王林青 ，徐朋麗，陳曦艋，李洪炫，陳紅英*，趙 麗

(1. 鄭州師范學(xué)院分子生物學(xué)鄭州市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450044；2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，鄭州 450046；3. 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院，鄭州 450046)

程序性死亡分子1(programmed death 1， PD-1)由日本京都大學(xué)的Honjo 及其同事于1992 年發(fā)現(xiàn)[1]。PD-1 是主要表達(dá)于活化的T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞以及間充質(zhì)干細(xì)胞的一個(gè)重要的免疫抑制受體[2]，PD-1 屬于I 型跨膜糖蛋白，含有IgV 樣結(jié)構(gòu)域[3]。由于PD-1 膜近端無半胱氨酸殘基，故不能形成二聚體，因此只能以單體形式出現(xiàn)在細(xì)胞表面[4]。

PD-1 的配體為PD-L1 和PD-L2[5-6]。研究表明PD-1 的表達(dá)與病毒的持續(xù)感染相關(guān)，一項(xiàng)感染慢性淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒的小鼠試驗(yàn)表明，PD-1的高表達(dá)與病毒特異性T 細(xì)胞功能障礙有關(guān)[3]，同樣的現(xiàn)象也出現(xiàn)在人類持續(xù)感染HIV[7]和HCV[8]中。 PD-1與其配體PD-L1結(jié)合可下調(diào)CD4+和CD8+細(xì)胞的免疫活性[9]，減少IL-2 和IFN-γ 的分泌。當(dāng)阻斷PD-1/PD-L1 通路后，效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量增加，功能加強(qiáng)[10]。研究表明PD-1/PD-L1 通路的阻斷是一種治療持續(xù)性病毒感染的有效方法[11]。

近年來，細(xì)菌、寄生蟲等病原體尤其是病毒的感染，使全球豬業(yè)遭受了難以估量的經(jīng)濟(jì)損失。有些病毒也可以引起豬發(fā)生持續(xù)性感染，但調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）是危害豬群健康的4 種最主要病毒性傳染病原之一。PCV2 感染可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)，減緩豬群的生長速度，飼料產(chǎn)出比下降，養(yǎng)殖成本增加；而且破壞豬體免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致免疫功能減弱；嚴(yán)重消耗機(jī)體淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致免疫細(xì)胞數(shù)量減少；并出現(xiàn)免疫抑制，極易引起繼發(fā)其他病原感染并增加其死亡率[12]。預(yù)防和控制豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病的常見措施主要有疫苗接種以及通過改進(jìn)管理控制合并感染等。由于宿主素、外源因素及病毒自身因素等多種不同影響PCV2 的感染與復(fù)制，迄今臨床上缺乏有效的抗病毒治療措施來控制感染。

本研究首先從健康豬舌組織中克隆PD-1全基因，并表達(dá)了該P(yáng)D-1 胞外段蛋白（exPD-1）和制備exPD-1 抗血清，探究其對(duì)PCV2 體外在PK-15細(xì)胞上增殖的影響，以期為研究PCV2 的致病機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織、細(xì)胞、菌種、質(zhì)粒及試驗(yàn)動(dòng)物

健康豬舌組織和PK-15 細(xì)胞由鄭州市豬重大疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH-5α 和Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自博邁德生物技術(shù)有限公司；克隆載體pMD18-T 及原核表達(dá)載體pET-28a 購自TaKaRa 公司。新西蘭兔購自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑

Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、HiScript II1stStrand cDNA Synthesis Kit 購自南京諾唯贊生物科技有限公司；DNA Marker 2000、DNA Marker 5000、柱式動(dòng)物組織總RNA 和DNA 抽提試劑盒購自上海生物工程股份有限公司；低分子量蛋白質(zhì)Marker、Quick CutTMEcoR I、Quick CutTMSalI及SYBR? PremixExTaq? II (Tli RNaseH Plus)等購自寶生物工程(大連)有限公司；DAB 顯色試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒購自武漢博士德生物公司；鼠源6×His 單克隆抗體（MAb）、HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 購自武漢三鷹生物公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

參照GenBank 登錄的PD-1基因(NM_001204379)和PCV2基因(AY035820)序列，利用軟件Primer premier 6.0 設(shè)計(jì)了5 對(duì)特異性引物（表1）：引物P1/2和P3/4 分別用于擴(kuò)增PD-1全基因及其胞外域（上、下游引物中分別含有EcoR I 和SalI 位點(diǎn)）；S1/2 用于檢測(cè)PD-1；PCV2F/R 和PD-1F/R 分別為檢測(cè)PCV2和PD-1的熒光定量PCR 引物。引物由上海生物工程股份有限公司合成。

表1 PCR 引物序列Table 1 Primers used in this study

1.4 重組質(zhì)粒pET-28a-PD-1 的構(gòu)建與鑒定

利用柱式動(dòng)物組織總RNA 抽提純化試劑盒提取健康豬舌組織總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用引物P1/2，經(jīng)PCR 擴(kuò)增PD-1全基因。將純化的PCR產(chǎn)物克隆到載體pMD18-T 中并進(jìn)行測(cè)序鑒定。以測(cè)序正確的重組質(zhì)粒為模板，利用PD-1特異性引物P3/4，PCR 擴(kuò)增PD-1胞外域。將純化的PCR 產(chǎn)物與pMD18-T 連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-PD-1，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR 測(cè)序鑒定構(gòu)建是否正確。

利用EcoR I和SalI分別酶切質(zhì)粒pMD18-PD-1和載體pET28-a，將獲得的PD-1胞外域片段與pET-28a 進(jìn)行連接， 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-PD-1，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性單個(gè)菌落并進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.5 重組蛋白exPD-1 的誘導(dǎo)表達(dá)、純化、復(fù)性及鑒定

將IPTG 濃度設(shè)為0.1、0.3、0.5、0.7、1.0 和1.5 mmol·L-1，誘導(dǎo)時(shí)間設(shè)為2、4、6 和8 h，篩選誘導(dǎo)重組蛋白exPD-1 表達(dá)的最佳IPTG 劑量和時(shí)間。通過尿素（0.5 ～ 9 mol·L-1）溶液來確定包涵體最佳的洗滌純化濃度。利用不同濃度的尿素復(fù)性緩沖溶液體系 (7、6、5、4、3、2、1 和0.5 mol·L-1和PBS)進(jìn)行重組蛋白的復(fù)性。SDS-PAGE 電泳檢測(cè)純化產(chǎn)物，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定重組蛋白濃度。

1.6 兔抗exPD-1 血清的制備、效價(jià)的測(cè)定及其特異性的檢測(cè)

首次用純化的exPD-1 與等量弗氏完全佐劑乳化的油劑（按照每只兔體重1 kg 免疫exPD-1 蛋白1 mg）免疫新西蘭兔，2 周后用exPD-1 與等量弗氏不完全佐劑制備的油劑二免。二免后2 周，第3 次免疫，免疫原同二免。三免后1 周，用間接ELISA測(cè)定抗血清效價(jià)。當(dāng)血清效價(jià)達(dá)到1:12 800 時(shí)，心臟采血，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用重組蛋白exPD-1 作為抗原，三免后以分離的兔抗exPD-1 血清作為一抗，HRP 標(biāo)記羊抗兔抗體 （1: 3 000 稀釋）作為二抗，經(jīng)Western Blot檢測(cè)兔抗exPD-1 血清的特異性[13-14]。

1.7 PCV2 感染PK-15 細(xì)胞后PD-1 轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)

將PK-15 細(xì)胞均勻鋪在12 孔培養(yǎng)板并接種PCV2(劑量為5.78 TCID50/0.1 mL)，同時(shí)設(shè)未接種PCV2 的PK-15 細(xì)胞作為陰性對(duì)照。37 ℃吸附1 h 后，收獲接毒組及陰性對(duì)照組的細(xì)胞各一孔并于-80℃凍存。其余各孔均在洗滌后加入2%細(xì)胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24、36、48 和72 h 時(shí)，收獲接毒組和陰性對(duì)照組細(xì)胞，提取各組細(xì)胞的mRNA，通過熒光定量PCR 檢測(cè)PCV2 感染PK-15 細(xì)胞后的PD-1轉(zhuǎn)錄水平[14-15]。

1.8 PD-1受體的檢測(cè)及兔抗exPD-1血清對(duì) PCV2增殖的影響

以PK-15 細(xì)胞總cDNA 作為模板，利用PD-1特異性引物S1/2，PCR 檢測(cè)PK-15 細(xì)胞中的PD-1受體。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min，95 ℃ 45 s，60 ℃ 25 s， 72 ℃ 30 s，共35 個(gè)循環(huán)，終延伸72 ℃ 10 min，最后4 ℃ 10 min。

將12 孔培養(yǎng)板的PK-15 細(xì)胞分為4 組：抗exPD-1 陽性血清組、陰性血清組、PCV2 組和空白對(duì)照組。4 組PK-15 細(xì)胞分別37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)2 h，后用D’Hanks 洗滌3 次?？筫xPD-1 陽性血清組、陰性血清組和PCV2 組分別接種PCV2(劑量為5.78 TCID50/0.1 mL)，空白對(duì)照組添加等量無血清培養(yǎng)液。37 ℃吸附1 h 后棄去病毒液，D’Hanks 洗滌3次，加入細(xì)胞維持液。孵育到12 h 時(shí)，收獲細(xì)胞液，檢測(cè)PCV2 的增殖情況，并通過熒光引物PD1F/R和PCV2F/R 進(jìn)行熒光定量PCR 對(duì)PD-1轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行檢測(cè)[13,15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pET-28a-PD-1 的構(gòu)建與鑒定結(jié)果

以反轉(zhuǎn)錄的豬舌組織cDNA 為模板，利用引物P1/2 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增PD-1全基因。結(jié)果顯示，從豬舌組織中擴(kuò)增出產(chǎn)1 條約為948 bp 的目的條帶，與預(yù)期相符(圖1A)。測(cè)序顯示，所克隆的目的DNA 片段大小為948 bp，與GenBank 中的PD-1全長基因序列對(duì)比，PD-1全基因在634—636 位存在AAG 3 個(gè)連續(xù)堿基缺失外，其余序列與參考序列吻合一致。

以構(gòu)建PD-1全基因重組質(zhì)粒為模板，利用PD-1胞外域特異引物P3/4 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。結(jié)果顯示，擴(kuò)增出1 條約為455 bp 的片段，與預(yù)期一致(圖1B)。測(cè)序結(jié)果顯示，目的片段為455 bp，與克隆的PD-1全基因序列進(jìn)行比對(duì)，同源性為100%，表明獲得的PD-1胞外域基因序列正確。

圖1 PD-1 全基因（A）及胞外域（B）擴(kuò)增結(jié)果Figure 1 Amplification of complete gene of PD-1(A) and extracellular region gene of PD-1 (B)

重組質(zhì)粒pET-28a-PD-1 經(jīng)XhoI 單酶切、電泳出現(xiàn)一條大小約5 824 bp 的帶；經(jīng)EcoR I 和SalI雙酶切后電泳出現(xiàn)2 條帶：其中一條帶為載體質(zhì)粒，約5 369 bp，另一條帶為所克隆的PD-1胞外域基因片段，約455 bp (圖2)，與預(yù)期相符。測(cè)序結(jié)果證實(shí)PD-1基因胞外完全正確地插入到原核表達(dá)載體的插入位點(diǎn)，且讀碼框正確，表明重組質(zhì)粒pET-28a-PD-1構(gòu)建正確。

圖2 重組質(zhì)粒的酶切圖Figure 2 Identification of the recombinant plasmids

2.2 重組蛋白exPD-1 的誘導(dǎo)表達(dá)、純化、復(fù)性及鑒定結(jié)果

篩選優(yōu)化 IPTG 劑量和時(shí)間結(jié)果顯示，在37 ℃、IPTG 為0.5 mmol·L-1時(shí)，誘導(dǎo)時(shí)間8 h，重組蛋白exPD-1 表達(dá)量最高。

利用2～4 mol·L-1尿素溶液進(jìn)行洗滌純化、8 mol·L-1尿素溶液進(jìn)行溶解，采用尿素溶液梯度透析對(duì)重組蛋白進(jìn)行復(fù)性，最后蔗糖濃縮。經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)量，重組蛋白為1.1 mg·mL-1。

SDS-PAGE 結(jié)果顯示，可清晰地可見1 條約20 kDa 的蛋白條，與預(yù)期大小相一致(圖3)。Western Blot 結(jié)果顯示，在約20 kDa 處可見1 條特異性的棕紅色陽性條帶(圖4)，證明成功表達(dá)目的蛋白。

圖3 純化后的重組質(zhì)粒pET-28a-PD-1 的表達(dá)Figure 3 Expression results of pET-28a-PD1 after purification

圖4 兔多抗血清的Western Blot 檢測(cè)Figure 4 The specificity of rabbits polyclonal serum by Western Blot

重組菌破碎后，上清及沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE，沉淀中出現(xiàn)1 條約20 kDa 大小的蛋白，與預(yù)期結(jié)果相符，而上清并未有目的蛋白存在，說明重組蛋白主要以包涵體形式存在。

2.3 兔抗exPD-1 血清的制備、效價(jià)的測(cè)定及其特異性的檢測(cè)結(jié)果

將重組蛋白exPD-1 免疫兔子3 次后，經(jīng)ELISA方法檢測(cè)，兔抗exPD-1血清抗體效價(jià)達(dá)到1:12 800。Western Blot 鑒定，在約為20 kDa 處有1 條特異的蛋白帶，與預(yù)期結(jié)果相符，表明兔抗PD-1 血清特異性良好（圖4）。

2.4 PCV2 感染PK-15 細(xì)胞后的PD-1 轉(zhuǎn)錄變化

PCV2 感染PK-15 細(xì)胞后，分別于0、1、6、12、24、36、48 和72 h 時(shí)收取細(xì)胞。通過試劑盒提取PK-15 細(xì)胞的總RNA 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用引物PD-1F/R 進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)，檢測(cè)PD-1轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果顯示，在PCV2 感染1～48 h 時(shí)，PD-1均為轉(zhuǎn)錄下調(diào)（圖5），表明體外條件下PCV2感染可激活PD-1/PD-L1 信號(hào)通路。

圖5 PCV2 感染PK-15 后PD-1 轉(zhuǎn)錄變化Figure 5 The transcriptional profiles of PD-1 after PK-15 cells infected with PCV2

2.5 PD-1 受體的檢測(cè)結(jié)果及兔抗exPD-1 血清對(duì)PCV2 增殖的影響

利用引物S1/2，對(duì)PK-15 細(xì)胞總RNA 反轉(zhuǎn)錄的cDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增、電泳，出現(xiàn)1 條約377 bp的條帶(圖6)，與預(yù)期大小相符。表明PK-15 細(xì)胞中存在PD-1受體mRNA 的轉(zhuǎn)錄。

圖6 PK-15 細(xì)胞中PD-1 檢測(cè)結(jié)果Figure 6 Detection of PD-1 in PK-15

PCV2 感染12 h 時(shí)，收取各組細(xì)胞，通過熒光引物PD1F/R 和PCV2F/R 進(jìn)行熒光定量PCR 對(duì)PD-1和PCV2進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，當(dāng)PD-1 受體被兔抗exPD-1 血清封閉時(shí)，抗exPD-1 陽性血清組PD-1轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)(P＜ 0.01) (圖7)，而陰性血清組、PCV2 組與空白對(duì)照組無明顯差異。而且，當(dāng)PD-1 受體被封閉時(shí)，與陰性血清處理組及正常PCV2 組相比，抗PD-1 血清組PCV2 增殖明顯被抑制(P＜ 0.01) (圖8)。

圖7 PD-1 受體阻斷試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果Figure 7 Detection results of the PD-1 blocking test

圖8 PD-1 受體阻斷時(shí)PCV2 的增殖情況Figure 8 Detection of PCV2 proliferation in the PD-1 blocking test

3 討論與結(jié)論

本研究從豬舌組織中PCR 擴(kuò)增獲得了PD-1全基因序列，與Peng 等[16]所獲全基因進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，所得PD-1全基因在634—636 位存在AAG 3 個(gè)連續(xù)堿基的缺失，但不影響蛋白的表達(dá)；以PD-1全基因?yàn)槟０?，PCR 擴(kuò)增獲得其胞外域，通過構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a 進(jìn)行胞外域結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)，通過對(duì)其最佳誘導(dǎo)時(shí)間、IPTG 最佳誘導(dǎo)濃度，以及純化和復(fù)性條件的摸索最終獲得重組蛋白。最佳誘導(dǎo)條件為，在37 ℃條件下，用0.5 mmol·L-1IPTG 誘導(dǎo)8 h 時(shí)，目的蛋白的產(chǎn)量最高?？扇苄栽囼?yàn)顯示目的蛋白為包涵體，且2～4 mol·L-1尿素溶液對(duì)包涵體具有較好的洗滌效果。利用8 mol·L-1尿素溶液使包涵體蛋白完全變性溶解后，采用尿素溶液梯度透析進(jìn)行蛋白復(fù)性，然后蔗糖濃縮，最終得到濃度為1.1 mg·mL-1的重組蛋白。本研究采用尿素純化及梯度透析復(fù)性的方法，操作簡便，價(jià)格便宜，同時(shí)在純化過程中目的蛋白損耗較少，除雜徹底。并將獲得的重組蛋白exPD-1 經(jīng)3 次免疫新西蘭大白兔制備抗exPD-1 血清。

PD-1 作為一種具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用的CD28 家族的協(xié)同刺激受體分子，廣泛表達(dá)于免疫細(xì)胞和相關(guān)組織細(xì)胞的胞膜上[17]。前期研究表明，在某些病毒感染過程中，病原可通過影響PD-1/PD-L1 信號(hào)通路的激活與抑制來誘發(fā)免疫抑制，以此來促進(jìn)病毒躲避宿主機(jī)體免疫進(jìn)而造成持續(xù)感染；Peng 等[16]在研究PD-1 的表達(dá)與豬病毒持續(xù)感染的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，PD-1 能夠抑制IFN-γ 和IL-2 的分泌，使其分別下降64%和53%，且豬PD-1/PD-L1 交互作用表現(xiàn)出負(fù)調(diào)節(jié)的模式；Yue 等[18]在探究PD-1 信號(hào)通路與CSFV 感染免疫應(yīng)答損害的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)豬感染CSFV 后，豬外周血淋巴細(xì)胞中除PD-L1轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)外，PD-1、IFN-γ 及IL-2 表達(dá)無明顯變化；多項(xiàng)研究表明PD-1/PD-L1 信號(hào)通路在介導(dǎo)豬的免疫抑制和持續(xù)性感染中或許發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[16,18-20]。本研究通過在體外利用PCV2 感染PK-15（非免疫細(xì)胞）細(xì)胞，初步確定了在體外PCV2感染可引起PD-1轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，證實(shí)了體外條件下PCV2 感染可激活PD-1/PD-L1 信號(hào)通路。另外，同樣在體外條件下，當(dāng)PD-1/PD-L1 通路被封閉時(shí)，可抑制PCV2增殖。PD-Ls 的過量表達(dá)是PMWS 引起免疫抑制的重要分子機(jī)制，通過研究PD-1 對(duì)PCV2 感染后的免疫調(diào)節(jié)，為進(jìn)一步探究PCV2 的免疫抑制機(jī)理及抗病毒免疫提供了新方法和新思路，為研究PCV2的新型免疫調(diào)節(jié)佐劑和致病機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，對(duì)PCV2 相關(guān)疾病的治療和防控、開發(fā)新型細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)佐劑等具有一定的市場應(yīng)用潛在價(jià)值。然而，PCV2 感染時(shí)如何激活PD-1/PD-L1 通路，還有待深入探究。