崔靈珺，田 超，程梓軒，鄭佳彬，蘇 菲，譚煌英

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，北京 100029；

2.中日友好醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤內(nèi)科，北京 100029

1 引言

胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（gastroenteropancreatic neuroendocrine neoplasm，GEP-NEN）是一種罕見的異質(zhì)性腫瘤，包括分化良好的神經(jīng)內(nèi)分泌瘤（neuroendocrine tumor，NET）和分化差的神經(jīng)內(nèi)分泌癌（neuroendocrine carcinoma，NEC），其發(fā)病率在過去30年顯著上升。目前美國的GEPNET發(fā)病率為3.56/10萬［1］，GEP-NEC發(fā)病率為0.4/10萬［2］。

針對GEP-NEN目前已有諸多治療手段，但仍難以滿足臨床需求?；A(chǔ)研究是解決臨床問題的基石，臨床前模型對深入研究罕見腫瘤的發(fā)生、發(fā)展分子機制及新藥研制至關(guān)重要。本文總結(jié)目前臨床前GEP-NEN模型，包括細胞系、原代細胞培養(yǎng)、類器官模型，人源腫瘤異種移植物（patient-derived xenograft，PDX）模型，基因工程小鼠模型（genetically engineered mouse model，GEMM），對其優(yōu)勢和局限性進行討論，并重點反映近年來的研究進展。

2 GEP-NEN的分子特征

GEP-NEN從遺傳學(xué)上可分為家族性或散發(fā)性。常見的家族性GEP-NEN包括多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤1型（multiple endocrine neoplasia 1，MEN1）綜合征、結(jié)節(jié)性硬化癥（tuberous sclerosis，TSC）、希佩爾-林道（Von Hippel-Lindau，VHL）綜合征和神經(jīng)纖維瘤病1型（neurofibromatosis type l，NF1）。

MEN 1 綜合征臨床常表現(xiàn)為甲狀旁腺（95%）、胰腺（60%）和垂體（30%）等部位的腫瘤。MEN1基因突變后Menin蛋白表達減少，主要通過影響細胞周期、DNA損傷修復(fù)及磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路機制而致?。?-4］。TSC主要表現(xiàn)為面部血管纖維瘤和廣泛性錯構(gòu)瘤，由TSC1和TSC2突變引起mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路改變。VHL綜合征是由VHL基因失活或錯義突變引起的。VHL基因為抑癌基因，編碼pVHL蛋白，與缺氧誘導(dǎo)因子的降解和調(diào)控細胞周期蛋白相關(guān)。因此VHL綜合征腫瘤中富含血管，并過表達缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α）及血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等。NF1則是由于NF1基因失活突變，RAS及其下游激酶激活所致。臨床表現(xiàn)為皮膚纖維神經(jīng)瘤、咖啡牛奶斑、虹膜Lisch結(jié)節(jié)及胰腺或十二指腸生長抑素瘤。此外，有研究［4］證明，IPMK、MUTYH和OGG1基因突變或與家族性小腸NET的發(fā)生相關(guān)。

散發(fā)GEP-NET 中最常見的突變基因為MEN1，其次為與胰腺NEN患者預(yù)后密切相關(guān)的DAXX及ATRX突變［3，5］。此外，CDKN1B和調(diào)控mTOR-蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的相關(guān)基因突變包括DEPDC5、PTEN、TSC1和TSC2［5-7］。GEP-NEC中TP53和RB突變更多，TP53突變存在于90%～95%的GEPNEC患者中，RB突變存在于60%～75%的GEPNEC患者中［8-9］。

3 GEP-NEN的體外模型

3.1 GEP-NEN細胞系

細胞系因為條件可控、操作便捷，常應(yīng)用于腫瘤臨床前研究中，并對分子機制驗證具有獨特優(yōu)勢。目前已有多種GEP-NEN細胞系被投入研究中。

較常用的分化良好的胰腺NET細胞系為BON-1［10］和QGP-1［11］，雖然這兩種細胞系存在很多缺陷，如生長抑素受體（somatostatin receptor，SSTR）表達較腫瘤組織內(nèi)明顯降低［12］，但仍有較高的應(yīng)用價值。由于傳代數(shù)導(dǎo)致的亞克隆性及染色體不穩(wěn)定性，不同研究對于BON-1和QGP-1細胞攜帶的突變基因觀點不同。同為胰腺來源的NT-3細胞系分化良好、功能活躍、生長緩慢，且高表達SSTR，在裸鼠皮下形成的腫瘤Ki-67增殖指數(shù)與患者相似（15%～25%）［13］。CM胰島素瘤細胞表現(xiàn)出功能性胰島素分泌［14］。APL1細胞系可在體內(nèi)外增殖，且與原腫瘤相似度較高［15］。來源于小腸的細胞系GOT-1［16］和P-STS［17］相關(guān)研究分別發(fā)表于2001年和2009年，目前GOT-1已被應(yīng)用于177Lu-octreotate給藥模式的研究中［18］，而P-STS已被應(yīng)用于小腸NET腸系膜纖維化的機制研究中［19］。

NEC細胞系中，NEC-DUE1、NEC-DUE2來源于同一研究，兩者分別屬于胃和結(jié)腸NEC，表達典型神經(jīng)內(nèi)分泌標志物，并且在順鉑、依托泊苷、5-氟尿嘧啶及奧沙利鉑的藥效評估中與臨床表現(xiàn)相似［20］。胰腺NEC細胞系A(chǔ)99同樣也已進行了神經(jīng)內(nèi)分泌標志物表達評估，但尚未進行藥效評估［21］。此外還有數(shù)種已經(jīng)發(fā)表的人源NET和NEC細胞系，其名稱及來源詳見表1。

表1 人源NET和NEC細胞系詳情Tab.1 Details of human NET and NEC cell lines

細胞系除了可反映腫瘤部分生物及分子特征外，目前還可應(yīng)用于藥物研究，并可揭示部分腫瘤發(fā)病的分子機制。GEP-NEN發(fā)病率較低，因此來源稀少，且腫瘤惡性程度較低，細胞分裂率低，要求培養(yǎng)環(huán)境嚴苛，導(dǎo)致細胞系建立效率低，且在培育過程中可能失去原代細胞株的特征或產(chǎn)生新的突變。目前尚缺乏胃NET細胞系，為相關(guān)研究帶來困難。

3.2 原代細胞培養(yǎng)

原代細胞培養(yǎng)是利用患者腫瘤組織進行細胞培養(yǎng)，維持數(shù)天并保留原始腫瘤特征。該方法獲得的組織更接近生物體內(nèi)狀態(tài)，可用于研究生物體細胞的生長、代謝及增殖，同時也為以后傳代培養(yǎng)創(chuàng)造條件。目前胰腺NET原代培養(yǎng)物已經(jīng)應(yīng)用于SSA、依維莫司、舒尼替尼、替莫唑胺等藥物的反應(yīng)性研究中［33-36］。另外，小腸NET原代培養(yǎng)物已在臨床藥物治療敏感性研究中加以應(yīng)用［37］。

由于GEP-NEN的時空異質(zhì)性，原代培養(yǎng)可實時反映臨床實際情況，因此未來或可將原代細胞培養(yǎng)應(yīng)用于個體化治療。

3.3 類器官模型

腫瘤類器官是用取自患者體內(nèi)的腫瘤組織在實驗室中培養(yǎng)出的微型3D腫瘤細胞模型，其成功率在不同研究中差別較大。這種模型保留了來源組織具有的細胞譜系特征和生物學(xué)特征，且比原代細胞培養(yǎng)更能夠還原腫瘤微環(huán)境，培養(yǎng)傳代后仍保持遺傳和表型穩(wěn)定，因此可針對患者個體進行藥物篩選并制訂診療計劃［38］。

在過去幾年的研究中，已有研究者［39-40］建立多種胰腺NET、小腸NET的類器官培養(yǎng)物，其表型和基因型均與親代腫瘤組織高度相似，并與臨床患者表現(xiàn)十分相似。結(jié)直腸NEC的類器官模型也已建立。研究者已對這些類器官進行藥物反應(yīng)性測試，其測試前后表現(xiàn)均與臨床相似。另外，研究者［41-42］還通過這些類器官揭示了TP53、RB1等基因?qū)δ[瘤發(fā)生的影響，后續(xù)可對這些模型進行進一步測序研究，進一步揭示其他基因突變及NEN發(fā)生、發(fā)展的分子機制。

除以上研究外，另有日本學(xué)者［43］建立了1個大型GEP-NEN類器官庫，其中包括食管、胃、肝臟、膽囊、胰腺、結(jié)腸部位的NEC及膽囊、胰腺、十二指腸部位的NET類器官模型，該研究通過25例類器官模型的建立，并對其進行全基因組測序、表型研究，研究了GEP-NEN分子特征和生物表型的相關(guān)性。

類器官作為GEP-NEN的研究手段具有巨大潛力，其培養(yǎng)條件相對寬松，可在長期擴增的同時保持來源組織的基因特點。該模型還可作為腫瘤發(fā)展早期階段的研究手段，且可以反映腫瘤間和腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性，未來可應(yīng)用于臨床前篩查中［44］。

4 GEP-NEN的體內(nèi)模型

4.1 細胞系異種移植模型

人源腫瘤細胞系異種移植模型主要是將體外培養(yǎng)的人源腫瘤細胞系接種到免疫缺陷小鼠體內(nèi)而構(gòu)建的腫瘤模型［45］。在GEP-NEN中，研究者發(fā)現(xiàn)此類模型可不同程度地在皮下、原位生長，或產(chǎn)生轉(zhuǎn)移性腫瘤，但另有研究［37，46］發(fā)現(xiàn)，形成的腫瘤缺乏神經(jīng)內(nèi)分泌活動。近年來，Maharjan等［47］將人源細胞系QGP-1和BON-1通過靜脈及心臟注射入NSG小鼠，成功構(gòu)建了胰腺NET多處轉(zhuǎn)移模型，其中QGP-1和BON-1接種小鼠肝轉(zhuǎn)移灶形成率分別為100%和60%。該方法成瘤率較高，未來或可應(yīng)用于胰腺NET肝轉(zhuǎn)移的研究中。

4.2 PDX模型

PDX模型是將人腫瘤組織接種于免疫缺陷小鼠體內(nèi)形成的腫瘤研究模型。該模型保留了其供體腫瘤的主要組織學(xué)和遺傳學(xué)特征，能夠在后續(xù)傳代中保持穩(wěn)定，可用于臨床前藥物療效預(yù)測［48］。但PDX模型的建立是以免疫缺陷小鼠為載體，因此不適合腫瘤免疫相互作用或免疫療法的研究［49］。

2016年，Yang等［50］研究發(fā)現(xiàn)，GEP-NET的PDX模型建立成功率較低，不足10%，該研究最終建立成功的PDX模型表現(xiàn)出較高的Ki-67增殖指數(shù)（70%～90%），與NEC更為相似。同年Krampitz等［15］以胰腺NET患者腫瘤組織構(gòu)建了PDX模型，發(fā)現(xiàn)細胞表面蛋白CD90的表達可作為胰腺NET的標志物，并發(fā)現(xiàn)阻斷CD47信號可促進體外巨噬細胞吞噬腫瘤細胞，抑制異種移植瘤生長，防止轉(zhuǎn)移，延長生存期。此外，該類模型目前已應(yīng)用于藥物評估中。2018年，Chamberlain等［51］構(gòu)建了胰腺NET患者的PDX模型，組織來源于1例晚期胰島素瘤肝轉(zhuǎn)移患者行減瘤術(shù)后的標本，應(yīng)用該PDX模型對mTOR抑制劑依維莫司和新藥沙帕色替進行了藥物反應(yīng)性研究，發(fā)現(xiàn)兩藥對胰腺NET均有很強的抑制作用，但沙帕色替對依維莫司耐藥的腫瘤依然有效。

在GEP-NEC中，已有多項研究在NEC細胞系的建立中提到相關(guān)PDX模型，但并未進行詳細記述。1999年，Tanaka等［52］建立的直腸NEC的PDX模型來源于直腸NEC患者轉(zhuǎn)移的腹股溝淋巴結(jié)。2016年，F(xiàn)ujii等［53］在1個結(jié)直腸腫瘤模型庫中構(gòu)建了2例結(jié)直腸NEC模型，該模型與源腫瘤在組織學(xué)及表型上基本一致。2015年，Jiang等［54］建立了1例胃NEC的PDX模型，腫瘤來源于1例T3N1M0期患者的手術(shù)標本。該PDX模型具有VEGF-A和VEGF-B高表達特征，并容易產(chǎn)生肺轉(zhuǎn)移，該研究證明循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTC）可作為轉(zhuǎn)移性PDX模型中抗癌藥物療效評價的有效指標，且CTC的CK18表達及克隆倍數(shù)可能為胃NEC順鉑敏感性的影響因素。

4.3 GEMM

GEMM是指利用基因工程技術(shù)改造與修飾小鼠的胚胎干細胞或受精卵基因，促進特定腫瘤形成的模型。目前已應(yīng)用于突變基因、腫瘤演化轉(zhuǎn)移機制、腫瘤微環(huán)境、藥物安全性評價等領(lǐng)域中［55］。然而，小鼠和人類之間存在明顯的生物學(xué)差異，因此GEMM能否反映人類GEP-NEN的遺傳背景及其診斷組織學(xué)特征仍有待商榷。此外，GEMM可能無法精確還原散發(fā)型GEP-NEN的生物學(xué)特性［56］。2021年，Detjen等［49］列出詳細表格綜述了GEMM信息，包括小鼠品系、腫瘤類型、突變基因等。

GEP-NET的GEMM包括基因敲除模型和SV40-Tag轉(zhuǎn)基因模型。

4.3.1 基因敲除模型

在基因敲除GEMM中，最常見的是MEN1基因敲除，不同種系小鼠及不同造模方法導(dǎo)致成功率為11%～100%不等。若純合敲除GEMM的MEN1基因?qū)剐∈笤谠兄衅谝蚨嗥鞴偃毕菟劳?。而在雜合敲除MEN1基因的GEMM中則表現(xiàn)出與人類似的MEN1綜合征內(nèi)分泌腫瘤表型，該表型揭示了腫瘤發(fā)生的各個過程，為進一步的研究和治療提供思路［57］。ATP4a功能喪失的GEMM會出現(xiàn)胃酸缺乏，進而引起高胃泌素血癥并導(dǎo)致ECL細胞增生。研究者觀察到這些小鼠胃腺結(jié)構(gòu)惡化，發(fā)生嚴重增生、發(fā)育不良和腺體化生，然而，當(dāng)酸化胃內(nèi)環(huán)境時，胃腺化生和異常增生可得到改善［58］。而在大鼠胰島素啟動子（rat insulin promoter，RIP）背景下過表達AKT1的GEMM則可表現(xiàn)出β細胞增殖和高血漿胰島素水平，并約有80%的小鼠會發(fā)展成胰島素瘤［59］。

4.3.2 SV40-Tag轉(zhuǎn)基因模型

RIP-Tag的GEMM是SV40-Tag轉(zhuǎn)基因模型的代表，RIP特異性地驅(qū)動胰島細胞中Tag的表達，致使β細胞高度增殖［49］。RIP-Tag的GEMM已被廣泛應(yīng)用于GEP-NEN模型中，該造模方法成功率接近100%，目前已用于依維莫司和舒尼替尼療效評估［60］，并在人體臨床試驗中得到驗證［61-62］。此外，目前還有基于Tag構(gòu)建的其他GEP-NET模型，如胰高血糖素瘤和結(jié)腸NET模型，但均未進行藥物療效評估［63-64］。

5 結(jié)論

GEP-NEN的罕見性使其基礎(chǔ)研究數(shù)量少，發(fā)病機制及治療研究并不充分。隨著其發(fā)病率及臨床觀察研究增多，研究者逐漸意識到這類疾病的治療手段貧乏、預(yù)后不佳，因此其機制研究日漸增多。近年來，隨著研究的加深，研究者已經(jīng)能從基因、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、表型等方面解釋部分GEP-NEN的發(fā)病機制，由此豐富了臨床治療手段，這些進展與模型研究息息相關(guān)［65］。目前已經(jīng)投入應(yīng)用的穩(wěn)定細胞系、類器官培養(yǎng)、PDX模型、原代細胞培養(yǎng)及基因工程小鼠可從多個角度揭示腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程，并對藥物開發(fā)及個性化治療提供研究工具。未來研究者們將會開發(fā)更多、更全面的模型，為進一步研究GEP-NEN提供有效的手段。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。