熊海鳳，吳漢文，黃學(xué)婷，李 明，周 倩，崔雅倩，祁克宗，劉紅梅

(獸醫(yī)病理生物學(xué)與疫病防控安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽省動(dòng)物性食品質(zhì)量與生物安全工程實(shí)驗(yàn)室，安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036)

嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus-2，SARS-CoV-2）引發(fā)的2019 年冠狀病毒?。╟oronavirus disease 2019，COVID-19）已蔓延至全世界，升級(jí)為國(guó)際重大的公共衛(wèi)生事件。在COVID-19 疫情下，人與動(dòng)物的安全受到極大威脅。據(jù)報(bào)道，目前已從貓、雪貂、狗、水貂、金倉(cāng)鼠、恒河猴、老虎和獅子等動(dòng)物檢測(cè)到SARS-CoV-2 核酸陽(yáng)性[1-2]。對(duì)寵物犬來(lái)說(shuō)，雖然其對(duì)SARS-CoV-2 的易感性較貓和雪貂低，且有部分犬能產(chǎn)生中和抗體[3]，但作為潛在病毒攜帶者對(duì)SARS-CoV-2的傳播還存在不確定性[4]，因此，尋找有效防治犬感染SARS-CoV-2 的相關(guān)制劑迫在眉睫。

哺乳動(dòng)物呼吸系統(tǒng)主要分泌4 種肺表面活性蛋白(lung surfactant protein，SP)即SP-A，B，C，D，其中SP-A、SP-D 為親水性糖蛋白，以SP-A 含量最高，具有抗感染和免疫調(diào)節(jié)雙重作用[5]。有報(bào)道機(jī)體在某些疾病狀態(tài)下SP-A 和SP-D 的水平降低，如嚴(yán)重急性呼吸綜合征，可能會(huì)增加病原感染風(fēng)險(xiǎn)和導(dǎo)致疾病惡化[6]。最近，人源SP-D 被多個(gè)文獻(xiàn)證明可以結(jié)合高度糖基化的SARS-CoV-2 刺突 (S) 蛋白[7-8]，SP-D 中和SARS-CoV-2 的效應(yīng)提示SP-A 和SP-D 可能在 COVID-19 中的潛在治療前景。

目前，關(guān)于犬SP-A (canine lung surfactant protein A, cSP-A)的基因結(jié)構(gòu)與功能的研究鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)RT-PCT 方法克隆cSP-A基因并測(cè)序，分析其基因序列特征，進(jìn)而利用昆蟲(chóng)桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)cSP-A 蛋白，為進(jìn)一步鑒定cSP-A 功能以及評(píng)估應(yīng)用其蛋白防治SARS-CoV-2 奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及菌株

Sf9 細(xì)胞、pFastBac1 轉(zhuǎn)移載體由上海獸醫(yī)研究所陳鴻軍研究員惠贈(zèng)，DH10Bac、DH5α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

質(zhì)粒DNA 小量提取試劑盒、小鼠抗His 單克隆抗體購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司，Bacmid DNA 提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA 公司，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG 購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司，Trizol，HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG 購(gòu)自上海雅酶生物科技有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

參照 GenBank 公布的cSP-A的基因序列（GenBank: M11769.1），設(shè)計(jì)相關(guān)引物見(jiàn)表1，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成（下劃線部分為酶切位點(diǎn)，斜體部分為引入的6×His 序列）。

表1 合成的引物序列Table 1 Synthesized primer sequences

1.4 cSP-A 基因的克隆及序列分析

采用Trizol 法提取犬肺臟組織RNA，隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用引物P1/P2 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)；完全延伸72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后膠回收純化。純化產(chǎn)物再連接至pMD-18T載體并轉(zhuǎn)化至JM109 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取白色單菌落進(jìn)行菌液PCR 鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒送上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序，鑒定正確的陽(yáng)性質(zhì)粒命為pMD18T-cSP-A。使用DNAMAN 軟件將cSP-A序列與豬 (sus scrofa) SP-A、牛 (bovine)SP-A、小鼠 (mouse) SP-A、大鼠 (rat) SP-A、 綿羊(ovine) SP-A、人 (human) SP-A1、雞（chicken）SP-A、鵝（goose）SP-A 的序列進(jìn)行多重比對(duì)。

1.5 重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建

以陽(yáng)性克隆pMD18T-cSP-A為模板，使用引物P3/P4 擴(kuò)增cSP-A基因，在3’端引入的6×His 序列，5’端和3’端分別引入BamH I、Xhol 酶切位點(diǎn)。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 30 s，退火57 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)；完全延伸72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后膠回收純化。純化產(chǎn)物再經(jīng)BamH I、Xhol 雙酶切后連接至pFastBac1 轉(zhuǎn)移載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取白色單菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定, 陽(yáng)性質(zhì)粒送上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序，鑒定正確的陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pFastBac1-cSP-A。

1.6 重組桿粒的構(gòu)建

取5 μL 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac1-cSP-A轉(zhuǎn)化至DH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有卡那霉素（50 μg·mL-1）、 慶大霉素（10 μg ·mL-1）、四環(huán)素（7 μg·mL-1）及含有IPTG（40 μg·mL-1）和X-gal（20%）的LB 平板并于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，經(jīng)三輪藍(lán)白斑篩選后分別挑取白色單菌落及藍(lán)色單菌落（野生型Bacmid）使用通用引物M13 進(jìn)行菌液PCR 鑒定，鑒定正確的陽(yáng)性桿粒命名為Bacmid-cSP-A，野生型Bacmid 桿粒命名為Bacmid-N。

1.7 重組桿狀病毒的擴(kuò)增及拯救

提前一天取生長(zhǎng)狀況良好且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的sf9 細(xì)胞鋪于六孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至80%左右開(kāi)始轉(zhuǎn)染。使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，按試劑盒說(shuō)明書(shū)將Bacmid-cSP-A、Bacmid-N 轉(zhuǎn)入sf9 細(xì)胞，28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24 h 后每天觀察細(xì)胞病變，待細(xì)胞變圓、胞核變大且大部分細(xì)胞開(kāi)始脫落即可收取培養(yǎng)基上清，即為P1 代重組桿狀病毒，命名為rBv-cSP-A，P1 代野生型桿狀病毒命名為rBv-N，并于4 ℃避光保存。取200 用μL P1 代病毒液按照OMEGA 病毒DNA 提取試劑盒提取病毒DNA 進(jìn)行PCR 鑒定。鑒定無(wú)誤后，取適量P1 代病毒感染sf9細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變后收集培養(yǎng)基上清，此為P2 代病毒，按照此方法繼續(xù)盲傳至P4 代病毒。

1.8 重組蛋白的鑒定

1.8.1 IFA 取P4 代重組桿狀病毒感染72 h 后的sf9 細(xì)胞進(jìn)行IFA 鑒定，以野生型桿狀病毒感染的sf9 細(xì)胞作為陰性對(duì)照。吸棄培養(yǎng)基上清，加入預(yù)冷的4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBST 洗滌；加入0.2% Trion×100 室溫透化10 min，PBST 洗滌；加入含2%BSA 的PBST 37 ℃封閉1h，PBST 洗滌；加入6×His tag 鼠源單克隆抗體作為一抗37 ℃孵育1 h，PBST 洗滌；加入FITC 標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗37 ℃孵育1 h，PBST 洗滌，于熒光倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.8.2 Western Blot 取P4 代重組桿狀病毒感染72 h 后的sf9 細(xì)胞進(jìn)行Western Blot 鑒定，同時(shí)以野生型桿狀病毒感染的sf9 細(xì)胞作為陰性對(duì)照。細(xì)胞沉淀中加入RIPA 裂解液于冰上裂解10 min，分別向細(xì)胞裂解上清、細(xì)胞裂解沉淀中加入5×SDS PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水煮10 min 后進(jìn)行Western Blot鑒定，以6×His tag 鼠源單克隆抗體作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 作為二抗。

2 結(jié)果與分析

2.1 cSP-A 基因的克隆及序列比較

以犬肺組織cDNA 為模板，P1/P2 為引物PCR 擴(kuò)增cSP-A基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖1，可見(jiàn)699 bp 處單一的目的條帶。目的基因經(jīng)膠回收純化后克隆至pMD-18T 載體，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定正確，陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pMD18T- cSP-A。

圖1 cSP-A 基因的RT- PCR 擴(kuò)增結(jié)果Figure 1 RT-PCR amplification results of cSP-A gene

分析cSP-A 肽鏈從N-端至C-端包含4 個(gè)結(jié)構(gòu)域：10 個(gè)氨基酸殘基組成的 N-末端區(qū)域；富含羥脯氨酸，由24 個(gè)Gly-Xaa-Yaa 重復(fù)序列組成的膠原區(qū)( collagen-like domain, CLR）；28 個(gè)氨基酸殘基組成的頸部區(qū)域；以及C 末端碳水化合物識(shí)別結(jié)域(carbohydrate binding domain, CRD)。與人SP-A1 相比，cSP-A 在N 端結(jié)構(gòu)域存在1 個(gè)獨(dú)有的N-糖基化位點(diǎn)；而在C 端結(jié)構(gòu)域，兩者均存在1 個(gè)糖基化位點(diǎn)和9 個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)，而且位置也完全一致，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 犬SP-A 和人SP-A1 肽鏈結(jié)構(gòu)Figure 2 Peptide structure of canine SP-A and human SP-A1

使用DNAMAN 軟件將cSP-A 與來(lái)自雞、豬、鵝、人、小鼠、大鼠、綿羊及牛SP-A 的CRD 區(qū)氨基酸序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：CRD 序列全長(zhǎng)為120 aa，不同種屬間同源性為49.1%～95.5%，其中cSP-A與人SP-A1 同源性為75.5%；不同物種間CRD 區(qū)共有 41 個(gè)位置的氨基酸殘基完全保守，且在C-端附近都含有一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，但鵝和雞除外，它們各自存在一個(gè)額外的N-糖基化位點(diǎn)；大多數(shù)物種SP-A 與Ca2+結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)的殘基在CRD 序列中存在高度保守的WND (Trp-Asn-Asp)基序，但有2 個(gè)種屬例外，其中犬為“WNN”，雞為“WKD”，結(jié)果如圖3。

圖3 不同物種SP-A CRD 區(qū)氨基酸序列比對(duì)圖Figure 3 Amino acid sequences alignment of SP-A CRD region in different species

2.2 重組轉(zhuǎn)移載體的鑒定

以pMD18T-cSP-A為模板，使用引物P3/P4 擴(kuò)增cSP-A基因，結(jié)果如圖3，可見(jiàn)729 bp（含BamH I-Xhol 酶切位點(diǎn)及6×His 標(biāo)簽）處單一的目的條帶。PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后連接至pFastBac1 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，pFastBac1-cSP-A經(jīng)BamH I、Xhol 雙酶切鑒定。結(jié)果如圖4，可見(jiàn)約4 775 bp 處的載體條帶及729 bp 的目的片段，同時(shí)測(cè)序結(jié)果與cSP-A基因序列完全一致，表明重組轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建成功。

圖4 重組轉(zhuǎn)移載體pFastbac1- cSP-A 的鑒定Figure 4 Identification of the recombinant transfer vector pFastbac1- cSP-A

2.3 Bacmid-cSP-A 重組桿粒的鑒定

將構(gòu)建成功的 pFastBac1-cSP-A轉(zhuǎn)化至DH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)三輪藍(lán)白斑篩選后分別挑取白色單菌落及藍(lán)色單菌落，使用通用引物M13菌液PCR擴(kuò)增。陽(yáng)性重組桿粒擴(kuò)增條帶大小為2 300 bp+目的基因片段大小，野生型桿粒為300 bp。結(jié)果（圖5）顯示，陽(yáng)性Bacmid-cSP-A可擴(kuò)增出約 3 029 bp 條帶且條帶單一，野生型Bacmid-N 擴(kuò)增出300 bp 條帶，表明成功獲得含cSP-A基因的重組桿粒且無(wú)野生型Bacmid 污染。

圖5 Bacmid-cSP-A 重組桿粒的鑒定Figure 5 Identification of Bacmid-cSP-A recombinant Bacmid

2.4 重組蛋白的鑒定

2.4.1 IFA 鑒定 取P4 代rBv-cSP-A病毒感染72 h后的sf9 細(xì)胞進(jìn)行IFA 鑒定。結(jié)果（圖6）顯示，rBv-cSP-A感染的sf9 細(xì)胞發(fā)出明亮的綠色熒光，而野生型病毒感染的sf9 細(xì)胞無(wú)可見(jiàn)的綠色熒光，表明重組cSP-A 蛋白在sf9 細(xì)胞中成功表達(dá)。

圖6 重組桿狀病毒rBv-cSP-A 的 IFA 鑒定Figure 6 IFA identification of recombinant baculovirus rBv-cSP-A

2.4.2 Western Blot 鑒定 取P4 代rBv-cSP-A病毒感染72 h 后的sf9 細(xì)胞破碎上清和沉淀進(jìn)行Western Blot 鑒定。結(jié)果（圖7）顯示，rBv-cSP-A感染的sf9細(xì)胞破碎沉淀樣品在約31.84 kDa 處有單一的特異性條帶，而野生型病毒感染的sf9 細(xì)胞樣品無(wú)條帶，表明重組cSP-A 蛋白表達(dá)在sf9 細(xì)胞的沉淀中，沒(méi)有分泌到胞外。

圖7 cSP-A 基因表達(dá)產(chǎn)物的Western Blot 鑒定Figure 7 Western Blot identification of cSP-A gene expression product

3 討論

SP-A 和SP-D 主要通過(guò)抗病原微生物感染以及免疫調(diào)節(jié)的雙重功能來(lái)發(fā)揮肺部的先天免疫作用[5]。文獻(xiàn)報(bào)道SP-A 和SP-D 可以中和多種病毒，包括甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人類免疫缺陷病毒等[9-12]，近兩年由于受新冠疫情的影響，SP-A 和SP-D因其抗病毒作用再次成為人們關(guān)注的重點(diǎn)[5]。據(jù)報(bào)道感染SARS-CoV-2 的重癥患者血清SP-A 和SP-D 含量升高[13]，在體外人源重組SP-D 可以與冠狀病毒表面的S 蛋白結(jié)合，是抑制SARS-CoV-2 感染的潛在治療制劑[7-8]，但犬源SP-A 是否可以抗SARS-CoV-2感染還是未知。

分析cSP-A 基因序列，發(fā)現(xiàn)cSP-A 與人SP-A1在肽鏈結(jié)構(gòu)、N-糖基化修飾、鈣離子結(jié)合位點(diǎn)等方面都高度相似，但有3 處有趣的差異。首先，cSP-A的N-末端區(qū)域存在一個(gè)獨(dú)有的N-糖基化位點(diǎn)，cSP-A 的N-糖基化修飾是否有助于其識(shí)別微生物糖基，進(jìn)而增強(qiáng)其抗病原的功能還需要試驗(yàn)加以驗(yàn)證。其次，位于CLR 的一個(gè)離散的扭結(jié)肽序列，在人中為PCPP[14]，嚙齒類動(dòng)物為MGLP[15]，而犬為PGHP。該扭結(jié)肽具有構(gòu)象靈活性，有助于更高階SP-A 低聚物的形成以及CRD 結(jié)構(gòu)域在空間上的分離[15-17]，這一序列在不同物種間的差異可能是基因進(jìn)化的結(jié)果。最后，大多數(shù)物種（包括人）在CRD 區(qū)存在特征性基序—WND (Trp-Asn-Asp)，而犬為WNN(Trp-Asn-Asn)，雖然天冬氨酸殘基（Asp）和天冬酰胺殘基（Asn）都是脂肪族氨基酸，但單個(gè)氨基酸的改變有何意義還值得進(jìn)一步研究。

天然SP-A 在體內(nèi)主要以十八聚體形式存在，由6 個(gè)三聚體亞基組成，形成花束狀結(jié)構(gòu)[18]，SP-A與細(xì)胞外配體的結(jié)合依賴于頸區(qū)-CRD 三聚體和SP-A 十八聚體的高親和性多價(jià)結(jié)合[19]，因此，如何使表達(dá)的重組蛋白形成多聚體結(jié)構(gòu)對(duì)于其后續(xù)的功能研究顯得尤為重要。由于昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有外源蛋白表達(dá)量高，同時(shí)兼具糖基化及磷酸化修飾且表達(dá)的外源蛋白接近其天然結(jié)構(gòu)等多種優(yōu)點(diǎn)，故本試驗(yàn)采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組cSP-A 蛋白，但試驗(yàn)結(jié)果表明盡管重組cSP-A 蛋白取得了較高水平的表達(dá)，但主要為細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，未能分泌到胞外，進(jìn)而影響了后續(xù)的功能驗(yàn)證。

今后的研究中，一方面通過(guò)添加Gp64 信號(hào)肽促進(jìn)cSP-A 蛋白的分泌表達(dá)，另一方面嘗試在N 端加入柔性肽序列從而將兩個(gè)cSP-A 基因進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)，促進(jìn)多聚體的形成，以期得到具有高親和力的重組cSP-A 蛋白。