李 霞，黎毛毛，劉 進(jìn)，周慧穎，胡佳曉，王曉玲，余麗琴

(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所/江西省農(nóng)作物種質(zhì)資源研究中心，南昌 330200)

作物種質(zhì)資源中蘊(yùn)藏著非常豐富的可利用基因，是促進(jìn)農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新和種業(yè)發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，也是保障國家糧食安全的戰(zhàn)略性資源[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球現(xiàn)擁有1 750 多座種質(zhì)庫，累計(jì)收集和儲藏的種質(zhì)資源達(dá)740 萬余份[3]。隨著種質(zhì)資源種類與數(shù)量的日益增長，種質(zhì)繁殖更新問題亦提上日程。種質(zhì)安全保存的核心問題是必須要維持其遺傳完整性。種子是長期保存種質(zhì)資源最常用和最經(jīng)濟(jì)的方法之一，但隨著保存時(shí)間的延長，種子會不可避免地發(fā)生老化，即發(fā)芽率降低的過程[4]，如果降低到關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)時(shí)不及時(shí)進(jìn)行繁殖更新，就會引起種質(zhì)原有群體遺傳完整性的降低。在種質(zhì)繁殖更新過程中，合適的群體量也是必須考慮的因素[5]，適宜的繁殖群體量不僅對種質(zhì)資源遺傳完整性的保持有益，而且也益于繁殖更新工作量和成本的降低[6-7]。關(guān)于繁殖更新群體大小對種質(zhì)資源遺傳完整性的研究已在多種作物中相繼開展[5-16]，不同物種合適的繁殖更新群體量大小間差異較大，同一物種不同品種間繁殖更新群體量亦存在差異，一般野生種質(zhì)高于普通種質(zhì)，地方品種高于育成品種。對作物適宜的繁殖更新發(fā)芽率臨界值也已有一些研究，不同作物間發(fā)芽率臨界值差異較大，多數(shù)集中在70%以上[17-20]，少數(shù)在20% ～ 40%之間[21-23]。

水稻種質(zhì)資源是開展水稻研究的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，收集和保存稻種資源是發(fā)掘和利用有重要價(jià)值的稻種資源的首要前提[24-25]。目前，對水稻種質(zhì)繁殖更新群體大小和發(fā)芽臨界值的研究多以種子生活力快速降低拐點(diǎn)作為其繁殖更新發(fā)芽率臨界值[1,17]，還鮮見從分子水平開展相關(guān)研究的報(bào)道。我國國家長期種子庫保存的稻種資源中的71.38%為地方品種[24]，地方品種資源的多態(tài)性指數(shù)顯著高于育成品種和國外引進(jìn)品種，育種價(jià)值較高[26]。然而這些地方品種入庫后，什么時(shí)候進(jìn)行繁殖更新、繁殖更新的群體大小是多少，目前還比較缺少研究。本研究以地方水稻品種香谷為試驗(yàn)材料，通過表型性狀觀察和SSR 分子標(biāo)記分析，探討了香谷種子老化處理后不同繁殖群體量和發(fā)芽率水平對其遺傳完整性的影響，以期為種質(zhì)庫中種質(zhì)資源繁殖更新時(shí)群體的大小及發(fā)芽率臨界值的制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供的地方水稻品種香谷，香谷的遺傳多樣性比較豐富，主要表型特點(diǎn)為中熟麻殼，還有少量的遲熟長芒和早熟黃殼類型。供試種子是2016 年從200 株繁殖群體混合脫粒后的種子中隨機(jī)取樣獲得的，種子含水量小于14%，儲藏于室溫干燥器中。

1.2 方法

1.2.1 人工老化處理 試驗(yàn)于2017年5月在江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所進(jìn)行，根據(jù)前期預(yù)備試驗(yàn)的結(jié)果，將發(fā)芽率≥90%的香谷種子在高溫、高濕條件下（RH 85%，T 43 ℃）老化處理9、12、14 和16 d，獲得發(fā)芽率為80% ～ 85%、60% ～ 70%、50%和發(fā)芽率≤30%的種子。為使所有發(fā)芽率梯度處理同時(shí)結(jié)束老化，采用倒序法進(jìn)行老化處理，即老化時(shí)間最長的種子先行處理，老化時(shí)間最短的種子最后處理，以發(fā)芽率≥90%的種子為對照。其中水稻種子入庫發(fā)芽率最低要求為90%，水稻生產(chǎn)用的種子發(fā)芽率最低要求為80%，其余發(fā)芽率依次降低20%。

1.2.2 田間試驗(yàn) 將老化處理后的種子在25 ℃恒溫箱內(nèi)平衡2 d 水分后連同對照一起浸種、催芽、播種、移栽，每個(gè)處理種植一個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)種植200 株，單本栽插，行株距16 cm×20 cm，肥水管理與大田生產(chǎn)相同。分蘗盛期每個(gè)小區(qū)按單株順序編號分別取葉片放置于-70℃超低溫冰箱里保存?zhèn)溆?；種子成熟期對各單株的主要表型性狀進(jìn)行觀察記載并收獲種子。

1.2.3 SSR 標(biāo)記分析 從水稻基因數(shù)據(jù)庫中選擇650 對均勻分布于水稻12 條染色體上的SSR 引物，委托鼎國生物有限公司合成。利用合成的SSR 引物對發(fā)芽率≥ 90%的200 個(gè)單株群體進(jìn)行DNA 檢測，篩選存在多態(tài)性的引物；然后再利用篩選出的多態(tài)性引物分別對發(fā)芽率為80% ～ 85%、60% ～ 70%、50%和≤ 30%的群體進(jìn)行標(biāo)記檢測。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 使用POPGENE VERSION 1.31軟件進(jìn)行遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的分析，采用SPSS13.0 軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)芽梯度和繁殖群體大小對香谷表型遺傳完整性的影響

隨著人工老化時(shí)間的延長，香谷種子活力與發(fā)芽率逐漸下降。對3 個(gè)不同發(fā)芽梯度下不同繁殖群體中遲熟長芒和早熟黃殼植株數(shù)的調(diào)查情況見表1。由表1 可知，繁殖群體大小對遲熟長芒和早熟黃殼單株數(shù)的出現(xiàn)頻率存在明顯影響。不同發(fā)芽梯度下，遲熟長芒和早熟黃殼出現(xiàn)1 株的最小繁殖群體為60 株；遲熟長芒和早熟黃殼出現(xiàn)2 株的最小繁殖群體為140 株。發(fā)芽率≥90%、80%～85%時(shí)，遲熟長芒和早熟黃殼出現(xiàn)1 株的群體量為40 株，出現(xiàn)2株的群體量為80 株，出現(xiàn)3 株的群體量為100 株。發(fā)芽率60%～70%及50%時(shí)，遲熟長芒和早熟黃殼出現(xiàn)1 株的群體量為60 株，出現(xiàn)2 株的群體量為80 株，出現(xiàn)3 株的群體量為160 株。發(fā)芽率≤ 30%時(shí)，遲熟長芒和早熟黃殼出現(xiàn)1 株的群體量為60 株，出現(xiàn)2株的群體量為140 株，出現(xiàn)3 株的群體量為200 株。分析表明，為了維持地方水稻品種的遺傳多樣性，繁殖更新群體量為60～140 株，發(fā)芽率越低，繁殖群體量越大；反之，發(fā)芽率越高，繁殖群體量越小。

表1 不同發(fā)芽梯度下香谷種群繁殖群體大小對表型遺傳完整性的影響Table 1 Effects of regeneration population size on phenotypic genetic integrity of Xianggu with different germination gradients

2.2 不同發(fā)芽率水平及繁殖群體的SSR 分析

對研究表型性狀的3 個(gè)發(fā)芽梯度處理的種質(zhì)進(jìn)行SSR 標(biāo)記分析， 650 對SSR 引物對發(fā)芽率≥90%含200 個(gè)單株的群體進(jìn)行DNA 檢測，共篩選出存在多態(tài)性SSR 引物16 對；利用它們分別對發(fā)芽率為60%～70%和≤30%的群體各200 個(gè)單株進(jìn)行DNA 檢測。不同發(fā)芽水平和繁殖群體下，16 對多態(tài)性SSR 引物出現(xiàn)的次數(shù)與所占比率見表2。

由表2 可知，隨著繁殖群體量增加，不同發(fā)芽率水平下香谷的多態(tài)性引物數(shù)和出現(xiàn)頻率呈上升趨勢。繁殖群體量為50 株和100 株時(shí)，3 種不同發(fā)芽梯度下群體的多態(tài)性水平都較低，當(dāng)繁殖群體量達(dá)到200株時(shí)，3 個(gè)不同發(fā)芽梯度下群體的多態(tài)性水平都達(dá)到比較高的水平，多態(tài)性引物數(shù)分別為16 對、14 對和8 對所占比率分別為100%、87.5%和50%。在同一發(fā)芽率水平下，隨著繁殖群體的擴(kuò)大，多態(tài)性引物數(shù)及多態(tài)性引物出現(xiàn)的次數(shù)均表現(xiàn)增加趨勢。發(fā)芽率≤30%時(shí)，隨著繁殖群體量增加，群體多態(tài)性增長較慢，繁殖群體量達(dá)200 株時(shí)，多態(tài)性引物數(shù)及其出現(xiàn)次數(shù)和所占比率仍較低，群體多態(tài)性水平較低；發(fā)芽率在60%～70%和≥90%兩個(gè)水平下，隨著繁殖群體擴(kuò)大，群體多態(tài)性引物數(shù)及其出現(xiàn)次數(shù)都明顯增加，群體多態(tài)性水平較高。分析表明，較低的繁殖群體量不利于香谷群體多態(tài)性的保持，繁殖群體擴(kuò)大到200 株時(shí)，香谷群體多態(tài)性引物個(gè)數(shù)及出現(xiàn)頻率均更高，更利于保證其種質(zhì)遺傳完整性。

表2 不同發(fā)芽率水平及繁殖群體的SSR 分析Table 2 SSR analysis on populations with different levels of germination rates and different sizes

2.3 不同發(fā)芽率水平的遺傳完整性鑒定

利用篩選出的多態(tài)性SSR 標(biāo)記對5 個(gè)不同發(fā)芽梯度群體進(jìn)行標(biāo)記檢測（圖1）。對照和各處理擴(kuò)增出的等位基因數(shù)均為 35 個(gè)，平均每個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)均為2.19 個(gè)；80% ～ 85%、60% ～ 70%、50%及≤30%的處理擴(kuò)增出的多態(tài)等位基因數(shù)分別為35個(gè)、33 個(gè)、29 個(gè)和25 個(gè)，多態(tài)性等位基因數(shù)隨發(fā)芽率降低而下降。從表3 可以看出，若將發(fā)芽率≥90%，對照群體的多態(tài)性條帶百分率記為100%，發(fā)芽率為80% ～ 85%、60% ～ 70%、50%及≤30%群體的多態(tài)性條帶百分率分別對應(yīng)為100%、94.28%、82.86%和71.43%（表3）。分析認(rèn)為，地方水稻品種香谷在不同發(fā)芽梯度下遺傳完整性存在顯著差異，隨著發(fā)芽率降低，群體的多態(tài)性等位基因數(shù)和多態(tài)性條帶百分率呈逐漸下降的趨勢；當(dāng)發(fā)芽率降為50%時(shí)，多態(tài)性等位基因數(shù)和多態(tài)性條帶百分率迅速下降。因此，當(dāng)發(fā)芽率下降到60% ～ 70%時(shí)，應(yīng)及時(shí)對香谷種質(zhì)進(jìn)行繁殖更新。

圖1 引物RM154 和RM6334 對香谷群體部分材料的擴(kuò)增結(jié)果Figure 1 Amplified results by primers RM154 and RM6334 to part marterials of Xianggu population

表3 香谷5 個(gè)發(fā)芽率水平SSR 分析的遺傳變異Table 3 Genetic variation of five germination rate levels in Xianggu by SSR analysis

應(yīng)用SSR標(biāo)記對香谷5個(gè)不同發(fā)芽率水平群體的遺傳多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果（表4）表明，對照群體的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、基因多樣性和香農(nóng)指數(shù)均為最高，分別為2.187 5 ± 0.447 2、1.081 6 ±0.110 0、0.580 8 ± 0.290 9 和0.147 7 ± 0.010 7。與對照相比，發(fā)芽率80% ～ 85%、60% ～ 70%、50%及≤30%群體的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、基因多樣性和香農(nóng)指數(shù)的數(shù)值都有所下降，各群體這些遺傳多樣性參數(shù)值均呈降序排列。發(fā)芽率為60% ～ 70%的群體除香農(nóng)指數(shù)與對照達(dá)到了顯著差異外，等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、基因多樣性指數(shù)與對照差異不顯著；發(fā)芽率低于60%（50%與≤30%）群體的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、基因多樣性指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)均與對照呈極顯著差異。分析認(rèn)為，發(fā)芽率大于80%以上時(shí)種質(zhì)群體遺傳多樣性仍較好，當(dāng)發(fā)芽率降至50%及以下時(shí)，等位基因數(shù)、有效等位基因、基因多樣性指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)均快速下降，初步推測維持地方水稻種質(zhì)遺傳多樣性和遺傳完整性的繁殖更新臨界發(fā)芽率為60% ～ 70%。

表4 SSR 標(biāo)記對香谷5 個(gè)不同發(fā)芽率水平的遺傳多樣性分析Table 4 Genetic diversity analysis of 5 populations with different germination rates by SSR markers

3 討論與結(jié)論

繁殖群體量是影響作物種質(zhì)資源遺傳完整性的重要因素之一。從理論上講，繁殖群體大，遺傳漂變的可能性就愈小，越能保證種質(zhì)資源的遺傳完整性。但在實(shí)際操作中，適宜的繁殖群體量是必須要考慮的因素[5,27]。形態(tài)標(biāo)記具有簡單直觀的優(yōu)點(diǎn)，因此常被作為資源鑒定與育種材料選擇的主要手段之一[28]。香谷的遺傳多樣性比較豐富，主要特征特性為中熟、麻殼，部分有短芒，遲熟長芒和早熟黃殼的類型所占比例很少；如果繁殖后代仍有遲熟長芒和早熟黃殼株系，說明低頻率基因得到保持，以少數(shù)類型的遲熟長芒和早熟黃殼性狀作為形態(tài)標(biāo)記可以從一定程度上說明香谷遺傳完整性的保持水平。一般來說，種子發(fā)芽率下降會引起部分表型性狀的類型及相關(guān)強(qiáng)度發(fā)生改變[28]。本研究表明，當(dāng)發(fā)芽率低于30%時(shí)，繁殖群體量低于40 株的群體中未發(fā)現(xiàn)遲熟長芒和早熟黃殼的植株；當(dāng)繁殖群體量為60 株時(shí)，3 個(gè)發(fā)芽梯度對應(yīng)的群體都至少發(fā)現(xiàn)有一株遲熟長芒和早熟黃殼的植株。因此，從形態(tài)指標(biāo)看，繁殖群體量在60 株以上即可保持香谷的遺傳完整性；當(dāng)繁殖群體超過140 株時(shí)，出現(xiàn)2 株及以上形態(tài)標(biāo)記植株，更能保障香谷的遺傳完整性。由于形態(tài)標(biāo)記受環(huán)境影響比較大，僅通過形態(tài)標(biāo)記法可能不能充分代表群體的遺傳完整性。為提出論據(jù)更充分、更合適的繁殖更新群體量，特結(jié)合分子標(biāo)記方法進(jìn)一步分析繁殖群體大小與香谷遺傳完整性的關(guān)系。本研究利用檢測出來的16 對SSR 多態(tài)性引物在不同發(fā)芽率（≥90%、60% ～ 70%和 ≤30%）下分別設(shè)置不同繁殖群體量（50、100、150和200）對香谷開展遺傳多樣性分析，結(jié)果表明繁殖群體量需要擴(kuò)大到200 株才更能保持香谷的遺傳完整性，這與王述民等[29]基于統(tǒng)計(jì)學(xué)和控制取樣誤差頻率提出水稻品種適宜群體量不低于150 株的觀點(diǎn)相吻合。

種子的發(fā)芽率隨著儲藏時(shí)間的延長而降低，低發(fā)芽率種質(zhì)資源更新后往往會引起種質(zhì)遺傳完整性的改變，主要原因是低發(fā)芽率會引起染色體改變、基因組DAN 損傷、部分DNA 片段消失、rRNA 的降減等[30-32]。許多研究已發(fā)現(xiàn)發(fā)芽率的降低會引起群體內(nèi)遺傳多樣性下降，群體內(nèi)的部分等位基因可能會減少或丟失，進(jìn)而導(dǎo)致種質(zhì)資源遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[15-16,18,21,27,33-35]。 為了有效維持種質(zhì)庫種質(zhì)資源的遺傳完整性，就必須在種子發(fā)芽率降低到會引起變異的發(fā)芽率臨界值時(shí)對種質(zhì)進(jìn)行繁種更新。目前，國內(nèi)外將發(fā)芽率50% ～ 85% 作為種質(zhì)庫繁殖更新的標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)AO 推薦將發(fā)芽率65% ～ 85%作為繁殖更新臨界值，印度、英國和美國分別為75%、70%和50%[1,11,17]。對入庫水稻的生活力進(jìn)行檢測表明，稻種資源發(fā)芽率隨儲藏時(shí)間延長呈下降趨勢, 不同儲藏條件、不同水稻類型品種安全貯藏年限差異很大[36-38]。盧新雄等[17]研究表明，水稻種子生活力快速下降的發(fā)芽率平均值為73.74%，并將此作為水稻種子繁殖更新的發(fā)芽率標(biāo)準(zhǔn)下限。本研究對香谷種質(zhì)5 個(gè)不同發(fā)芽率水平的SSR 分析結(jié)果表明，香谷種質(zhì)的各遺傳多樣性參數(shù)值都隨發(fā)芽率水平的降低而降低，本研究中當(dāng)香谷發(fā)芽率為60% ～ 70%時(shí)，唯有香農(nóng)指數(shù)與對照達(dá)到了顯著差異，發(fā)芽率低于60%（50%與≤30%）時(shí)，群體的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、基因多樣性和香農(nóng)指數(shù)均與對照達(dá)到極顯著差異。另外， 60% ～ 70%發(fā)芽率條件下香谷群體多態(tài)性百分率達(dá)94.28%，可以保持較高水平的遺傳多樣性。因此，發(fā)芽率60% ～ 70%可作為地方水稻品種香谷繁殖更新的臨界值。

通過農(nóng)藝性狀觀察與SSR 分子標(biāo)記方法分析表明地方水稻香谷合適的繁殖更新群體量為200株；地方水稻香谷存儲種子的遺傳完整性隨著種子的發(fā)芽率降低而下降，當(dāng)發(fā)芽率小于60%時(shí)，種子的遺傳完整性隨著發(fā)芽率的降低而迅速下降，且達(dá)極顯著水平。因此，當(dāng)檢測到種子的發(fā)芽率接近60%時(shí)，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行繁殖更新。這一研究結(jié)果為種質(zhì)庫中地方水稻品種繁殖更新適宜群體量和發(fā)芽率臨界值的制定提供科學(xué)參考。