薛宇彤，鄭錦秀，2，邵 瑩，梁泰剛，楊利軍*

1.山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)細胞生理學(xué)教育部重點實驗室；3.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院

隨著人們生活水平的提高，中醫(yī)食療得到越來越多人的認可。中醫(yī)食療是以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，選取具有藥用價值的食物治療疾病[1]。通過食療，補充人體所需的營養(yǎng)素，使機體達到均衡營養(yǎng)的狀態(tài)。黃酮類化合物是許多藥用植物的有效成分，在自然界中廣泛分布于水果、蔬菜、茶、植物根莖、花部位[2-3]，在水果、蔬菜中含量最高[4],是人體所需的天然營養(yǎng)素之一[5],在降血糖、降血脂、抗感染和抗腫瘤等方面發(fā)揮重要作用。山楂葉總黃酮是山楂葉的提取物，具有廣泛的藥理作用。益心酮片的主要成分是山楂葉的提取物[6]，臨床用于治療冠心病、心絞痛、高脂血癥等病癥，但該生物制劑尚未改變黃酮類化合物口服難吸收、生物利用度低的不足。脂質(zhì)體是一種安全、無毒、具有靶向給藥功能的新型藥物制劑[7]，可以包封水溶性、脂溶性及兩親性的物質(zhì)，在醫(yī)藥界、食品界及保健品界有著非常廣泛的應(yīng)用[8-10]，以增強食品的感官屬性、保質(zhì)期，增加產(chǎn)品的溶解度及生物利用度[11]。本研究以山楂葉提取物總黃酮為原料，采用薄膜分散-超聲法制備脂質(zhì)體，并通過正交試驗優(yōu)選脂質(zhì)體的制備工藝，對其理化性質(zhì)及貯藏穩(wěn)定性進行探究，以期為后期開發(fā)食療產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 大豆卵磷脂、膽固醇、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、吐溫80（北京索萊寶科技有限公司）；二氯甲烷、無水乙醇、亞硝酸鈉、無水三氯化鋁、氫氧化鈉、甲醇均為分析純（天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）。

1.2 儀器 SB25-12DTD 超聲波清洗，UP-250 手提式超聲波細胞粉粹機（寧波新芝生物科技有限公司）；Spectra Max 190 型酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices 公司）；NanoZS 90 激光粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 山楂葉總黃酮脂質(zhì)體的制備 參照涂清波等[12]研究方法稍作改動。采用薄膜分散-超聲法制備山楂葉總黃酮脂質(zhì)體。稱取一定量的大豆卵磷脂、膽固醇、吐溫80 按一定比例溶于二氯甲烷中，山楂葉黃酮溶于70%乙醇中，充分溶解后置于茄形瓶中，低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，待形成薄膜后，加入一定量磷酸鹽緩沖液（PBS）水化洗膜，將懸濁液經(jīng)過超聲波細胞粉碎機在一定功率下超聲一定時間，最后過0.45 μm 濾膜，即得脂質(zhì)體。

1.3.2 單因素考察

1.3.2.1 卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比對脂質(zhì)體包封率的影響 固定卵磷脂濃度20 mg/mL、卵磷脂與山楂葉總黃酮質(zhì)量比10:1、吐溫80 添加量占卵磷脂質(zhì)量比20%、PBS 的pH 7.4、超聲功率20%、超聲時間5 min，考察卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比分別為2:1、3:1、4:1、5:1、6:1 時對脂質(zhì)體包封率的影響。

1.3.2.2 卵磷脂濃度對脂質(zhì)體包封率的影響 固定卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比4:1、卵磷脂與山楂葉總黃酮質(zhì)量比10:1、吐溫80 添加量占卵磷脂質(zhì)量比20%、PBS的pH 7.4、超聲功率20%、超聲時間5 min，考察卵磷脂濃度（在PBS 中的濃度）分別為5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL 時對脂質(zhì)體包封率的影響。

1.3.2.3 卵磷脂與山楂葉總黃酮質(zhì)量比對脂質(zhì)體包封率的影響 固定卵磷脂濃度20 mg/mL、卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比4:1、吐溫80 添加量占卵磷脂質(zhì)量比20%、PBS 的pH 7.4、超聲功率20%、超聲時間5 min，考察卵磷脂與山楂葉總黃酮質(zhì)量比分別為20:1、10:1、10:2、10:3、10:4 時對脂質(zhì)體包封率的影響。

1.3.2.4 吐溫80 添加量占卵磷脂質(zhì)量比對脂質(zhì)體包封率的影響 固定卵磷脂濃度20 mg/mL、卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比4:1、卵磷脂與山楂葉總黃酮質(zhì)量比10:1、PBS 的pH 7.4、超聲功率20%、超聲時間5 min，考察吐溫80 添加量占卵磷脂質(zhì)量比分別為10%、15%、20%、25%、30%時對脂質(zhì)體包封率的影響。

1.3.2.5 PBS 的pH 對脂質(zhì)體包封率的影響 固定卵磷脂濃度20 mg/mL、卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比4:1、卵磷脂與山楂葉總黃酮質(zhì)量比10:1、吐溫80 添加量占卵磷脂質(zhì)量比20%、超聲功率20%、超聲時間5 min，考察PBS 的pH 分別為6.6，7.0，7.4，7.8，8.2 時對脂質(zhì)體包封率的影響。

1.3.2.6 超聲功率對脂質(zhì)體包封率的影響 固定卵磷脂濃度20 mg/mL、卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比4:1、卵磷脂與山楂葉總黃酮質(zhì)量比10:1、吐溫80 添加量占卵磷脂質(zhì)量比20%、PBS 的pH 7.4、超聲時間5 min，考察超聲功率分別為10%、20%、40%、60%、80%時對脂質(zhì)體包封率的影響。

1.3.2.7 超聲時間對脂質(zhì)體包封率的影響 固定卵磷脂濃度20 mg/mL、卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比4:1、卵磷脂與山楂葉總黃酮質(zhì)量比10:1、吐溫80 添加量占卵磷脂質(zhì)量比20%、PBS 的pH 7.4、超聲功率20%，考察超聲時間分別為1 min、3 min、5 min、7 min、9 min 時對脂質(zhì)體包封率的影響。

1.3.3 正交試驗 在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取對包封率影響較大的4 因素進行L9（34）4 因素3 水平正交試驗方案設(shè)計，優(yōu)化脂質(zhì)體的制備工藝，試驗因素及水平見表1。

表1 L9（34）因素及水平

1.3.4 黃酮含量測定

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 根據(jù)文獻[13-14]方法，準(zhǔn)確稱取適量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用70%乙醇完全溶解，配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用倍比稀釋法制備質(zhì)量濃度分別為0.500 mg/mL、0.250 mg/mL、0.125 mg/mL、0.063 mg/mL、0.031 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取50 μL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入5%NaNO2溶液20 μL，靜置5 min；加入10% AlCl3溶液20 μL，靜置6 min；最后加入4%NaOH 溶液200 μL，靜置15 min，在酶標(biāo)儀中振蕩3 s，于510 nm 處測定吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.2 含量測定 按照上述1.3.4.1 中方法，自“加入5% NaNO2溶液20 μL，靜置5 min”起，到“于510 nm 處測定吸光度”。然后按照公式（1）計算山楂葉總黃酮。

式中:M——山楂葉總黃酮含量，mg/g；C——對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出的反應(yīng)液總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V——反應(yīng)液體積，mL；W——原料質(zhì)量，g。

1.3.5 包封率的測定 參照文獻[15]方法做適當(dāng)修改。精密量取脂質(zhì)體1 mL，加入50 mL 甲醇破乳后再稀釋10 倍，于510 nm 處測吸光度，計算黃酮含量（M總）。精密量取脂質(zhì)體1 mL，4 ℃，10 000 r/min 離心30 min，取上清液10 μL，甲醇定容至5 mL，測定吸光度，計算游離黃酮含量（M游），按照公式（2）計算包封率。

式中:R——包封率，%；M總——黃酮含量，mg/g；M游——為游離黃酮含量，mg/g。

1.3.6 粒徑及電位測定 用去離子水將樣品稀釋適當(dāng)倍數(shù)，采用NanoZS 90 激光粒度儀測定脂質(zhì)體粒徑及Zeta 電位。

1.3.7 透射電鏡圖像 根據(jù)文獻[16]方法，用去離子水將樣品稀釋適當(dāng)倍數(shù)，采用磷鎢酸負染法染色觀察脂質(zhì)體形態(tài)。

1.3.8 溫度對山楂葉總黃酮脂質(zhì)體貯藏穩(wěn)定性的影響 將脂質(zhì)體密封分別在4 ℃、25 ℃條件下避光貯藏28 d，以外觀、包封率為指標(biāo)，評價脂質(zhì)體貯藏穩(wěn)定性，外觀評價標(biāo)準(zhǔn)如下：（-）表示淡黃色，均一、無絮凝和沉淀；（-+）表示淡黃色，有少量絮凝和沉淀、振蕩后溶解；（+)表示黃色，有少量絮凝和沉淀、振蕩后溶解；(++)表示黃色，有大量絮凝和沉淀、振蕩后不溶解。

1.4 數(shù)據(jù)分析 實驗重復(fù)3 次，采用SPSS 25.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)描述。使用GraphPad Prism 6.02 作圖。

2 結(jié)果

2.1 單因素考察

2.1.1 卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比對脂質(zhì)體包封率的影響 結(jié)果如圖1 所示，在一定范圍內(nèi)，脂質(zhì)體包封率隨著卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比的增加而增大，當(dāng)比例超過4:1 時，呈下降趨勢。因此，卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比在（3:1）～（5:1）范圍內(nèi)較為合適。

圖1 卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比對脂質(zhì)體包封率的影響

2.1.2 卵磷脂濃度對脂質(zhì)體包封率的影響 由圖2 可知，隨著卵磷脂濃度的增加，脂質(zhì)體包封率呈先升后降趨勢。當(dāng)卵磷脂濃度為20 mg/mL 時，包封率最大，然后開始下降。故卵磷脂濃度10～30 mg/mL范圍內(nèi)為宜。

圖2 卵磷脂濃度對脂質(zhì)體包封率的影響

2.1.3 卵磷脂與山楂葉總黃酮質(zhì)量比對脂質(zhì)體包封率的影響 由圖3 可以看出，脂質(zhì)體包封率隨著卵磷脂與山楂葉總黃酮質(zhì)量比的改變而改變。當(dāng)質(zhì)量比為10:2 時，脂質(zhì)體包封率較高；質(zhì)量比為10:4 時，脂質(zhì)體包封率極低。因此，質(zhì)量比在（10:1）～（10:3）范圍內(nèi)較為適宜。

圖3 卵磷脂與山楂葉總黃酮質(zhì)量比對脂質(zhì)體包封率的影響

2.1.4 吐溫80 添加量占卵磷脂質(zhì)量比對脂質(zhì)體包封率的影響 實驗結(jié)果見圖4，吐溫80 添加量占卵磷脂質(zhì)量比會影響包封率大小。當(dāng)吐溫80 添加量為15%時，包封率最高，之后隨著添加量的增加，包封率降低。所以，吐溫80 添加量占卵磷脂質(zhì)量比宜控制在10%～20%范圍內(nèi)。

圖4 吐溫80 添加量占卵磷脂質(zhì)量百分比對脂質(zhì)體包封率的影響

2.1.5 PBS 的pH 對脂質(zhì)體包封率的影響 圖5 結(jié)果表明，PBS 的pH 對脂質(zhì)體包封率的影響較小。當(dāng)pH 為6.6時，脂質(zhì)體包封率最高，故選取pH 6.6進行實驗。

圖5 PBS 的pH 對脂質(zhì)體包封率的影響

2.1.6 超聲功率對脂質(zhì)體包封率的影響 從圖6 可知，超聲功率對包封率的影響呈先升后降趨勢。當(dāng)超聲功率為60%時，包封率最高，但散熱較多，且超聲過程中易產(chǎn)生泡沫。因此，綜合考慮選擇超聲功率為40%。

圖6 超聲功率對脂質(zhì)體包封率的影響

2.1.7 超聲時間對脂質(zhì)體包封率的影響 由圖7 結(jié)果可得，超聲時間對包封率的影響較小，包封率隨著超聲時間的增加出現(xiàn)下降趨勢。當(dāng)超聲時間為1 min 時包封率最高，故實驗選擇超聲時間為1 min。

圖7 超聲時間對脂質(zhì)體包封率的影響

2.2 正交優(yōu)化試驗 由以上結(jié)果可知，影響脂質(zhì)體包封率的因素較多，為優(yōu)化脂質(zhì)體的制備工藝，選取影響較大的因素，即卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比（A）、卵磷脂濃度（B）、卵磷脂與山楂葉總黃酮質(zhì)量比（C）、吐溫80 添加量占卵磷脂質(zhì)量比（D），做4 因素3 水平正交試驗。試驗方案及結(jié)果如表2、表3 所示。

表2 正交試驗方案及結(jié)果

表3 正交試驗方差分析

根據(jù)以上結(jié)果可知，各因素對包封率影響的先后順序為：吐溫80 添加量占卵磷脂質(zhì)量比＞卵磷脂與山楂葉總黃酮質(zhì)量比＞卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比＞卵磷脂濃度。 通過均值k 分析得出最佳制備條件為A3B3C1D1，即卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比5:1、卵磷脂濃度30 mg/mL、卵磷脂與山楂葉總黃酮質(zhì)量比10:1、吐溫80 添加量占卵磷脂質(zhì)量比10%。在此條件下制備3 批脂質(zhì)體，測定包封率分別為71.80%、75.69%、72.25%，平均為（73.25±2.13）%。

2.3 脂質(zhì)體理化性質(zhì)初步研究

2.3.1 外觀、粒徑、電位 根據(jù)最佳制備條件，制備山楂葉總黃酮脂質(zhì)體，由于黃酮類化合物本身特性，脂質(zhì)體呈淡黃色、均一的液體。粒徑如圖8 所示，粒徑為（132.2±2.85）nm。Zeta 電位如圖9 所示，脂質(zhì)體帶負電荷，電位為（-9.29±0.34）mV。

圖8 脂質(zhì)體粒徑分布

圖9 脂質(zhì)體Zeta 電位

2.3.2 透射電鏡（TEM）圖像 圖10為脂質(zhì)體×25 000倍的TEM 圖像，可見脂質(zhì)體為球形或橢球形，表面較光滑，分布均勻。

圖10 TEM 圖像（×25 000）

2.4 溫度對山楂葉總黃酮脂質(zhì)體的貯藏穩(wěn)定性的影響

2.4.1 外觀 外觀變化可直接評價脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，在4 ℃條件下，脂質(zhì)體外觀無明顯變化，無絮凝和沉淀產(chǎn)生。在25 ℃條件下，自14 d 開始出現(xiàn)少量絮凝和溶解，28 d 時顏色發(fā)生改變，絮凝和沉淀振蕩后溶解。

2.4.2 溫度對脂質(zhì)體包封率的影響 結(jié)果如圖11 所示，不同貯藏溫度可以導(dǎo)致脂質(zhì)體包封率的改變。隨著時間的延長，兩種貯藏溫度都可導(dǎo)致脂質(zhì)體包封率下降，在25 ℃條件下，脂質(zhì)體包封率下降較大，到28 d時，包封率僅為20%左右，而在4 ℃條件下包封率則在40% 以上。由此可見，脂質(zhì)體在4 ℃條件下貯藏更穩(wěn)定。

圖11 貯藏溫度對脂質(zhì)體包封率的影響

3 討論

藥食同源物質(zhì)是指某種膳食同時具備藥品和食品兩種屬性，許多保健類的食品都屬于該類物質(zhì)。發(fā)揮藥食同源作用，不僅可以弘揚中醫(yī)藥文化，促進中藥產(chǎn)業(yè)多元化，還可以服務(wù)于“健康中國”計劃[17]。郝曉蓓等[18]采用CiteSpace 對我國近10 年中醫(yī)食療研究熱點及趨勢進行了分析，發(fā)現(xiàn)主要集中于中醫(yī)食療的臨床療效、藥食同源、中西醫(yī)結(jié)合護理和慢性病的防治及推廣運用等。由此可見，中醫(yī)食療理念已深入人心并應(yīng)用于許多方面。山楂是一種藥食同源物質(zhì)，山楂果有健胃消食功效，山楂葉的應(yīng)用相對較少，本研究對其進行利用，避免了有益物質(zhì)的浪費。脂質(zhì)體是指活性物質(zhì)被類脂雙分子層包封而形成的閉合囊泡，結(jié)構(gòu)與細胞膜相似[19]，具有靶向性、長效性、生物相容性、低免疫原性等特點。脂質(zhì)體有多種制備方法，如薄膜分散法、乙醇注入法、逆向蒸發(fā)法、復(fù)乳法等。薄膜分散法操作簡單，耗時短，包封率較高,適用于脂溶性物質(zhì)的包封，超聲可以減小脂質(zhì)體的粒徑。包封率反映藥物被載體包封的程度，是脂質(zhì)體質(zhì)量評價的一個重要指標(biāo)，包封率越高，藥物被利用的程度越高[20]。張朋[21]通過薄膜分散-超聲法制備的魚油脂質(zhì)體平均包封率為71.21%；白彩萍等[22]通過該法制備格列本脲類脂質(zhì)體，包封率為82.50%；而陳玉菲等[23]采用薄膜分散法制備羥基積雪草苷脂質(zhì)體，包封率僅為（39.30±1.06）%。本研究采用薄膜分散-超聲法制備的脂質(zhì)體包封率為（73.25±2.13）%，處于較高水平，介于張朋[21]和白彩萍等[22]的研究之間，遠高于陳玉菲等[23]的研究。該方法簡單可行，提高了山楂葉總黃酮的包封率，山楂葉總黃酮的利用程度會有所提高，而包封率有所差異則可能與脂質(zhì)體包封的藥物不同有關(guān)。隨著貯藏時間的延長，被包封的藥物會有所泄露，包封率隨之下降，這與脂質(zhì)體的穩(wěn)定性有關(guān)。本研究將山楂葉總黃酮脂質(zhì)體分別在4 ℃、25 ℃條件下避光保存28 d，以外觀及包封率為指標(biāo)考察穩(wěn)定性，結(jié)果顯示在25 ℃條件下包封率下降較快，該結(jié)果與張朋等[21,24]研究結(jié)果一致，說明結(jié)果具有可靠性，脂質(zhì)體在4 ℃條件下穩(wěn)定性較好。

4 小結(jié)

本研究采用薄膜分散-超聲法將山楂葉總黃酮包封于脂質(zhì)體中，通過單因素及正交試驗得出最佳制備工藝，結(jié)果顯示在該條件下制備的脂質(zhì)體具有良好的理化性質(zhì)，在4 ℃條件下有較好的貯藏穩(wěn)定性。因此，該制備工藝具有一定的可行性，可為后期開發(fā)山楂葉總黃酮中醫(yī)食療相關(guān)產(chǎn)品提供較好的制劑基礎(chǔ)，該制劑能夠發(fā)揮黃酮類化合物的藥理作用，在高血糖、高血脂等人群中有一定的應(yīng)用前景，但開發(fā)食療產(chǎn)品尚需進行產(chǎn)品配方及動物、臨床相關(guān)試驗的研究。