楊婭林，陸彥蓉，殷曉陽(yáng)，李華明，彭大鵬

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所，國(guó)家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070)

獸藥，尤其是抗微生物藥物，大量用于動(dòng)物疾病的治療、預(yù)防以及飼料添加劑，其殘留會(huì)影響人或動(dòng)物的健康，如出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)、耐藥性增強(qiáng)、生殖危害及癌癥等?？焖贆z測(cè)是保證食品安全，減少獸藥殘留的重要手段，儀器分析法[1]、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[2]是目前常用的檢測(cè)方式。儀器分析法的操作專業(yè)性、對(duì)使用場(chǎng)所的要求限制了其現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的發(fā)展，ELISA盡管具有現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，但繁瑣的操作過(guò)程，無(wú)法完成大規(guī)模食品篩選，且檢測(cè)結(jié)果易受到環(huán)境影響。免疫層析試紙主要由樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊及底板構(gòu)成，以標(biāo)記材料的特殊性質(zhì)作為檢測(cè)信號(hào)，檢測(cè)卡的使用形式不受限于場(chǎng)所、操作人員，具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高及成本低等優(yōu)勢(shì)，是實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、大量樣品篩選的重要方法。因此，文章以膠體金、量子點(diǎn)、磁性納米材料、時(shí)間分辨熒光微球作為綜述對(duì)象，對(duì)他們的優(yōu)缺點(diǎn)以及在獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行闡述，展望免疫層析試紙技術(shù)未來(lái)應(yīng)用趨勢(shì)，以期提供新的發(fā)展思路，保證食品安全。

1 基于膠體金納米材料的檢測(cè)方法

膠體金(Colloidal gold，CG)主要通過(guò)還原氯金酸制備而成，以靜電吸附方式與蛋白質(zhì)結(jié)合而不改變其生物特性，在硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane，NC膜)上與抗原發(fā)生特異性反應(yīng)后，膠體金聚集顯示紅色，最終通過(guò)對(duì)比檢測(cè)線間顏色深淺判定陰性、陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果(圖1)。

圖1 膠體金試紙檢測(cè)原理(A)、結(jié)果判定方法(B)Fig 1 Colloidal gold assay strip principle(A)、result reading method(B)

基于膠體金納米材料的免疫層析方法在獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域有著重要地位。在已發(fā)表的免疫層析相關(guān)文獻(xiàn)中，約有75%的標(biāo)記材料都是膠體金[3]。如表1所示，目前膠體金試紙的檢測(cè)范圍幾乎包括所有的抗微生物藥物種類，檢測(cè)樣品涉及到水產(chǎn)品、肉類、禽蛋、乳制品等動(dòng)物源性食品，以及尿液、血清等生物樣品，3～20 min可完成檢測(cè)，除此以外，膠體金試紙已實(shí)現(xiàn)多種藥物聯(lián)合檢測(cè)，可基本滿足大規(guī)模的食品篩選。

表1 膠體金免疫層析試紙的應(yīng)用Tab 1 Application of colloidal gold immunochromatographic assay strip

傳統(tǒng)的膠體金免疫層析試紙主要通過(guò)肉眼對(duì)比檢測(cè)線顏色深淺判定結(jié)果。這種判讀方式往往受檢測(cè)人員主觀意識(shí)影響，檢測(cè)結(jié)果差異大，檢測(cè)靈敏度有限。為提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性，研究人員將銀離子沉積在金粒子表面[15]，或?qū)⑶蛐谓鹆Ｗ痈淖優(yōu)楸谆ɑ蚣{米星形狀[16]，增強(qiáng)膠體金的視覺(jué)可見(jiàn)性，以此減小檢測(cè)誤差，檢測(cè)靈敏度可提高5～10倍以上。另一方面，研究者也開(kāi)發(fā)出光學(xué)檢測(cè)儀代替肉眼判讀，將C、T線的色密度轉(zhuǎn)化為光密度進(jìn)行處理，由于色密度信號(hào)僅來(lái)自于NC膜表面10 μm，其中約有90%的信號(hào)因光散射、折射等原因出現(xiàn)損失[17]，所以這種信號(hào)轉(zhuǎn)化后的結(jié)果準(zhǔn)確性尚有待提高。

2 基于磁性納米材料的檢測(cè)方法

磁性納米材料(Magnetite nanoparticles，MNPs)，是一類特殊的納米級(jí)氧化物，可以通過(guò)物理法、化學(xué)法、生物法等多種途徑合成，剛合成的磁性粒子經(jīng)過(guò)表面修飾后，可以增強(qiáng)粒子的物理、化學(xué)穩(wěn)定性，同時(shí)提供便于蛋白質(zhì)偶聯(lián)的官能團(tuán)。MNPs有著與膠體金相當(dāng)?shù)哪栁庀禂?shù)，標(biāo)記抗體后，與NC膜上的特異性抗原反應(yīng)顯示棕黃色。但如上所述，光學(xué)信號(hào)易產(chǎn)生損失，NC膜幾百微米的實(shí)際厚度，以及生物樣本中的有色成分，也會(huì)影響光學(xué)信號(hào)的獲取。磁信號(hào)則不會(huì)受到這些因素的影響，同時(shí)生物樣本幾乎無(wú)磁性，磁珠富集后的磁信號(hào)可被準(zhǔn)確測(cè)量，因此磁性試紙有著更高的準(zhǔn)確度、靈敏度。孫虹[18]使用MNPs作為標(biāo)記物檢測(cè)養(yǎng)殖用水、魚(yú)肉中的孔雀石綠殘留，25 min可獲得檢測(cè)結(jié)果，定量限為0.6、0.9 μg/L，與市售膠體金試紙經(jīng)檢測(cè)對(duì)比后，該磁性試紙具有更高的靈敏度。此外，磁性試紙?zhí)禺愋愿鼜?qiáng)，相比于傳統(tǒng)的儀器分析法，耗時(shí)更短且操作簡(jiǎn)單。Yan[19]在檢測(cè)呋喃唑酮分析物時(shí)，用MNPs分別標(biāo)記單克隆抗體、羊抗鼠抗體，利用兩種抗體的特異性結(jié)合，起到信號(hào)增強(qiáng)作用，檢測(cè)限低至0.044 μg/L，磁性試紙檢測(cè)靈敏度進(jìn)一步提高5～10倍。雖然MNPs的合成方法較多，卻依舊缺少成熟、穩(wěn)定的合成途徑，適用于免疫層析的MNPs較少，因此，在獸藥殘留檢測(cè)中很難看到磁性試紙，昂貴的進(jìn)口檢測(cè)儀器也是制約因素之一。

表2 磁性免疫層析試紙的應(yīng)用Tab 2 Application of magnetic immunochromatographic assay strip

MNPs經(jīng)修飾后仍能表現(xiàn)出優(yōu)異的磁性，只需外加磁場(chǎng)就可實(shí)現(xiàn)溶液中磁珠快速分離，對(duì)于其他納米材料，磁性特性使MNPs在免疫層析試紙上應(yīng)用更廣泛，例如檢測(cè)前的樣品處理。免疫層析試紙無(wú)法對(duì)待測(cè)物進(jìn)行精準(zhǔn)選擇，加之檢測(cè)形式簡(jiǎn)單，動(dòng)物樣品中的蛋白、脂肪等基質(zhì)易對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生干擾。MNPs經(jīng)蛋白質(zhì)修飾后，可與目標(biāo)分析物特異性結(jié)合，通過(guò)外加磁場(chǎng)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分析物的快速分離，合適洗脫后可得到高純度目標(biāo)分析物，被稱為磁分離技術(shù)(圖2)，利用該技術(shù)處理樣品可大幅減少有機(jī)溶劑使用，洗脫后的MNPs還可重復(fù)利用，具有環(huán)保、經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)，是磁性納米材料除標(biāo)記材料的特殊應(yīng)用。Zhang[25]使用該技術(shù)處理粗樣品，最終獲得高純度氯霉素類似物，整個(gè)過(guò)程簡(jiǎn)單、快速，可有效提高后續(xù)檢測(cè)準(zhǔn)確性。于是，研究者便將磁分離技術(shù)與膠體金試紙條結(jié)合(表2)，相比于傳統(tǒng)處理方式，這種結(jié)合模式，能有效提高膠體金試紙靈敏度10倍以上。

圖2 磁分離技術(shù)Fig 2 Magnetic separation technology

3 基于量子點(diǎn)的檢測(cè)方法

量子點(diǎn)(Quantum dots，QDs)是由Ⅱ-Ⅵ族元素、Ⅲ-Ⅴ族元素或Ⅳ-Ⅵ族元素組成，具有發(fā)光特性的一種半導(dǎo)體納米晶體，比羅丹明、熒光素等傳統(tǒng)熒光染料，吸收波長(zhǎng)更大，熒光強(qiáng)度更高，常使用以CdSe、CdS或CdTe為核心，ZnS或ZnSe鈍化后的核殼量子點(diǎn)作標(biāo)記材料。

Beloglazova[26]對(duì)牛奶樣本僅采用稀釋處理，檢測(cè)其中的慶大霉素殘留，對(duì)量子點(diǎn)試紙、膠體金試紙的檢測(cè)效果進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明，QDs檢測(cè)靈敏度比CG高5倍，量子點(diǎn)試紙假陽(yáng)性率、假陰性率分別為2.4%、2.1%，均低于膠體金試紙(4.3%、3.2%)。這是因?yàn)镼Ds與抗體共價(jià)連接，比靜電吸附作用更加牢固，因此，抗干擾能力更強(qiáng)，且熒光信號(hào)較光學(xué)信號(hào)更易區(qū)分陽(yáng)性、陰性結(jié)果，借助熒光信號(hào)檢測(cè)儀器，可以獲得更低檢測(cè)限。

Taranova[27]使用525 nm(綠色)、585 nm(黃色)、625 nm(紅色)三種不同顏色的QDs作檢測(cè)信號(hào)，檢測(cè)牛奶中氧氟沙星、氯霉素、鏈霉素三種藥物殘留，檢測(cè)限分別為0.3、0.12、0.2 μg/mL，檢測(cè)誤差低于8%，10 min就能完成三種藥物檢測(cè)，因檢測(cè)過(guò)程中，熒光顏色的變化形似紅綠燈，又被稱為“紅綠燈”信號(hào)試紙(圖3)。QDs可以通過(guò)改變其合成成分、粒徑，在相同波長(zhǎng)激發(fā)時(shí)表現(xiàn)多色熒光，這一特性讓QDs在多種藥物同時(shí)檢測(cè)中，仍能保持良好區(qū)分性，為不同藥物的準(zhǔn)確定量提供了保證。

圖3 多色熒光試紙(A)、鏈霉素陽(yáng)性(B)、氧氟沙星和氯霉素陽(yáng)性(C)Fig 3 Multicolor fluorescence assay paper(A)、Streptomycinpositive(B)、Ofloxacin and Chloramphenicol positive(C)

如表3所示，量子點(diǎn)試紙已應(yīng)用于肉類、奶制品及生物樣品的檢測(cè)，在萊克多巴胺，以及鏈霉素、四環(huán)素、青霉素聯(lián)合檢測(cè)中，檢測(cè)限低至ng量級(jí)。盡管如此，研究者發(fā)現(xiàn)某些蛋白質(zhì)或溶劑分子會(huì)使QDs熒光強(qiáng)度下降或淬滅，于是研究者將大量QDs包裹在聚苯乙烯、二氧化硅等納米微球內(nèi)，以增強(qiáng)QDs熒光穩(wěn)定性。同時(shí)，納米微球包裹技術(shù)可以一定程度上隔絕Cd元素，避免生物毒性。InP、CuInS2、Ag2S等無(wú)鎘量子點(diǎn)，因無(wú)毒、環(huán)保優(yōu)勢(shì)逐漸成為研究熱點(diǎn)，Beloglazova[28]首次成功制備InP/ZnS無(wú)鎘量子點(diǎn)試紙，可以靈敏檢測(cè)兩種霉菌毒素，方法簡(jiǎn)單且經(jīng)濟(jì)高效，但因無(wú)鎘量子點(diǎn)制備困難，因此未在獸藥殘留檢測(cè)廣泛應(yīng)用。

表3 量子點(diǎn)免疫層析試紙的應(yīng)用Tab 3 Application of quantum dot immunochromatographic assay strip

4 基于時(shí)間分辨熒光微球的檢測(cè)方法

時(shí)間分辨熒光微球(Time-resolved fluorescence microsphere，TRFM)，是將鑭系元素絡(luò)合物封裝在聚苯乙烯，或二氧化硅納米微球中的一種新型微球，可以提供穩(wěn)定、高強(qiáng)度的熒光信號(hào)，常用Eu(Ⅲ)系熒光微球。TRFM具有更大的Stokes位移，熒光穿透力、抗干擾能力更強(qiáng)，不易出現(xiàn)熒光淬滅現(xiàn)象，與非特異性熒光背景區(qū)分性好，幾乎無(wú)生物毒性。

如表4所示，Li[35]首次構(gòu)建Eu(Ⅲ)元素時(shí)間分辨熒光試紙，檢測(cè)地塞米松殘留，牛奶、豬肉的定量限分別為0.003 μg/L、0.062 μg/kg，10 min可完成檢測(cè)。Wang[36]制備的TRFM試紙，氯丙嗪檢測(cè)限為0.32 μg/kg，線性范圍更寬(0.46～10.0 μg/kg)，線性關(guān)系較好(R2=0.991)，樣品預(yù)處理后，6 min內(nèi)就可完成檢測(cè)。可見(jiàn)，TRFM具有較高的檢測(cè)靈敏度，能夠?qū)ΛF藥殘留檢測(cè)進(jìn)行定量檢測(cè)。

表4 時(shí)間分辨熒光微球免疫層析試紙的應(yīng)用Tab 4 Application of time-resolved fluorescent microsphereimmunochromatographic assay strip

Hu[29]首次對(duì)TRFM、乳膠微球、QDs、CG的靈敏度及標(biāo)記消耗量進(jìn)行系統(tǒng)比較。同比于量子點(diǎn)試紙，時(shí)間分辨熒光試紙靈敏度提高3～4倍，為7.2 ng/L。乳膠微球、QDs和CG抗體標(biāo)記量分別是0.02、0.054和 0.15 μg， TRFM抗體標(biāo)記量?jī)H為0.005 μg。時(shí)間分辨熒光試紙T線包被抗原濃度0.4 mg/mL，其余三種試紙T線包被抗原濃度0.8 mg/mL。同時(shí)，時(shí)間分辨熒光試紙檢測(cè)范圍最大，檢測(cè)時(shí)間最短，準(zhǔn)確度最高，檢測(cè)結(jié)果與LC-MS/MS、商品化ELISA試劑盒一致。

綜上所述，時(shí)間分辨熒光試紙靈敏度更高、檢測(cè)范圍更大、抗原抗體消耗更少，能夠?yàn)楂F藥殘留檢測(cè)提供新型、高效、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方式。目前，時(shí)間分辨熒光試紙?jiān)讷F藥殘留檢測(cè)的應(yīng)用處于起步階段，這是因?yàn)門(mén)RFM的生產(chǎn)技術(shù)不成熟，仍需依賴商品化微球，而商品化微球還存在分散性、熒光強(qiáng)度不穩(wěn)定現(xiàn)象。

5 展 望

綜上，每種納米材料的優(yōu)缺點(diǎn)如表5所示。納米材料為免疫層析試紙?zhí)峁┝颂厥鈾z測(cè)信號(hào)，大幅提高免疫層析試紙檢測(cè)靈敏度，并實(shí)現(xiàn)定量分析，其中MNPs因特有的磁性特性，為免疫層析試紙?zhí)峁┬碌臉悠诽幚矸绞?，以保證結(jié)果準(zhǔn)確性。

表5 納米材料特點(diǎn)Tab 5 Characteristics of Nanomaterials

基于此，為應(yīng)對(duì)動(dòng)物食品中多種藥物及其代謝物殘留現(xiàn)狀，免疫層析試紙還應(yīng)具備多重分析功能，經(jīng)總結(jié)多重分析試紙主要有以下幾種應(yīng)用趨勢(shì)：

5.1 多檢測(cè)線試紙 多檢測(cè)線是指增加檢測(cè)線數(shù)量，在一條試紙上檢測(cè)不同藥物(圖4A)。為防止檢測(cè)線互相干擾，需要靈敏度、特異性更強(qiáng)的抗體，由于免疫探針在流動(dòng)過(guò)程中，易出現(xiàn)稀釋、反應(yīng)緩慢等現(xiàn)象，進(jìn)而會(huì)影響藥物檢測(cè)靈敏度，因此，待測(cè)物至檢測(cè)線距離應(yīng)著重考慮。

5.2 多通道檢測(cè) 多通道檢測(cè)是將檢測(cè)同種、不同種藥物的試紙條，組裝在一個(gè)檢測(cè)平臺(tái)的檢測(cè)方式，每一條試紙擁有單獨(dú)加樣槽、閱讀窗，可根據(jù)檢測(cè)需求，增減平臺(tái)試紙數(shù)量，是當(dāng)前商品化多重分析試紙的主要檢測(cè)方式(圖4B)。

5.3 矩陣檢測(cè) 相同區(qū)域下，點(diǎn)狀在數(shù)量上更具優(yōu)勢(shì)，將線性檢測(cè)線用點(diǎn)陣代替，可極大增加檢測(cè)數(shù)量，抗原包被數(shù)量可達(dá)32種(圖4C)。目前，矩陣檢測(cè)試紙已在傳染病診斷、病原體檢測(cè)中應(yīng)用，但由于檢測(cè)區(qū)域縮小，易受液體流速不均等外界因素干擾，尚無(wú)法保證結(jié)果準(zhǔn)確性，在獸藥殘留檢測(cè)中應(yīng)用較少。

圖4 多檢測(cè)線試紙(A)、多通道檢測(cè)(B)、矩陣檢測(cè)(C)Fig 4 Multi-detection line assay paper(A)、Multi-channeldetection(B)、Matrix detection(C)

定量分析是保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的重要手段。MNPs、QDs和TRFM的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了數(shù)據(jù)化處理、存儲(chǔ)和運(yùn)輸，結(jié)果準(zhǔn)確性大大提高。2010-2019年間，免疫層析試紙?jiān)谑称钒踩械膽?yīng)用量快速增長(zhǎng)。其中，傳統(tǒng)比色法試紙使用量減少，定量分析試紙使用量增多且呈幾倍增長(zhǎng)，這得益于信號(hào)檢測(cè)儀器的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用，為滿足現(xiàn)場(chǎng)快檢需求，這些檢測(cè)儀器逐漸趨向于小型化、便攜化。大眾食品安全意識(shí)的提高，將帶來(lái)家庭檢測(cè)需求，智能手機(jī)的普及與發(fā)展，將促進(jìn)家庭化、智能化、大眾化的新型閱讀方式形成，不斷推動(dòng)獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)發(fā)展。