袁佩穎，楊瀟劍,2，吳振威，榮倩倩，張 姝，任移嶸

（1.信陽(yáng)學(xué)院 理工學(xué)院,河南 信陽(yáng) 464000；2.信陽(yáng)學(xué)院 分析測(cè)試中心,河南 信陽(yáng) 464000）

信陽(yáng)毛尖是河南省信陽(yáng)市著名特產(chǎn)，屬于我國(guó)十大名茶，營(yíng)養(yǎng)豐富，富含茶多酚等多種營(yíng)養(yǎng)成分。相關(guān)研究表明，長(zhǎng)期飲用信陽(yáng)毛尖可以有效起到抗菌消炎、清除體內(nèi)自由基、降低人體膽固醇、抑制細(xì)胞癌變等作用。

據(jù)公開數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，截至2019年，信陽(yáng)市茶園面積14.25萬(wàn)hm，茶葉產(chǎn)量達(dá)7.2萬(wàn)t，預(yù)測(cè)到2022年茶葉產(chǎn)量達(dá)到8.2萬(wàn)t。根據(jù)相關(guān)研究及實(shí)際走訪，筆者發(fā)現(xiàn)在制茶過(guò)程中大約會(huì)產(chǎn)生35%的殘次品，一般為大葉、老葉、茶末和梗等。再加上市場(chǎng)對(duì)信陽(yáng)毛尖“一芽一葉”和“嫩芽”2種工藝的追捧，勢(shì)必會(huì)產(chǎn)生更多的殘次品，原材料浪費(fèi)嚴(yán)重。信陽(yáng)毛尖中的殘次品品相較差，茶湯苦澀偏黃，諸多加工作坊便以“口糧茶”的名義對(duì)外售賣，價(jià)格低廉，甚至是成品茶的百分之一，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值較低。由此可見，信陽(yáng)毛尖殘次品對(duì)深加工的需求更為強(qiáng)烈。因此，從信陽(yáng)毛尖茶殘次品中提取天然活性物質(zhì)便成為回收利用的有效途徑之一。

茶多酚是茶葉中重要的生物活性物質(zhì)和色香味的主要成分，是多酚類物質(zhì)的總稱，其含量占茶葉干質(zhì)量的10%～36%。茶多酚能夠控制自由基的產(chǎn)生、阻斷人體內(nèi)過(guò)氧化過(guò)程、抑制腫瘤生長(zhǎng)，以及降低紫外線對(duì)人體皮膚的傷害等。因此，茶多酚被廣泛應(yīng)用于食品、保健、醫(yī)療等領(lǐng)域，發(fā)展前景廣闊。經(jīng)相關(guān)研究，信陽(yáng)毛尖中茶多酚含量明顯高于六安瓜片和碧螺春等其他綠茶，與普洱生茶基本相同。同時(shí)，信陽(yáng)毛尖不同部位的茶多酚含量也不盡相同，茶多酚含量由高到低為第一葉（22.34%～26.39%）＞芽＞第二葉＞梗（15.07%～16.82%）。

當(dāng)前已有學(xué)者關(guān)注了茶葉殘次品中茶多酚、多糖、總黃酮等活性物質(zhì)的提取。例如，吳金松研究了信陽(yáng)毛尖茶末中多糖的分離純化以及其抗氧化活性；馮歡歡利用響應(yīng)面優(yōu)化機(jī)械化學(xué)法來(lái)提取茶末的總黃酮；蘭林等重點(diǎn)關(guān)注了竹葉青茶茶末中茶氨酸的提取工藝的優(yōu)化。目前，針對(duì)信陽(yáng)毛尖殘次品中茶多酚的相關(guān)研究還未見報(bào)道。

本研究選用信陽(yáng)毛尖殘次品為原料，利用超聲輔助溶劑萃取技術(shù)來(lái)提取茶多酚，并用響應(yīng)曲面法進(jìn)行優(yōu)化，之后對(duì)其清除強(qiáng)氧化性自由基的能力進(jìn)行了探究。該研究主要聚焦在信陽(yáng)毛尖殘次品中茶多酚的提取上，同時(shí)對(duì)信陽(yáng)毛尖中茶多酚的抗氧化性研究進(jìn)行了補(bǔ)充。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

信陽(yáng)毛尖茶殘次品（信陽(yáng)市羅山縣出產(chǎn)的非市售農(nóng)家茶）；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硫酸亞鐵、酒石酸鈉（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；無(wú)水乙醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；沒(méi)食子酸—水合物（分析純，上海笛柏生物科技有限公司）。

DHG-9240A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；KQ-500DE超聲波清洗器（昆山市舒美超聲儀器有限公司）；BSA124S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；TU-1901紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；GWB-1SUPER超純水機(jī)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 茶葉預(yù)處理 信陽(yáng)市羅山縣出產(chǎn)的非市售信陽(yáng)毛尖殘次品，其特點(diǎn)是葉大梗大。將茶葉散置于表面皿中，放入烘箱中80℃烘干12 h，去除多余水分，取出烘干的茶葉均勻放入粉碎機(jī)中，粉碎至粉末，并過(guò)40目篩，以便與溶劑接觸均勻，然后將粉末放入保鮮袋冷藏。

1.2.2 茶多酚的檢測(cè)及計(jì)算 根據(jù)鄧祥等對(duì)酒石酸亞鐵比色法和福林酚比色法進(jìn)行的對(duì)比研究，得出酒石酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線法相比福林酚比色法，具有更寬的線性范圍；同時(shí)，酒石酸亞鐵比色法測(cè)定茶葉提取物中茶多酚含量具有較高的可信度。因此，本試驗(yàn)中將使用酒石酸亞鐵比色法進(jìn)行茶多酚的測(cè)定。

離心后立即用移液器取提取后的上清液1 mL并稀釋25倍，吸取稀釋后的茶多酚提取液2 mL注入50 mL容量瓶中，加去離子水8 mL和酒石酸亞鐵溶液10 mL，充分混合均勻，再加pH值為7.5的磷酸緩沖液30 mL至刻度線。用空白溶液作參比，使用10 nm比色皿，在540 nm處測(cè)吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出茶多酚提取率。

1.2.3 單因素影響試驗(yàn)方法 取粉碎好的茶粉1.0 g于50 mL試管中，加入一定量的乙醇水溶液，然后在試管口蓋上保鮮膜，防止乙醇揮發(fā)，混勻后投入到超聲波清洗器中，接著在不同乙醇濃度、超聲時(shí)間、料液比的條件下開始進(jìn)行單因素超聲提取試驗(yàn)，分別考察其對(duì)茶多酚提取率的影響。

1.2.4 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)方法 通過(guò)3組單因素試驗(yàn)，以乙醇濃度（A）、超聲時(shí)間（B）、料液比（C）為響應(yīng)因子，分別以最高點(diǎn)作為編碼水平0，最高點(diǎn)的左邊作為編碼水平-1，最高點(diǎn)的右邊作為編碼水平1，并且以提取率為響應(yīng)值做響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)，最后采用Design Expert中的Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理來(lái)分析處理。

1.2.5 抗氧化性測(cè)試方法 取優(yōu)化后提取的茶多酚原溶液1 mL稀釋100倍，并配制相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)濃度的維生素C溶液，再分別取0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL稀釋后的溶液加入到6支比色管中，加水稀釋到5 mL，再加入5 mmol·L的水楊酸溶液和5 mmol·L的FeSO溶液各5 mL，混勻后加入5 mL的稀HO，在35℃下水浴反應(yīng)30 min，于510 nm處測(cè)其吸光度值記為，用蒸餾水代替水楊酸的吸光度記為，以蒸餾水代替茶多酚稀釋液的吸光度記為。按照下式計(jì)算茶多酚對(duì)·OH的清除率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)均重復(fù)3次，采用Origin 8.0軟件進(jìn)行圖表繪制，采用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度的影響 準(zhǔn)確稱取信陽(yáng)毛尖殘次品粉末1.0 g于50 mL試管中，采用料液比為1∶16 g·mL，超聲時(shí)間為30 min，乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%進(jìn)行試驗(yàn)。從圖1-A可以看出，在乙醇濃度在50%～70%時(shí)，提取率逐步上升；當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)，提取率達(dá)到最高值；乙醇濃度為70%～90%時(shí)，提取率開始下降。這表明提取率不會(huì)隨乙醇的濃度增加而一直增加。原因可能是乙醇濃度不斷增加會(huì)使脂溶性雜質(zhì)和色素等雜質(zhì)大量溶解出來(lái)，進(jìn)而影響茶多酚的溶出，使茶多酚提取率降低。因此，選擇乙醇濃度60%、70%、80%為響應(yīng)面優(yōu)化的3個(gè)水平。

2.1.2 超聲時(shí)間的影響 準(zhǔn)確稱取信陽(yáng)毛尖粉末1.0 g于50 mL試管中，采用料液比為1∶16 g·mL，乙醇濃度為70%，超聲時(shí)間分別設(shè)定為30、40、50、60、70 min進(jìn)行試驗(yàn)。從圖1-B可以看出，在30～50 min內(nèi)，隨著超聲時(shí)間的增加，提取率逐步上升；在50 min時(shí)，提取率上升到16.22%，達(dá)到最高；超過(guò)50 min后，提取率又開始下降。這表明提取率不會(huì)隨超聲時(shí)間的增加而一直增加。時(shí)間較短時(shí)，乙醇對(duì)信陽(yáng)毛尖茶粉溶解不夠充分，提取率偏低；但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，可能會(huì)引起超聲波的空化效應(yīng)和熱效應(yīng)，致使局部溫度過(guò)高，使得茶多酚氧化或分解，降低提取率。因此，選擇超聲時(shí)間40、50、60 min為響應(yīng)面優(yōu)化的3個(gè)水平。

2.1.3 液料比的影響 準(zhǔn)確稱取信陽(yáng)毛尖粉末1.0 g于50 mL試管中，采用超聲時(shí)間為50 min，乙醇濃度配制成70%，分別把料液比設(shè)定為1∶4、1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、1∶24 g·mL進(jìn)行試驗(yàn)。從圖1-C可以看出，在料液比為1∶8、1∶12、1∶16 g·mL時(shí)，茶多酚的提取率逐步上升，在料液比為1∶16 g·mL時(shí)，提取率上升到14.40%，隨后提取率開始下降。這表明茶多酚的提取率不會(huì)隨著乙醇體積的增加相應(yīng)增加。乙醇體積較小的原因可能是信陽(yáng)毛尖茶粉與溶劑接觸不充分，不利于茶多酚的提??；乙醇體積較大時(shí)，信陽(yáng)毛尖茶粉與溶劑充分接觸，但較多的溶劑會(huì)吸收一定量的超聲波轉(zhuǎn)化為熱能，這可能會(huì)降低了超聲波對(duì)細(xì)胞壁的破碎能力，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的茶多酚溶出減少，提取率下降；也有可能是茶多酚分子上的羥基與乙醇形成氫鍵作用，乙醇體積越大氫鍵作用逐漸增強(qiáng)，從而導(dǎo)致茶多酚的提取率降低。因此，選擇超聲時(shí)間1∶12、1∶16、1∶20 g·mL為響應(yīng)面優(yōu)化的3個(gè)水平。

圖1 3種因素對(duì)茶多酚提取含量的影響

2.2 響應(yīng)曲面法的優(yōu)化

2.2.1 試驗(yàn)結(jié)果分析 根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，列出響應(yīng)曲面法設(shè)計(jì)因素與水平如表1所示。通過(guò)Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)對(duì)單因素結(jié)果分析，得到17組試驗(yàn)，按照上述方法分別進(jìn)行這17組試驗(yàn)，并得出茶多酚提取率，結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)曲面法設(shè)計(jì)因素與水平

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到以茶多酚提取率（）為應(yīng)變量，以乙醇濃度（），超聲時(shí)間（）和料液比（）這3個(gè)單因素為自變量的編碼多元二次回歸方程如下所示，并對(duì)該回歸方程進(jìn)行方差分析。

由表3可知，=31.82，＜0.000 1，表示回歸方程極其顯著，=0.9761表示模型可信度高，模型擬合較好，=0.945 5表示單個(gè)變量占引起茶多酚提取率變化的94.55%。失擬項(xiàng)的=2.33，=0.2162（＞0.05），可見失擬項(xiàng)表現(xiàn)為不顯著，這表明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響比較小，該回歸方程模型能夠較為客觀地反映試驗(yàn)內(nèi)容，可以用于對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行替代分析。

同時(shí)由表3回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表明，模型一次項(xiàng)極顯著，不顯著；交互項(xiàng)顯著，不顯著，因此在本試驗(yàn)中對(duì)茶多酚提取率的影響因子的大小順序?yàn)椋阂掖紳舛纫蜃幼饔眯Ч@著，料液比因子作用效果次之，超聲時(shí)間因子作用效果最不顯著，即＞＞。同時(shí)，利用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件做出3D曲面圖，結(jié)果如圖2所示。

表3 回歸方程方差分析表

3D響應(yīng)曲面卷曲程度越明顯，則說(shuō)明2因素間交互作用越明顯，對(duì)提取率造成的影響越大，反之亦然。由圖2可知，乙醇濃度（）和料液比（）、超聲時(shí)間（）和料液比（）的曲面圖卷曲程度相對(duì)明顯，說(shuō)明乙醇濃度和料液比、超聲時(shí)間和料液比兩兩因素間有比較好的交互作用；而乙醇濃度（）和超聲時(shí)間（）的響應(yīng)曲面卷曲程度不是很明顯，說(shuō)明乙醇濃度和超聲時(shí)間這2個(gè)因素的交互作用對(duì)茶多酚的提取最不顯著，這與表3回歸方程方差分析結(jié)果一致。

圖2 交互作用曲面圖

2.2.2 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化 根據(jù)軟件預(yù)測(cè)得出的最佳條件和提取率即乙醇濃度配制為74.3%、超聲時(shí)間設(shè)定為48.2 min、料液比為1∶18.8 g·mL，此時(shí)提取率最高為19.47%。

為了驗(yàn)證這一結(jié)論可靠性，在得到的最優(yōu)條件下重復(fù)3次試驗(yàn)，得到平均提取率為19.34%，理論值比較偏差為0.13%，即模型預(yù)測(cè)的結(jié)果與實(shí)際實(shí)驗(yàn)的情況很符合，說(shuō)明此模型可行。

2.3 抗氧化性試驗(yàn)結(jié)果

·OH是氧化性極強(qiáng)的自由基，可以與細(xì)胞中的許多分子發(fā)生反應(yīng)，從而引起各種病變，引發(fā)疾病和衰老。由圖3可見，在茶多酚溶液0.5～2.5 mL的投加量范圍內(nèi)，即含量在51.45～308.7 μg范圍內(nèi)，隨著信陽(yáng)毛尖殘次品中提取的茶多酚溶液投加量的增加，其對(duì)·OH清除能力逐漸提升，基本呈線性關(guān)系，展示出非常好的量效對(duì)應(yīng)關(guān)系；在投加量達(dá)到2.5 mL，其對(duì)·OH清除率達(dá)到97.3%，當(dāng)投加量超過(guò)2.5 mL時(shí)，其對(duì)·OH清除能力基本不變，投加量在3 mL時(shí)，清除率為97.9%。由此可見，稀釋過(guò)后的茶多酚溶液在投加量為2.5 mL時(shí)，其清除·OH的能力已達(dá)到最優(yōu)，此時(shí)茶多酚含量為257.25 μg，根據(jù)清除率擬合曲線=(33.827+13.05)×100%（表示清除率，表示茶多酚溶液投加量，0.5≤≤2.5），得到信陽(yáng)毛尖殘次品茶多酚對(duì)羥基自由基的ID50為1.09 mL，即112.40 μg，維生素C清除羥基自由基的ID50為147.20 μg。由此可見，該型信陽(yáng)毛尖殘次品中茶多酚相對(duì)于維生素C而言，其對(duì)·OH清除能力更強(qiáng)。

圖3 茶多酚溶液投加量對(duì)·OH清除的影響

3 結(jié)論與討論

（1）使用響應(yīng)曲面法對(duì)超聲輔助下信陽(yáng)毛尖茶殘次品中茶多酚的提取進(jìn)行優(yōu)化，其在乙醇濃度為74.3%、超聲時(shí)間48.2 min、料液比為1∶18.8 g·mL的最佳工藝條件下所提取的茶多酚為19.34%。

（2）該提取率與其他研究得出的信陽(yáng)毛尖成品茶中茶多酚提取率（36.2%）還有不小的差距。究其原因，本試驗(yàn)采用的茶葉為信陽(yáng)毛尖中的殘次品，大葉、老葉和梗比較多，茶多酚含量相對(duì)較低，這一結(jié)果也與相關(guān)針對(duì)茶葉不同部位茶多酚含量的研究結(jié)果類似。

（3）抗氧化性試驗(yàn)結(jié)果表明，信陽(yáng)毛尖殘次品中的茶多酚具有較強(qiáng)的·OH清除能力，可應(yīng)用到食品保健等前述領(lǐng)域，發(fā)展前景廣闊。

（4）當(dāng)前，對(duì)信陽(yáng)毛尖茶殘次品的深入加工研究和應(yīng)用還是比較少的，使得次等茶葉原材料產(chǎn)生了極大浪費(fèi)，本試驗(yàn)采用的工藝流程簡(jiǎn)單，設(shè)備易得操作要求較低，為信陽(yáng)毛尖殘次品的回收利用提供解決問(wèn)題的路徑。

（5）同時(shí)本研究與其他科研人員所做的工作都是在為信陽(yáng)當(dāng)?shù)夭璁a(chǎn)業(yè)的發(fā)展找尋其他途徑，關(guān)注茶葉尤其是品級(jí)較低、量大的殘次品中各種天然活性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的深度加工利用，這對(duì)于發(fā)展本地食品、醫(yī)藥、保健等高端產(chǎn)業(yè)工業(yè)都是有非常大的促進(jìn)作用。