白瑩雪，李 楊，祝 寧，張家興，任俊達(dá)*，尚巧霞*

(1. 北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2. 北京市昌平區(qū)十三陵林場(chǎng)，北京102200；3. 北京市昌平區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，北京 102200)

草莓是薔薇科（Rosaceae）草莓屬（Fragaria）多年生宿根草本植物[1]。草莓病毒在世界各草莓栽培區(qū)廣泛分布，由于草莓生產(chǎn)主要依靠匍匐莖進(jìn)行無(wú)性繁殖，而病毒可隨無(wú)性繁殖材料和傳毒介體傳播擴(kuò)散，故嚴(yán)重影響草莓的產(chǎn)量和品質(zhì)，這也成為了草莓生產(chǎn)中最主要的威脅[2-6]。草莓斑駁病毒（SMoV）是伴生豇豆病毒科（Secoviridae）溫州蜜柑矮縮病毒屬（Sadwavirus）的未確定種，是一種侵染草莓的潛隱性RNA 病毒。病毒粒子為球形，通常存在于植株葉片的表皮細(xì)胞、薄壁細(xì)胞和韌皮部細(xì)胞。1938 年第一次在英格蘭鳳梨草莓上發(fā)現(xiàn)，目前在世界各草莓栽培區(qū)均有分布[7-9]。在RNA 病毒檢測(cè)過(guò)程中，獲得高質(zhì)量的樣本總RNA 是一切試驗(yàn)的基礎(chǔ)。因此，建立簡(jiǎn)便、有效的草莓葉片保存方法，對(duì)草莓斑駁病毒的檢測(cè)結(jié)果影響巨大，對(duì)該病毒的科學(xué)研究和有效防控也具有重要意義。目前，對(duì)于草莓斑駁病毒的檢測(cè)研究仍以RT-PCR 技術(shù)為主，其靈敏度高且操作較簡(jiǎn)便[10-14]。應(yīng)用RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)草莓SMoV 時(shí)發(fā)現(xiàn)，若不及時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，所提取的總RNA 容易降解[15]。若樣本保存不當(dāng)，PCR 檢測(cè)效果顯著降低，所以病樣材料保存質(zhì)量的高低是開(kāi)展分子檢測(cè)的基礎(chǔ)。如果條件允許，要盡量選擇新鮮的植物組織，病毒RNA 質(zhì)量相對(duì)較高。但是在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，受限條件較多。有時(shí)病樣采集地區(qū)偏遠(yuǎn)，需要3～5 d 的物流運(yùn)輸過(guò)程，再加之天氣炎熱等原因，很難保證試驗(yàn)前的樣本仍然具有高質(zhì)量的RNA，因此，篩選簡(jiǎn)便可行的樣品保存方法十分重要?，F(xiàn)有研究多關(guān)注于不同保存方法對(duì)植物基因組RNA 提取效果的影響。不同干燥保存條件適用的植物種類和植物部位不同[16-22]。干燥保存方式大多以壓干、硅膠干燥、微波干燥、烘干和自然晾干為主，但不同保存方法對(duì)植物組織中病毒的PCR 檢測(cè)效果有何影響尚鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究先采用不同干燥方法保存SMoV 陽(yáng)性草莓葉片，包括自然風(fēng)干、硅膠干燥和氧化鈣（CaO）干燥保存方法，篩選出最佳干燥保存技術(shù)后，再與幾種常見(jiàn)的低溫保存方法比較，探究最適宜的保存條件，確立一種方便可行的草莓葉片樣本保存方式，以期達(dá)到最好的病毒檢測(cè)效果，為植物病毒檢測(cè)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料：樣本采集于北京市昌平區(qū)草莓種植棚內(nèi)，經(jīng)RT-PCR 檢測(cè)感染SMoV 的草莓葉片放置于冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑： EASY spin 植物RNA 快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）、CaO（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純）、變色硅膠（青島海洋化工有限公司）、2×TaqPCR Mix（北京愛(ài)博森生物科技有限公司）和瓊脂糖（北京愛(ài)博森生物科技有限公司）。

1.2 不同方法保存草莓葉片樣本

將經(jīng)過(guò)RT-PCR 檢測(cè)為SMoV 陽(yáng)性草莓葉片平均分為9 份，每3 份為1 個(gè)處理。處理1：采用自然風(fēng)干法保存[19]；處理2: 將樣本放置于含有0.5 g硅膠顆粒的密閉容器中保存[19]；處理3：將樣本放置于下部鋪有0.5 g CaO 粉末的密閉容器中保存。在室溫條件下干燥處理1、3 和7 d。比較各處理樣本提取的總RNA 濃度、反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 濃度以及RT-PCR 檢測(cè)效果，然后從中再選取RNA 提取效果最好的干燥方法與其他5 種最常見(jiàn)保存方式進(jìn)行比較。這些5 種處理方法分別為：將等量葉片樣本放置在25 ℃室溫下自然晾干保存；將樣本放置于烘箱中，50 ℃干燥2 min 后，再25 ℃室溫保存；將樣本存放于4 ℃冰箱中保存；將樣本存放于-20 ℃冰箱中保存；將樣本存放于-80 ℃冰箱中保存以及采用上述最佳干燥方法保存。處理時(shí)間分別為5、10、15、20 和30 d。

1.3 RNA 提取

按照EASY spin 植物RNA 快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）說(shuō)明書(shū)提取。

1.4 RNA 濃度測(cè)定

按照1.3 方法提取草莓樣本總RNA，使用Thermo NanoDrop 2000微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定每份樣品總RNA 濃度，計(jì)算3 次重復(fù)的平均值。

1.5 RT-PCR 檢測(cè)

反轉(zhuǎn)錄：將11 μL DEPC 水、1 μL 反向引物（SMoV6732R：5'-CAGGTTACTCTAGTACGTCAC CAC-3'）、2 μL dNTP 和1.5 μL RNA 混勻后，65 ℃水浴5 min，冰浴5 min，之后再分別加入4 μL M-MLV Buffer，0.5 μL M-MLVRT、0.5 μL Recombinant RNase Inhibitor，渦旋離心后，經(jīng)過(guò)42 ℃ 1 h、和72 ℃ 15 min，得到cDNA。使用Thermo NanoDrop 2000 微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定cDNA 濃度，記錄3 次重復(fù)平均值。

PCR 擴(kuò)增：采用正向引物（SMoV6126F：5'-GGTTTGAAGGAATAGGGTTGTTG-3')與反向引物（ SMoV6732R: 5'-CAGGTTACTCTAGTACGTCA CCAC-3'）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL：引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL；2×TaqPCR Mix 12.5 μL；cDNA 2 μL，加ddH2O 水至25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。取5 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種干燥方法保存效果分析

SMoV 陽(yáng)性草莓葉片經(jīng)不同干燥保存條件保存1、3 和7 d 后，進(jìn)行樣本總RNA 提取，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈，并使用Thermo NanoDrop 2000微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度。將不同方法3 次重復(fù)所測(cè)得總RNA 濃度和反轉(zhuǎn)錄所得cDNA 濃度取平均值，結(jié)果如圖1 所示。由圖1(a)可以看出，在1、3 和7 d 時(shí)自然風(fēng)干保存葉片總RNA 濃度分別為297.8、229.0 和133.9 ng·μL-1；硅膠干燥保存葉片總RNA 濃度分別為311.7、242.3 和164.7 ng·μL-1；CaO 干燥保存葉片總RNA 濃度分別為457.1、432.8和422.8 ng·μL-1。由圖1(b)可以看出，在1、3 和7 d時(shí)自然風(fēng)干保存葉片cDNA濃度分別為408.0、395.2和349.8 ng·μL-1；硅膠干燥保存葉片cDNA 濃度分別407.2、398.5 和382.8 ng·μL-1；CaO 干燥保存葉片cDNA 濃度分別為513.5、495.1 和479.2 ng·μL-1。由此可知，CaO 干燥保存條件效果最好且較穩(wěn)定，RNA 濃度和cDNA 濃度均明顯高于其他兩種處理，且隨著保存天數(shù)的增加，RNA 和cDNA 濃度變化不大。另外兩種方法中，硅膠干燥保存效果次之，自然風(fēng)干保存效果最差。

圖1 不同干燥保存方法提取SMoV 陽(yáng)性草莓葉片 RNA 和反轉(zhuǎn)錄cDNA 濃度的變化Figure 1 Variations of RNA and reverse transcription cDNA concentrations in SMoV positive strawberry leaves extracted by different drying treatments

將3 種干燥處理后提取的總RNA 進(jìn)行特異性反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。RT-PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)（圖2），從CaO 干燥處理后的草莓葉片樣品提取的總RNA均可擴(kuò)增出清晰的目的條帶。隨著保存時(shí)間的增加，從自然風(fēng)干和硅膠干燥處理的樣品擴(kuò)增條帶亮度逐漸變暗甚至消失。因此，CaO 干燥是保存草莓葉片提取總RNA 的最佳方法。

圖2 3 種葉片干燥保存方法對(duì)SMoV RT-PCR 檢測(cè)效果比較Figure 2 Comparison of SMoV RT-PCR detection effects among three methods of leaf dry preservation

2.2 RT-PCR檢測(cè)不同方法保存草莓葉片SMoV的效果比較

上述試驗(yàn)證實(shí)，CaO 保存為其中最好的干燥保存方法。為了將它與幾種最常見(jiàn)的葉片保存方式進(jìn)行比較，進(jìn)行了25 ℃室溫保存、烘箱干燥、CaO干燥、4 ℃、-20 ℃和-80 ℃這6 種不同處理下SMoV 的RT-PCR 檢測(cè)分析。結(jié)果（圖3）表明，隨著時(shí)間的推移，即使到了第30 天，CaO 干燥保存后的葉片依舊能擴(kuò)增出清晰的目的條帶。而其他幾種方法擴(kuò)增條帶較暗淡，擴(kuò)增產(chǎn)物量少甚至逐漸消失。因此，CaO 干燥保存效果最佳且穩(wěn)定。

圖3 不同方法保存草莓葉片對(duì)SMoV RT-PCR 檢測(cè)效果比較Figure 3 Comparison of SMoV RT-PCR detection effects in strawberry leaves preserved by different methods

3 討論與結(jié)論

草莓成熟葉片中含有大量多糖和多酚類物質(zhì)[23]，這些雜質(zhì)含量高而難以獲得高質(zhì)量的RNA。植物多糖能夠抑制多種生物酶的活性且理化性質(zhì)與RNA 接近，多糖還能與核酸、蛋白質(zhì)、多酚類物質(zhì)結(jié)合，是影響RNA 提取的重要因素[24-25]。多糖相對(duì)較易清除，目前已有多種清除效果顯著的方法，而多酚是植物抵御逆境脅迫產(chǎn)生的重要次級(jí)代謝產(chǎn)物，因具備較強(qiáng)氧化和絡(luò)合能力而不易被有效清除。在RNA 提取過(guò)程中，應(yīng)該重點(diǎn)排除多酚對(duì)RNA 提取試驗(yàn)的影響。本試驗(yàn)利用試劑盒提取草莓葉片RNA 的效果較好，但后續(xù)試驗(yàn)還應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)化，合理使用多酚螯合劑等方式，以獲得更高質(zhì)量的RNA。

樣品保存是病毒檢測(cè)的物質(zhì)基礎(chǔ)，目前多采用新鮮或冷凍材料。如需野外遠(yuǎn)距離運(yùn)輸，新鮮葉片容易萎焉甚至腐爛，樣本RNA 易降解。而攜帶液氮、干冰或冰袋凍存植物材料會(huì)增加檢測(cè)成本。另外，離體草莓葉片中的RNA 病毒極易受RNA 酶的作用而降解[26]。因此，研究感病植物樣本的有效保存方法具有重要意義[27]。

PCR 擴(kuò)增是分子生物學(xué)研究的重要手段，靈敏度高且方便快捷，但病毒RNA 不穩(wěn)定、易降解，且草莓植株中病毒含量極低。野外采集樣本常受客觀條件限制，不能在現(xiàn)場(chǎng)及時(shí)進(jìn)行病毒檢測(cè)，樣品送檢過(guò)程時(shí)間較長(zhǎng)，甚至需要長(zhǎng)距離物流運(yùn)輸過(guò)程，此類情況均涉及樣品保存時(shí)間長(zhǎng)短問(wèn)題。課題組在多年草莓病毒檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，普通保存方法無(wú)法保證長(zhǎng)期保存離體草莓帶毒葉片的質(zhì)量，SMoV 檢測(cè)效率較低。因此，研究簡(jiǎn)便、快捷和高效的草莓樣本保存方法對(duì)后續(xù)病毒檢測(cè)具有重要意義。

不同保存方法對(duì)寄主植物組織中病毒RNA 提取和RT-PCR 檢測(cè)效果的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)比較分析了不同保存方法對(duì)基因組RNA 濃度和反轉(zhuǎn)錄cDNA 濃度的影響，可以確定不同方法保存的試驗(yàn)材料具有不同研究層次的適用性。研究結(jié)果表明，CaO 干燥保存草莓葉片對(duì)RT-PCR 檢測(cè)SMoV效果最好，原因可能是密閉環(huán)境下CaO 與草莓葉片呼吸作用釋放出的水分相結(jié)合，達(dá)到脫水效果。沒(méi)有水分的存在，RNA 酶無(wú)法水解葉片中的RNA，從而抑制葉片中RNA 的降解。長(zhǎng)距離野外采樣可采用CaO 干燥保存樣品，此方法可明顯提高保存效果并降低保存成本，本研究結(jié)果不僅可以提高草莓斑駁病毒的PCR 檢測(cè)效率，還對(duì)病毒資源的長(zhǎng)期有效保存具有重要意義。

CaO 干燥保存與其他幾種常見(jiàn)保存方式相比，RT-PCR 檢測(cè)SMoV 效果最好且操作簡(jiǎn)單、成本低。此研究適用于高效、便捷檢測(cè)草莓葉片中的SMoV，可廣泛應(yīng)用于田間大量草莓樣本的采集，提高感病草莓病毒檢測(cè)效率。