＜0.01），但鰹魚(yú)活性肽低劑量組與運(yùn)動(dòng)模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，鰹魚(yú)活性肽給藥組均極顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.01）。這說(shuō)明隨著小鼠運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的增加，運(yùn)動(dòng)模型組小鼠血清中的LD 含量急劇升高；而給藥組可顯著降低小鼠運(yùn)動(dòng)后血清中的LD 含量，從而有效緩解小鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞。見(jiàn)表8。

表8 鰹魚(yú)活性肽對(duì)小鼠血清LD含量的影響（）Table 8 Effect of bioactive peptide in Katsuwonus pelamis on serum LD content of mice（）

表8 鰹魚(yú)活性肽對(duì)小鼠血清LD含量的影響（）Table 8 Effect of bioactive peptide in Katsuwonus pelamis on serum LD content of mice（）

注：與安靜空白組比較，1）P＜0.01；與運(yùn)動(dòng)模型組比較，2）P＜0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，3）P＜0.01。Note:Compared with the quiet blank group,1) P＜0.01;compared with the exercise model group,2) P＜0.01;compared with the positive control group,3)P＜0.01.

3.4.4 鰹魚(yú)活性肽對(duì)小鼠血清LDH活性的影響 力竭游泳運(yùn)動(dòng)后的小鼠LDH 活性升高，且運(yùn)動(dòng)模型組小鼠的LDH 活性高于安靜空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與運(yùn)動(dòng)模型組相比，給藥組LDH 活性均極顯著降低（P＜0.01）；且陽(yáng)性對(duì)照組LDH 活性顯著低于鰹魚(yú)活性肽低、高劑量組（P＜0.05），極顯著低于中劑量組（P＜0.01）。見(jiàn)表9。

表9 鰹魚(yú)活性肽對(duì)小鼠血清LDH活性的影響（）Table 9 Effect of bioactive peptide in Katsuwonus pelamis on serum LDH activity of mice（）

表9 鰹魚(yú)活性肽對(duì)小鼠血清LDH活性的影響（）Table 9 Effect of bioactive peptide in Katsuwonus pelamis on serum LDH activity of mice（）

3.4.5 鰹魚(yú)活性肽對(duì)小鼠肝臟MDA含量的影響 力竭運(yùn)動(dòng)模型組小鼠的MDA含量高于安靜空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。當(dāng)小鼠力竭游泳運(yùn)動(dòng)后，給藥組MDA 含量均極顯著低于運(yùn)動(dòng)模型組（P＜0.01）；且陽(yáng)性對(duì)照組MDA 含量極顯著低于鰹魚(yú)活性肽低劑量組（P＜0.01），顯著低于中劑量組（P＜0.05），但與高劑量組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。這說(shuō)明模型組的小鼠在過(guò)度運(yùn)動(dòng)后，導(dǎo)致其MDA含量快速增加；但給藥組顯著降低小鼠肝臟MDA含量的積累，有效提高其對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的適應(yīng)能力。見(jiàn)表10。

表10 鰹魚(yú)活性肽對(duì)小鼠肝臟MDA含量的影響（）Table 10 Effect of bioactive peptide in Katsuwonus pelamis on MDA in liver of mice（）

表10 鰹魚(yú)活性肽對(duì)小鼠肝臟MDA含量的影響（）Table 10 Effect of bioactive peptide in Katsuwonus pelamis on MDA in liver of mice（）

注：與安靜空白組比較，1）P＜0.01；與運(yùn)動(dòng)模型組比較，2）P＜0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，3）P＜0.01，4）P＜0.05。Note:Compared with the quiet blank group,1) P＜0.01;compared with the exercise model group,2)P＜0.01;compared with the positive control group,3)P＜0.01,4)P＜0.05.

3.4.6 鰹魚(yú)活性肽對(duì)小鼠肝臟SOD活性的影響 力竭游泳運(yùn)動(dòng)后的小鼠SOD 活性升高，且運(yùn)動(dòng)模型組小鼠的SOD活性極顯著高于安靜空白組（P＜0.01）。與運(yùn)動(dòng)模型組相比，給藥組SOD 活性均極顯著升高（P＜0.01）；進(jìn)一步比較分析發(fā)現(xiàn)，鰹魚(yú)活性肽給藥組SOD 活性極顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.01）。這說(shuō)明給藥組通過(guò)提高小鼠肝臟SOD 活性來(lái)增強(qiáng)其抗氧化能力，從而有效緩解小鼠疲勞現(xiàn)象的出現(xiàn)。見(jiàn)表11。

表11 鰹魚(yú)活性肽對(duì)小鼠肝臟SOD活性的影響（）Table 11 Effect of bioactive peptide in Katsuwonus pelamis on SOD activity in liver of mice（）

表11 鰹魚(yú)活性肽對(duì)小鼠肝臟SOD活性的影響（）Table 11 Effect of bioactive peptide in Katsuwonus pelamis on SOD activity in liver of mice（）

注：與安靜空白組比較，1）P＜0.01；與運(yùn)動(dòng)模型組比較，2）P＜0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，3）P＜0.01。Note:Compared with the quiet blank group,1) P＜0.01;compared with the exercise model group,2) P＜0.01;compared with the positive control group,3)P＜0.01.

4 討論

4.1 鰹魚(yú)活性肽提取工藝

活性肽由3～20 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，具有抗疲勞、抗氧化、抗高膽固醇、抗腫瘤、降血壓、調(diào)節(jié)免疫等功效，可采用酶解法、溶劑提取法、發(fā)酵法、化學(xué)水解法及合成法等方法獲得［21-22］。其中，酶解法由于操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)溫度低、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)，已在海洋魚(yú)生物活性肽的提取中廣泛應(yīng)用［12，23-24］。本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法建立風(fēng)味蛋白酶酶解制備鰹魚(yú)活性肽工藝的二次多元回歸方程，該回歸方程擬合度高，所得實(shí)際值與模型預(yù)測(cè)值相差極小，可有效預(yù)測(cè)鰹魚(yú)活性肽的得率。其最佳工藝參數(shù)為料液比1∶1，加酶量4 400 U/g，酶解時(shí)間6.5 h，酶解溫度42 ℃；在該工藝條件下，鰹魚(yú)活性肽得率為33.166%。

4.2 鰹魚(yú)活性肽對(duì)小鼠抗疲勞的作用

機(jī)體力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生疲勞，這與代謝產(chǎn)物堆積、能量損耗、氧化應(yīng)激、炎癥因子水平上升等因素有關(guān)；研究表明，運(yùn)動(dòng)性疲勞發(fā)生時(shí)，會(huì)導(dǎo)致LD、BUN等代謝產(chǎn)物積累，糖原、三磷酸腺苷（ATP）等能量物質(zhì)耗竭，機(jī)體氧化與抗氧化系統(tǒng)的代謝失衡，白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α等促炎因子過(guò)度釋放［25-27］。上述因素相互聯(lián)系，共同作用，促進(jìn)了運(yùn)動(dòng)性疲勞的產(chǎn)生。

目前研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)性疲勞產(chǎn)生的最直觀表現(xiàn)是運(yùn)動(dòng)耐力的下降，可采用負(fù)重力竭游泳實(shí)驗(yàn)作為評(píng)價(jià)小鼠耐力和疲勞狀態(tài)等指標(biāo)的方法。因此，本研究通過(guò)構(gòu)建遞增負(fù)荷式游泳訓(xùn)練所致的疲勞小鼠為模型，驗(yàn)證鰹魚(yú)活性肽的抗疲勞作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照組和鰹魚(yú)活性肽給藥組均極顯著延長(zhǎng)了小鼠負(fù)重力竭游泳時(shí)間（P＜0.01），對(duì)提高小鼠耐力以及緩解小鼠疲勞有明顯作用。

隨著疲勞的產(chǎn)生，機(jī)體內(nèi)會(huì)累積LD、MDA 等物質(zhì)［1-2］。其中，LD 產(chǎn)生于機(jī)體的新陳代謝和運(yùn)動(dòng)中，LD的堆積會(huì)使機(jī)體內(nèi)的環(huán)境變酸，導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂，從而降低肌肉收縮能力，并誘導(dǎo)疲勞的產(chǎn)生，因此，LD 對(duì)調(diào)節(jié)機(jī)體肌肉活力和抗疲勞具有重要作用［28］。MDA 是生物膜中不飽和脂肪酸過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物之一，其含量多寡與運(yùn)動(dòng)性疲勞密切相關(guān)［29］；當(dāng)機(jī)體劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，導(dǎo)致氧化磷酸化反應(yīng)加快，機(jī)體內(nèi)的自由基含量急劇增加，超出自由基清除酶系統(tǒng)的清除能力，從而引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，使肌肉活力降低，并產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)性疲勞或運(yùn)動(dòng)損傷。BUN 是血清中除蛋白質(zhì)以外的一種含氮化合物［30］；當(dāng)機(jī)體劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，隨著能量需求激增，會(huì)引起蛋白質(zhì)代謝活躍而導(dǎo)致BUN含量升高，而B(niǎo)UN含量積累越多，機(jī)體越疲勞［31］。本研究表明，隨著小鼠運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的增加，運(yùn)動(dòng)模型組BUN、LD 和MDA 含量均極顯著高于安靜空白組（P＜0.01），說(shuō)明劇烈運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致小鼠體內(nèi)BUN、LD、MDA 大量堆積。陽(yáng)性對(duì)照組及鰹魚(yú)活性肽給藥組BUN 和MDA 含量均能夠極顯著低于運(yùn)動(dòng)模型組（P＜0.01）；陽(yáng)性對(duì)照組及鰹魚(yú)活性肽中、高劑量組LD 含量極顯著低于運(yùn)動(dòng)模型組（P＜0.01），但鰹魚(yú)活性肽低劑量組與運(yùn)動(dòng)模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；這表明鰹魚(yú)活性肽能夠有效減少小鼠血清BUN、LD含量和肝臟MDA含量的累積，減輕小鼠因乳酸堆積和自由基積累而導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)性疲勞出現(xiàn)，從而提升小鼠對(duì)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的適應(yīng)能力。

LDH 作為糖酵解途徑中的重要氧化還原酶類，可催化機(jī)體內(nèi)乳酸和丙酮酸之間的可逆反應(yīng)，尤其在厭氧條件下能催化丙酮酸產(chǎn)生乳酸，其活性高低與機(jī)體內(nèi)乳酸清除的代謝效率密切相關(guān)［32-33］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠劇烈運(yùn)動(dòng)后，運(yùn)動(dòng)模型組LDH 活性極顯著升高（P＜0.01），與張?zhí)N琨等［34］研究結(jié)果相似，這可能與力竭游泳運(yùn)動(dòng)會(huì)使肌組織產(chǎn)生一定的損傷，致使肌細(xì)胞的通透性增加有關(guān)；而與運(yùn)動(dòng)模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組及鰹魚(yú)活性肽給藥組LDH 活性均極顯著降低（P＜0.01）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)模型組的LDH 活性較高且LD 含量也較高，這可能是由于運(yùn)動(dòng)模型組小鼠超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后機(jī)體組織內(nèi)處于缺氧狀態(tài)，其丙酮酸脫氫酶無(wú)法及時(shí)將丙酮酸轉(zhuǎn)換為乙酰輔酶A，從而導(dǎo)致丙酮酸大量堆積，而在較高的LDH 活性下將丙酮酸還原為乳酸，造成運(yùn)動(dòng)模型組小鼠血液中LD 含量增加；而陽(yáng)性對(duì)照組和鰹魚(yú)活性肽給藥組LDH 活性均降低，其LD 含量也降低，這說(shuō)明鰹魚(yú)活性肽能有效緩解小鼠超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)所導(dǎo)致的疲勞現(xiàn)象。

SOD 是機(jī)體中清除自由基重要的抗氧化酶，對(duì)維持機(jī)體氧化和抗氧化平衡起著重要作用，其活性高低反應(yīng)了機(jī)體清除自由基的能力以及抗疲勞的效果［35-36］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著小鼠超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)模型組SOD 活性極顯著高于安靜空白組（P＜0.01），這可能是由于小鼠為抵抗運(yùn)動(dòng)性疲勞而出現(xiàn)的應(yīng)激反應(yīng)，但其活性增加不足以清除小鼠體內(nèi)過(guò)多的自由基，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)模型組脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物MDA 含量的急劇增加；而陽(yáng)性對(duì)照組及鰹魚(yú)活性肽給藥組SOD活性極顯著高于運(yùn)動(dòng)模型組（P＜0.01），說(shuō)明給藥組可通過(guò)提高SOD 活性來(lái)延緩小鼠體內(nèi)自由基的堆積，降低MDA 含量，使小鼠體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡中，提示鰹魚(yú)活性肽減輕力竭游泳小鼠疲勞的作用可能與增強(qiáng)抗氧化應(yīng)激能力有關(guān)。

綜上所述，陽(yáng)性對(duì)照組及鰹魚(yú)活性肽給藥組可延長(zhǎng)小鼠負(fù)重力竭游泳時(shí)間，通過(guò)提高SOD 活性來(lái)降低MDA 含量的積累，降低LDH 活性，減少力竭運(yùn)動(dòng)后小鼠血清的LD、BUN 含量，從而增強(qiáng)小鼠運(yùn)動(dòng)負(fù)荷能力，延緩小鼠疲勞產(chǎn)生。因此認(rèn)為，通過(guò)風(fēng)味蛋白酶酶解制備的鰹魚(yú)活性肽對(duì)緩解小鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞具有促進(jìn)作用。